張瑞娟，楊致榮

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生院，山西太谷030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西太谷030801）

硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

張瑞娟1，2，楊致榮3

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生院，山西太谷030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西太谷030801）

氮作為一種限制農(nóng)作物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素在植物的生長和發(fā)育過程中起著極其重要的作用。綜述了硝酸鹽調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中各基因家族及其相互關(guān)系，展望了植物硝酸鹽調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的未來研究方向，這可為未來植物硝酸鹽吸收、運輸、儲存及再利用等的研究和氮素高效利用分子育種提供借鑒。

硝酸鹽；基因家族；調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；氮利用效率

氮構(gòu)成了植物干質(zhì)量的1%～5%，是氨基酸、酰胺、蛋白質(zhì)、核糖核苷酸、輔酶等的組成元素，而且葉綠素、某些植物激素、維生素和生物堿中也含有氮。世界大部分地區(qū)農(nóng)作物都面臨著土壤中可利用氮缺乏的問題，氮肥的施用可以通過增加果實中Ca，F(xiàn)e，Mn和Zn的含量進(jìn)而提高產(chǎn)量[1]，而氮肥的大量施用在促進(jìn)農(nóng)作物高產(chǎn)的同時也對環(huán)境造成了無法挽回的后果。因此，為了實現(xiàn)人與自然的共贏，提高氮素利用效率（nitrogen use efficiency，NUE）已經(jīng)成為當(dāng)前急需解決的問題。

一般來說，NUE包括氮素的吸收效率和氮素的利用效率2個部分[2]。土壤中能被植物吸收的氮源有和這2種形式。對于大多數(shù)植物來說是主要的氮源；對于水稻來說，稻田中的大量被硝化成進(jìn)而被加以利用。植物根吸收氮素后主要有2個去向：一方面被分配到葉片液泡并長久地儲存在液泡中，等待需要時被利用；另一方面，植物以的形式吸收氮源，在硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶的作用下，轉(zhuǎn)化為繼而在氨基酸合成酶如谷氨酰胺酶的作用下變成氨基酸[2]。在此過程中，硝酸鹽轉(zhuǎn)運子是必不可少的，其功能發(fā)揮的場所、時間及程度等顯得尤為重要。

筆者綜述了近年來有關(guān)硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的最新進(jìn)展，并展望了未來該領(lǐng)域的發(fā)展方向，旨在為植物硝酸鹽吸收及氮高效利用分子育種提供借鑒。

1 硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運信號網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的基因家族

植物對硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運等過程涉及的基因多達(dá)上千個，主要包括4個基因家族：轉(zhuǎn)運家族1（NITRATE TRANSPORTER 1，NRT1）轉(zhuǎn)運家族2（NITRATE TRANSPORTER 2，NRT2），氯酸鹽通道家族（CHLORIDE CHANNEI，CLC）和慢離子相關(guān)通道同系物（SLOW ANION CHANNEL-ASSOCIATED1 HOMOLOGS，SLAC/SLAH）。在擬南芥中，NRT1家族有53個成員，NRT2家族有7個成員，CLC家族有7個成員，SLAC/SLAH家族有5個成員。在這72個成員中，有24個是硝酸鹽轉(zhuǎn)運子[3]。目前，這4個基因家族在擬南芥、水稻、苜蓿、黃瓜、細(xì)菌以及真菌等物種中都有研究，但是它們的各個成員在不同物種中的命名都不一樣，有人針對這一情況，對NRT1家族進(jìn)行了系統(tǒng)整理，以NPF（NRT1 PTR FAMILY）命名，共分為8個亞家族[4]。除了這4個基因家族以外，還有一些轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控蛋白也參與其中，它們共同構(gòu)成了錯綜復(fù)雜的硝酸鹽調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[5]。

2 硝酸鹽吸收模式的轉(zhuǎn)換

土壤中硝酸鹽濃度隨著環(huán)境的變化而變化，依據(jù)土壤中硝酸鹽濃度的不同，植物進(jìn)化出了2套硝酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，即低親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（low affinity transporter systems，LATS）和高親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（high affinitytransporter systems，HATS）。當(dāng)外界硝酸鹽含量高的時候，LATS被啟動；當(dāng)外界硝酸鹽含量低的時候，HATS被啟動。關(guān)于硝酸鹽吸收模式轉(zhuǎn)變的臨界點有不同的說法，WILLIAMSL等[6-7]研究認(rèn)為，當(dāng)Km在1 μmol/L～1 mmol/L時，的吸收主要通過高親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)；當(dāng)Km高于1 mmol/L時的吸收主要通過低親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)；而TSAY等[8]研究認(rèn)為，Km在10～300μmol/L時，高親和系統(tǒng)發(fā)揮作用，Km大于0.5 mmol/L時，低親和系統(tǒng)發(fā)揮作用；HO等[9]研究認(rèn)為，高親和系統(tǒng)在Km小于50 μmol/L時起作用，低親和系統(tǒng)在Km大于5 mmol/L時起作用。

在擬南芥中，NRT1.1（CHL1）是應(yīng)對這2種情況的重要蛋白，它不僅能感應(yīng)有氮或無氮2種情況，還能感應(yīng)不同的氮濃度。在低濃度硝酸鹽下，蛋白激酶CIPK23與CHL1直接相互作用，磷酸化CHL1上的蘇氨酸（T101），進(jìn)而維持相對較高水平的硝酸鹽起始反應(yīng)；而在硝酸鹽濃度較高的情況下，CHL1上的T101去磷酸化，產(chǎn)生較低水平的硝酸鹽起始反應(yīng)。在此過程中，CIPK23作為一個負(fù)調(diào)控因子，感受外界N的可利用性，在2種吸收模式之間切換[10]。與CIPK23不同，蛋白激酶CIPK8是硝酸鹽起始反應(yīng)的正調(diào)控因子，它調(diào)控硝酸鹽低親和途徑的起始反應(yīng)。

3 各基因家族及其成員之間的相互作用

3.1 BT家族

BT家族，尤其BT2在NUE網(wǎng)絡(luò)中處于一個核心位置，它的表達(dá)被一系列信號分子調(diào)控，包括生理節(jié)奏、糖分、氮養(yǎng)分、激素、濕度、低溫和各種脅迫[11]。在擬南芥和水稻中，BT家族成員在低氮條件下負(fù)調(diào)控硝酸鹽吸收和NUE。在擬南芥btb-bt2雙突變體中，NRT2.1和NRT2.4的表達(dá)都呈上升趨勢，BTB和BT2通過影響NRT2.1和NRT2.4的表達(dá)來影響擬南芥幼年時期的生長[12]。在水稻中，BT家族抑制NRT2.1，NRT2.2，NRT2.3的表達(dá)。另外，BT2還能在擬南芥成熟葉片中激活端粒酶的表達(dá)，在雌雄配子體的發(fā)育過程中也起著重要的作用。

3.2 NRT1家族

擬南芥NRT1.1是硝酸鹽代謝方面第1個被克隆的基因[13]，在1978年就被分離出來。它是偶聯(lián)質(zhì)子的轉(zhuǎn)運子（Nitrate Transporter），定位在原生質(zhì)膜上。在擬南芥中，NRT1.1是一個雙親和硝酸鹽運輸器，在低氮和高氮2種情況下都能吸收硝酸鹽。而在水稻中，它是低親和硝酸鹽運輸器[14]，參與硝酸鹽的多重運輸，包括根的吸收和根向莖的運輸，還調(diào)節(jié)NRT2.1的表達(dá)[15]。葉片中的硝酸鹽運輸器與氣孔運動有關(guān)，通過調(diào)控硝酸鹽的吸收來控制保衛(wèi)細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而控制著氣孔開放[16-17]。在長距離運輸中，NRT1.5裝載到木質(zhì)部并負(fù)責(zé)從根到莖的運輸，NRT1.7裝載到韌皮部，NRT1.8從木質(zhì)部卸載，NRT1.9負(fù)責(zé)硝酸鹽在木質(zhì)部的運輸。

植物不同種間或種內(nèi)硝酸鹽吸收能力存在著差異。秈稻比粳稻具有更高的硝酸鹽吸收能力，在NUE方面也存在差異。近期的研究表明，正是由于這2個亞種間NRT1.1B的一個單核苷酸多態(tài)性導(dǎo)致了這一差異。NRT1.1B是NRT1.1經(jīng)過選擇性剪切形成的mRNA拼接產(chǎn)物，NRT1.1編碼具有12個跨膜區(qū)域的蛋白，NRT1.1B編碼只具有6個跨膜區(qū)域的蛋白。在低氮條件下，NRT1.1B能夠在植物中積累更多的氮，而NRT1.1沒有類似功能[13]。NRT1.1B參與硝酸鹽吸收、運輸及同化等多步反應(yīng)，它通過提高NUE進(jìn)而提高產(chǎn)量[18]，這為培育高NUE品種奠定了基礎(chǔ)。

NRT1.4不僅參與擬南芥莖部硝酸鹽的儲存，還調(diào)節(jié)葉片中硝酸鹽的含量[19]。NRT1.5在依賴的K+運輸中起著重要作用。在nrt1.5突變體中，限制的供應(yīng)會引起擬南芥莖組織中K+的缺乏[20]。所以，K+從根到莖的運輸和莖中K+的穩(wěn)態(tài)決定著植物體內(nèi)硝酸鹽的平衡，甚至影響到植物的生長以及耐逆性。

在NRT1家族中，大部分成員都是肽/硝酸鹽運輸器，而NRT1.6只運輸硝酸鹽，不運輸肽類，并且是一個低親和硝酸鹽運輸器。它定位在原生質(zhì)膜上，通過從母體組織向發(fā)育中的胚胎運輸硝酸鹽從而促進(jìn)早期胚胎發(fā)育。NRT1.6的活性只能在生殖器官里檢測出來，在授粉后NRT1.6的表達(dá)量迅速升高。nrt1.6突變體在低硝酸鹽情況下種子敗育速率升高并且發(fā)生畸形[19]。

N作為一種可再利用元素，當(dāng)外界N含量不足以供應(yīng)植物生長時，它可以從老葉中活化轉(zhuǎn)移到新葉中再利用，以維持植物生長。在小麥和玉米中，總產(chǎn)量中有50%～90%的N是來源于葉片中N的再利用[21]。顯然，若植物有較好的硝酸鹽貯存能力和再利用能力就能提高N利用效率和糧食產(chǎn)量。硝酸鹽轉(zhuǎn)運子NRT1.7在韌皮部表達(dá)，在硝酸鹽從源到庫的再利用方面起著重要作用[22]。NRT1.8定位在原生質(zhì)膜上，編碼低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運子，其功能是從木質(zhì)部卸載進(jìn)而向植物體不同部位進(jìn)行分配。與此同時，還發(fā)現(xiàn)當(dāng)根受到Cd2+脅迫時，NRT1.8是唯一一個強烈上調(diào)表達(dá)的基因，表明NRT1.8在耐Cd2+脅迫方面也起著重要的作用[23]。NRT1.9是低親和轉(zhuǎn)運子，在韌皮部和木質(zhì)部的硝酸鹽運輸以及硝酸鹽的分配方面起正調(diào)控作用，nrt1.9突變體硝酸鹽從根到莖運輸能力變?nèi)?，進(jìn)而導(dǎo)致植物生長發(fā)育緩慢[24]。

雖然根是主要的吸收水分和礦質(zhì)營養(yǎng)以供植物生長發(fā)育的器官，但仍有人證明植物的地上部分如葉片、果實也能吸收一定的養(yǎng)分[25-26]。植物葉片吸收的NO2可以轉(zhuǎn)化成，再通過硝酸鹽轉(zhuǎn)運子將其運輸?shù)皆|(zhì)內(nèi)，進(jìn)一步儲存或利用。參與這一過程的硝酸鹽轉(zhuǎn)運子是NRT1.11[27]。NRT1.11是低親和硝酸鹽運輸器，定位于主葉脈的原生質(zhì)膜上，NRT1.12也是低親和硝酸鹽運輸器。在nrt1.11～nrt1.12雙突變體中，根部的大多數(shù)被轉(zhuǎn)移到成熟或較大的完全伸展開的葉片中，只有少部分轉(zhuǎn)移到幼嫩組織中[28]，表明NRT1.11和NRT1.12參與在木質(zhì)部向韌皮部的轉(zhuǎn)移和發(fā)育葉片的再分配。

3.3 NRT2家族

NRT2.1是NRT2家族的第1個成員，主要在根中表達(dá)，從土壤中吸收硝酸鹽。在擬南芥中NRT2.1與另一個硝酸鹽吸收相關(guān)蛋白NAR2.1組成一個四聚體原生質(zhì)膜復(fù)合體，其中2個亞基是NRT2.1，另外2個亞基是NAR2.1。NRT2.1的轉(zhuǎn)運活性依賴于NAR2.1，但其具體機制尚不清楚。酵母雙雜交和雙分子熒光互補試驗證明，NRT2家族的7個成員中，除了NRT2.7，其余6個成員都與NAR2.1存在強烈的相互作用[29]。

NRT2.2與NRT2.1共同作用于擬南芥誘導(dǎo)型高親和系統(tǒng)，對組成型高親和系統(tǒng)和低親和系統(tǒng)都作用很小或沒有作用。在誘導(dǎo)型高親和系統(tǒng)中NRT2.1起主要作用，當(dāng)NRT2.1缺失時，作為候補成員NRT2.2的功能成倍增加[30]。NRT2.3在水稻中已被克隆出來，同樣也是高親和硝酸鹽運輸器，它被選擇性剪切成NRT2.3a和NRT2.3b。其中，NRT2.3a在硝酸鹽從根到莖的運輸方面起作用，NRT2.3b在硝酸鹽的積累和活化再利用方面必不可少[31]。

在長期進(jìn)化過程中，植物不僅產(chǎn)生了適應(yīng)低氮和高氮2種環(huán)境的系統(tǒng)，還進(jìn)化出了氮饑餓條件下的應(yīng)對機制。NRT2.4在低氮或氮饑餓條件下被誘導(dǎo)表達(dá)，它在側(cè)根和莖的韌皮部內(nèi)或附近表達(dá)，這與NRT2.1的表達(dá)模式完全不同，或者可以說二者是互補表達(dá)[21]。

NRT2.5是高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運子，存在于根毛區(qū)的表皮、皮層和成熟葉片的小葉脈，其表達(dá)模式與NRT2.4相似，在氮饑餓，特別是長時間N饑餓條件下發(fā)揮作用。在無氮條件下，NRT2.5通過與NRT2.1，NRT2.2及NRT2.4相互作用，確保對硝酸鹽的有效吸收和向韌皮部的有效運輸來支持植物的生長[2]。NRT2.5與NRT2.6相互作用在硝酸鹽的吸收應(yīng)答和植物組織間硝酸鹽分配方面起著重要作用。此外，NRT2家族還能與根際微生物PGPRs互作，產(chǎn)生細(xì)菌性產(chǎn)物來促進(jìn)植物生長。在有葉桿菌屬假單胞菌STM196存在的情況下，NRT2.5與NRT2.6能夠促進(jìn)擬南芥生長，STM196與側(cè)根高的硝酸鹽含量相拮抗而抑制側(cè)根發(fā)育，在此過程中，NRT2.5和NRT2.6被強烈地上調(diào)表達(dá)[32]。NRT2.6與其他NRT2家族不同，它是低親和性硝酸鹽運輸器。它雖然在植物大部分組織中表達(dá)都很弱，但試驗結(jié)果仍然能顯示出NRT2.6在營養(yǎng)器官中比生殖器官中表達(dá)量較高。NRT2.6除了能與細(xì)菌相互作用促進(jìn)植物生長，還與應(yīng)對生物或非生物脅迫方面和活性氧ROS產(chǎn)物的積累方面有一定關(guān)系[33]。

NRT2.7是高親和性運輸器，在成熟種子中特異表達(dá)，參與種子硝酸鹽裝載及儲存。但對nrt2.7突變體表現(xiàn)出花青素的積累和氧化，而硝酸鹽含量沒有明顯變化或受到影響[34]。

3.4 CLC家族

CLC家族作為氯化物通道或離子轉(zhuǎn)運器廣泛存在，該家族編碼逆向運輸器[35]。家族中的不同成員分布在不同細(xì)胞器的膜上，介導(dǎo)硝酸鹽向不同細(xì)胞器的運輸，它們協(xié)同作用，共同維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡。

CLCa是CLC家族中不可或缺的一員，當(dāng)CLCa在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)時，它能更有效地介導(dǎo)和H+的交換，利用pH梯度積累而不是介導(dǎo)Cl-和H+的交換。和H+交換這一過程能夠被ATP可逆地抑制，ATP與CLCa的C末端區(qū)域相互作用，抑制液泡中電流和質(zhì)子泵活性，最高可以抑制其60%的活性，而AMP能夠與ATP競爭結(jié)合，預(yù)防抑制作用的發(fā)生[37]。CLCe與CLCa在硝酸鹽運輸途徑中有著相似的功能，只是CLCe存在于葉綠體的類囊體膜上。clca和clce突變體表現(xiàn)出了相似的表型特征，如硝酸鹽含量變低、亞硝酸鹽含量變高、幾個硝酸鹽運輸基因出現(xiàn)了下調(diào)表達(dá)等，表明CLCa和CLCe在硝酸鹽吸收途徑中相互作用共同維持著細(xì)胞內(nèi)氮的穩(wěn)態(tài)[38]。

CLCd在反面高爾基體中發(fā)揮作用。clcd突變體沒有造成Cl-和的含量變化，而是使根的生長受損，同時提高了對V型ATPase的抑制劑吉他霉素的敏感性，這是因為CLCd與V型ATPase結(jié)合調(diào)控細(xì)胞內(nèi)腔的pH[17]。

4 其他調(diào)控因子

除以上提到的幾個基因家族外，還有許多基因也參與硝酸鹽調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如和谷氨酰胺對硝酸鹽運輸?shù)鞍拙哂幸种谱饔肹41-42]；ADof轉(zhuǎn)錄因子能提高NUE；CCA1能夠調(diào)控N代謝；硝酸鹽誘導(dǎo)基因LBD37，LBD38，LBD39抑制硝酸鹽吸收基因的表達(dá)；一個bZIP轉(zhuǎn)錄因子TGA4，通過增加硝酸鹽運輸和積累來應(yīng)對干旱脅迫[43]；TGA1和TGA4通過調(diào)控NRT2.1和NRT2.2的表達(dá)來對硝酸鹽做出應(yīng)答[44]；NLA基因編碼泛素連接酶用于對硝酸鹽的適應(yīng)反應(yīng)；E-box，Myb和Alfin1這3個轉(zhuǎn)錄因子共同組成了NIA1啟動子的增強子；光敏色素感受光可以誘導(dǎo)N吸收相關(guān)基因表達(dá)；依賴NRT1.1功能的AFB3和NAC4基因在擬南芥根中表達(dá)，可以調(diào)控硝酸鹽；NLP7編碼一個bZIP DNA結(jié)合蛋白，NRG2在硝酸鹽的誘導(dǎo)下與轉(zhuǎn)錄因子NLP7在蛋白層面相互作用[45]；NRG2在NRT1.1的上游調(diào)控其表達(dá)；ANR1/MADS-box能夠被硝酸鹽饑餓所誘導(dǎo)，控制側(cè)根生長[46]；CBL蛋白與CIPK8，CIPK23蛋白激酶相互作用正調(diào)控硝酸鹽起始反應(yīng)[5]；ANR1轉(zhuǎn)錄因子參與硝酸鹽介導(dǎo)的側(cè)根生長和根結(jié)構(gòu)構(gòu)建[47]；在多種物種中都證明，谷氨酰胺合成酶（GS1）能夠提高氮素利用效率，與谷氨酰胺酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶（GOGAT）一起在N吸收過程起作用，并提高產(chǎn)量；糖類轉(zhuǎn)運蛋白（STP13）、早期根瘤素基因都能提高水稻N含量、谷物產(chǎn)量及生物量；轉(zhuǎn)錄因子DOF1和TaNAC2-5A可促進(jìn)小麥氮肥利用效率；硝酸鹽運輸?shù)鞍椎谋磉_(dá)還受pH[48]及晝夜節(jié)律[49]等的調(diào)節(jié)。

5 展望

隨著城市面積的不斷擴張以及耕地面積的相應(yīng)減少，糧食安全逐漸成為人類關(guān)注的焦點。通過提高氮素利用效率來提高我國糧食產(chǎn)量迫在眉睫。隨著分子育種方面的技術(shù)不斷成熟以及高通量技術(shù)的發(fā)展，在分子層面研究氮素利用效率已經(jīng)成為提高糧食產(chǎn)量的捷徑。盡管本文綜述了與硝酸鹽調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的一系列基因家族的作用，分析了不同家族成員之間的互作及調(diào)控關(guān)系，但硝酸鹽介導(dǎo)的信號網(wǎng)絡(luò)通道錯綜復(fù)雜，人們目前所了解的僅僅是冰山一角。與大宗作物玉米和水稻相比，谷子更耐低氮[50]，是研究氮素高效利用的理想作物，未來應(yīng)加強相關(guān)研究。

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Molecular Regulatory Network of Nitrate Absorption and Transportation

ZHANGRuijuan1，2，YANGZhirong3
（1.College ofLife Science，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.College ofGraduate，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；3.College ofArts and Sciences，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Nitrogen,as one ofthe important and restrictive factors ofcrop yield,plays crucial roles in plant growth and development. This paper reviewed the gene families ofnitrate regulatorynetwork and the interactions between them.Finally,it presented the prospect of plant nitrate regulation network in the future.This review provides a useful reference for further research on plant nitrate absorption, transport,storage and reuse,and the molecular breedingfor nitrogen use efficiency.

nitrate;gene families;regulatorynetworks;nitrogen use efficiency

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.46

Q945.12

：A

：1002-2481（2017）05-0861-06

2016-11-30

山西省回國留學(xué)人員科研資助項目（2015-067）；山西省留學(xué)回國人員科技活動擇優(yōu)資助項目（2014-11）；山西省自然科學(xué)基金項目（201601D011071）

張瑞娟（1991-），女，山西長治人，在讀碩士，研究方向：氮素高效利用機制。楊致榮為通信作者。