王艷華 徐國華 李劍梅 韓 冰 楊澤濤 修翠娟

（1 遼寧省微生物科學研究院，遼寧朝陽122000）

蛹蟲草（Cordyceps militaris），又名北冬蟲夏草，蛹草，北蟲草，蛹草菌。隸屬子囊菌門、核菌綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲草屬，是蟲草屬的模式種[1]。蛹蟲草含有豐富的蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖，微量元素硒等，具有增強動物機體免疫力、抗腫瘤、抗輻射、抗菌、抗氧化等多種生理功效，是一種能同時平衡和調節(jié)陰陽的食藥用真菌[2～4]。

蛹蟲草菌株非常容易變異和退化，保存期短，生產菌種需要不斷的進行重新篩選，菌種篩選工作繁重艱巨，所以有效科學的蛹蟲草優(yōu)質高產栽培菌株的篩選方法的建立顯得非常重要。筆者進行了圓頭及尖頭蛹蟲草菌株分離選育鑒定方法探索，現(xiàn)將試驗結果總結如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料新鮮蛹蟲草子實體（圖1、圖2），來自內蒙古敖漢北蟲草農民專業(yè)社。

圖1 圓頭蛹蟲草子實體

圖2 尖頭蛹蟲草子實體

1.2 培養(yǎng)基①斜面培養(yǎng)基配方:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀0.1 g，硫酸鎂0.1 g，瓊脂20 g，加水1000 mL。②栽培培養(yǎng)基配方:麥粒35 g，營養(yǎng)液60 mL。

1.3 試驗方法蛹蟲草菌株分離包括組織分離和孢子分離兩種。兩種方法可結合使用，最后對篩選出的菌株進行鑒定比較，篩選出優(yōu)良菌株進行下一步栽培生產。

1.3.1 組織分離 用無菌刀將蟲草子實體切成長度1～2 mm 的小段，接種于PDA 試管或平板固體培養(yǎng)基上，放置在18～20℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)48～72 h，菌絲開始萌發(fā)，在組織塊周圍長出白色放射狀的菌絲，及時選擇無污染的菌絲體，接種于新的培養(yǎng)基上進一步培養(yǎng)，最終得到純化的蛹蟲草菌株。

組織分離消毒與否對比試驗:取新鮮、生長正常的蛹蟲草子實體，先用清水沖洗，再置于75% 酒精浸泡消毒2～3 min，取出以無菌水反復沖洗2～3次，放在無菌器皿內備用。

按照組織分離方法進行分離培養(yǎng)，最終得到純化的蛹蟲草菌株。

不消毒:采用無菌操作直接用鮮蛹蟲草子實體培養(yǎng)菌絲體。

1.3.2 孢子分離 孢子分離方法更多地適合圓頭蛹蟲草菌株的篩選，尖頭蛹蟲草依品種的不同而有所差異，有的尖頭蛹蟲草品種可以采集到孢子，有的子實體很難產生大量孢子。

孢子分離篩選優(yōu)良菌株比組織分離得到的優(yōu)良菌株的比例小，工作量較大。

2 結果與分析

2.1 不同部位組織分離效果試驗結果，組織塊截取部位越靠下，菌絲體（尖頭蛹蟲草）生長越差，轉色變差，生物學轉化率降低或不出草。試驗結果表明上部1.5 cm以內組織塊分離出的菌種相對能保證轉色出草。但在試驗中也發(fā)現(xiàn)不同批次的子實體即使生長周期相同，有的上部1.5 cm 以內的組織分離出的菌種可轉色出草，有的3～4 cm 的組織部位分離出的菌種仍可較好地轉色出草，說明不同批次不同株型的子實體具有不同的生長遺傳特性。

圓頭草的組織分離要選取孢子頭膨大部位組織體，頭柄相接處及柄部的組織體處分離出的菌株出草性狀不好，不宜采用。試驗結果表明，圓頭蛹草子實體組織用酒精消毒后，培養(yǎng)生長出的菌絲體相比未經酒精消毒的菌絲體轉色差（圖3），出草也差。而尖頭蛹蟲草未出現(xiàn)上述情況。

2.2 組織是否消毒對分離效果的影響結果表明不管是尖頭蛹蟲草還是圓頭草蛹蟲草，只要子實體新鮮無感染，草齡適宜，組織不消毒分離培養(yǎng)出的菌絲體生長旺盛，轉色及出草均正常。但由于蛹蟲草子實體組織體小，在分離過程中要嚴格無菌操作，避免二次人為污染。

2.3 分離蛹蟲草菌株鑒定分離得到的蛹蟲草菌株必須要進行菌株鑒定，以確定得到的菌株是否是優(yōu)質高產北蟲草菌株，只有經過鑒定的優(yōu)良菌株才可以應用到生產中。菌株鑒定包括直接觀察法、鏡檢法、出草試驗等（分子DNA鑒定省略）。

2.3.1 直觀法 直觀法就是靠人的肉眼進行直接觀察，對蛹蟲草菌絲生長情況、見光轉色情況、出草情況等進行觀察比較，并定期記錄。

蛹蟲草菌絲體在PDA 固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)觀察。一般來說，蛹蟲草菌絲體在第2、3 天可觀察到，第4、5天生長較好，優(yōu)良的蛹蟲草菌株在培養(yǎng)初期菌絲為白色，粗壯濃密，呈絨毛狀，邊緣整齊，匍匐狀緊貼培養(yǎng)基生長，菌落生長旺盛。受光線刺激的管壁與基質結合處呈現(xiàn)黃色（圖4）。

圖3 消毒與否圓頭蛹蟲草組織分離菌絲體轉色情況

圖4 蛹蟲草菌體在PDA固體培養(yǎng)基上的生長情況

2.3.2 斜面菌株見光轉色及出草試驗 見光轉色試驗是非常重要且簡單的一步。優(yōu)良的蛹蟲草菌株菌絲體培養(yǎng)后期見光后，受光線刺激與基質結合處呈現(xiàn)黃色。隨著時間的延長，由黃色逐漸變成橘黃色（圖5）。見光后轉色不好或完全不轉色，這樣的菌株完全不能用于生產，生物學轉化率非常低或完全不出草，通過這一步可直接淘汰掉性狀差的菌株。優(yōu)良的菌株可在斜面觀察到出草現(xiàn)象，轉色越快，顏色越深的菌株，出草越早，生物學轉化率也越高。

優(yōu)良的尖頭蛹蟲草菌株轉色很快，2 d以后就可以變?yōu)樯铋冱S色，5～7 d在斜面上可觀察到有針刺狀的高0.5～1 cm的子實體冒出（圖6）。

優(yōu)良的圓頭蛹蟲草菌株則轉色后為淺橘黃色，約10 d后培養(yǎng)基表面可見有針刺狀子實體冒出（圖7）。

2.3.3 鏡檢結果 用顯微鏡檢查菌絲生長情況及菌種純度，有無雜菌。通過鏡檢法還可以進行分生孢子產孢特性與其可育性關系觀察。

蛹蟲草菌絲光滑，有隔及分枝，后期形成分生孢子。在人工培養(yǎng)基上產生擬青霉型（Paecilomycestype）和輪枝孢型（Vertillium-type）2種產孢結構（圖8、圖9）。一些實驗證實同時具有這2種產孢結構的菌株，其子實體形成能力可以保持許多代，性狀不再變異，遺傳性狀相對穩(wěn)定，可結合觀察分生孢子產孢結構進行菌株復篩[5]。

圖5 分離的不同菌株見光轉色情況

圖7 優(yōu)良圓頭蛹蟲草菌株斜面轉色

圖8 蛹蟲草菌絲體細胞

圖9 輪枝孢和擬青霉混合型

2.4 選擇性培養(yǎng)馴化對菌株進行選擇性馴化培養(yǎng)，如選擇不同的培養(yǎng)基，高、低溫刺激等。觀察菌株的生長性狀及其抗逆能力，選擇保留抗逆性強的菌株，這樣的菌株生產性能更加優(yōu)良。

2.5 栽培出草試驗在進行大規(guī)模生產前，對初篩的性狀優(yōu)良的菌株必須要進行小規(guī)模栽培出草試驗，在玻璃瓶中進行即可，小規(guī)模出草試驗成功后才可進行真正的規(guī)模生產。

接種后生長速度快，出草整齊，草形好，生物學轉化率高的菌株可作為優(yōu)良的生產用菌株。

3 小結與討論

蛹蟲草菌株非常容易退化，保藏期很短，菌種篩選工作非常繁重。試驗對尖頭及圓頭蛹蟲草優(yōu)良菌株分離選育，通過直接觀察法簡單且直觀初步去掉劣勢菌株，篩選出初級優(yōu)良菌株，減少了后續(xù)試驗時間及工作量；鏡檢法、出草試驗結合進一步確認篩選出菌株優(yōu)良性。試驗建立了一套蛹蟲草優(yōu)質高產栽培菌株的篩選方法，對蛹蟲草菌株的選育工作具有一定的指導作用。

蛹蟲草高產菌株的篩選有許多關鍵因素，篩選出優(yōu)良菌株后，菌株的保藏條件、保藏時間，傳代復壯次數(shù)等都對蛹蟲草的生長有至關重要的影響[5，6]。

由于蛹蟲草的種類多、分布廣，其生長條件存在著一定的差異，菌絲體的分化也有一定的差異，菌株篩選方法也會有所不同。