廖宇圣，張姮，黃曼玲，田俊

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院, 武漢 430070；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

FAM96A在人肝癌組織中表達(dá)及其對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

廖宇圣1，張姮1，黃曼玲1，田俊2

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院, 武漢 430070；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

目的觀察96序列相似的家庭成員A(FAM96A)在人肝癌組織中的表達(dá)并探討其對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)及免疫印跡法檢測(cè)FAM96A蛋白在肝癌組織和癌旁組織、HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞中的mRNA及蛋白表達(dá)量。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含人FAM96A全長(zhǎng)序列的pcDNA3.1-myc-FAM96A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，24 h后分為FAM96A組和對(duì)照組，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-myc-FAM96A質(zhì)粒和pcDNA3.1-vector空白質(zhì)粒。采用MTT法及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)兩組HepG2細(xì)胞增殖活力和凋亡率。結(jié)果FAM96A mRNA在肝癌組織、癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.704±0.178、1.707±0.267,在HepG2細(xì)胞、L02細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.627±0.251、1.654±0.285，兩者比較，P均lt;0.05。FAM96A蛋白在肝癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織、在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)低于L02細(xì)胞，P均lt;0.05。FAM96A組細(xì)胞增殖活力低于對(duì)照組(Plt;0.05)，F(xiàn)AM96A組、對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為33.06%±3.15%、5.08%±0.75%，兩組比較，Plt;0.05。結(jié)論FAM96A在人肝癌組織中表達(dá)下降，過表達(dá)FAM96A可抑制肝癌細(xì)胞增殖且誘導(dǎo)其凋亡。

肝腫瘤；96序列相似的家庭成員A;細(xì)胞增殖; 細(xì)胞凋亡

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱肝癌)是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一[1]。肝癌的病死率在癌癥相關(guān)死因中位列第三，5年生存率僅為10%,復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者長(zhǎng)期生存率較低的主要原因，機(jī)制不明[2，3]。肝癌的發(fā)生發(fā)展是癌基因激活或(和)抑癌基因失活在內(nèi)的多階段多步驟過程。96序列相似的家庭成員A (FAM96A) 是普遍存在、高度保守的凋亡激活蛋白，其生物學(xué)功能尚不明確[4]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于FAM96A 的研究報(bào)道甚少，F(xiàn)AM96A在肝癌發(fā)生發(fā)展中的功能未知。2015年1月～2016年12月，我們觀察了FAM96A在肝癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)差異,并探討其對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以期為尋找肝癌新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院2015年1月～2016年12月的48例人肝癌組織及配對(duì)癌旁(距腫瘤邊緣gt;2 cm)組織標(biāo)本，患者男34例、女14例，年齡≤50歲30例，gt;50歲18例；腫瘤直徑：≤5 cm 18例，gt;5 cm 30例；腫瘤數(shù)目：?jiǎn)伟l(fā)31例，多發(fā)17例；乙肝表面抗原：陽性41例，陰性7例；肝硬化：有38例，無10例；血清AFP：≤20 ng/mL 15例，gt;20 ng/mL 33例；門靜脈癌栓：有13例，無35例；肝外轉(zhuǎn)移:陽性8例，陰性40例；Child分級(jí)：A級(jí)39例，B級(jí)9例；BCLC分期:A期28例，B+C期20例。標(biāo)本均經(jīng)本院病理科診斷證實(shí)為原發(fā)性肝癌。48例肝癌組織標(biāo)本及配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本離體后立即置入液氮中保存。標(biāo)本的獲取均得到患者本人及家屬同意，并通過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 FAM96A mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用Real-time PCR法。按照TRIzol試劑盒操作說明書提取48例肝癌組織及配對(duì)癌旁組織、L02細(xì)胞、HepG2細(xì)胞的總mRNA。人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞、人正常胎肝L02細(xì)胞均保存于本院中心實(shí)驗(yàn)室。FAM96A正向引物：5′-GCAAAGCACGCTGGAACT-3′，反向引物：5′-GGCCGAGACAAGCCTAAA-3′；β-actin正向引物：5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′，反向引物：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′。均由上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)公司設(shè)計(jì)并合成。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，低溫保存?zhèn)溆?。Real-time PCR總反應(yīng)體系為20 μL，其中2×SYBR Green mix緩沖液10 μL，正反向引物各0.6 μL(濃度為10 μmol/L)，cDNA 2 μL，DEPC水補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s；共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。每個(gè)樣本均做3個(gè)復(fù)孔，并重復(fù)3次。各組中FAM96A的相對(duì)表達(dá)量通過2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.3 FAM96A蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。分別稱取0.08 g肝癌組織和癌旁組織，收集L02細(xì)胞及HepG2細(xì)胞，加800 μL全蛋白提取液提取蛋白，Bradford法蛋白定量。各組取120 μg上樣于5.0%濃縮膠，15%分離膠，行SDS-PAGE電泳分離。轉(zhuǎn)移蛋白于PVDF膜，5%脫脂奶粉稀釋的FAM96A及β-actin一抗封閉，4 ℃過夜，HRP標(biāo)記二抗，37 ℃溫育,化學(xué)發(fā)光法顯影檢測(cè)蛋白表達(dá)。免疫印跡條帶的灰度值經(jīng)灰度掃描儀分析后獲得。

1.4 HepG2細(xì)胞增殖活力檢測(cè) 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于96孔板,每孔約100 μL，24 h后轉(zhuǎn)染，分為FAM96A組和對(duì)照組，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-myc-FAM96A質(zhì)粒、pcDNA3.1-vector空白質(zhì)粒。DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS)培養(yǎng)1～4 d，每孔加5 mg/mL的MTT溶液20 μL，孵育1 h后棄上清液，每孔加DMSO 150 μL，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔吸光度(A)值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，其中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為A值。

1.5 HepG2細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 收集細(xì)胞，按照說明書加Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL混勻，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)FITC,利用CellQuest軟件獲取并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 FAM96A在肝癌、癌旁組織中的表達(dá)比較 FAM96A mRNA在肝癌、癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.704±0.178、1.707±0.267,二者比較，P=0.000。FAM96A蛋白在肝癌、癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.701±0.207、1.452±0.262，二者比較，P=0.000。

2.2 FAM96A在HepG2細(xì)胞、L02細(xì)胞中的表達(dá)比較 FAM96A mRNA 在HepG2細(xì)胞、L02細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.627±0.251、1.654±0.285,二者比較，P=0.000。FAM96A蛋白在HepG2細(xì)胞、L02細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.612±0.245、1.375±0.271，二者比較，P=0.000。

2.3 HepG2細(xì)胞增殖活力比較 轉(zhuǎn)染第1天，F(xiàn)AM96A組、對(duì)照組A值分別為0.152±0.031、0.156±0.037；轉(zhuǎn)染第2天，A值分別為0.305±0.039、0.412 ±0.036；轉(zhuǎn)染第3天，A值分別為0.432±0.094、0.714±0.054；轉(zhuǎn)染第4天，A值分別為0.604±0.061、0.902±0.063；轉(zhuǎn)染第2～4天，F(xiàn)AM96A組A值低于對(duì)照組(P均lt;0.05)。

2.4 HepG2細(xì)胞凋亡率比較 FAM96A組、對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為33.06%±3.15%、5.08%±0.75%，兩者比較，P=0。

3 討論

FAM96A與FAM96B屬同源蛋白，通過與其相互作用蛋白復(fù)合而發(fā)揮功能。研究[4]表明，F(xiàn)AM96A、FAM96B、CIA1及胞質(zhì)鐵硫蛋白簇聚集系統(tǒng)的靶因子MMS19組成蛋白復(fù)合物發(fā)揮作用。FAM96B-CIA1-MMS19蛋白復(fù)合物促進(jìn)多數(shù)胞質(zhì)-胞核鐵硫蛋白的組裝。FAM96A-CIA1蛋白復(fù)合物特異性促進(jìn)鐵調(diào)節(jié)蛋白1成熟，從而維持細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)FAM96B的功能研究已取得突破性進(jìn)展[5～8]，然而關(guān)于FAM96A的研究報(bào)道甚少。

在腫瘤組織及其相應(yīng)鄰近正常組織的差異性表達(dá)是分析基因與腫瘤關(guān)系的基礎(chǔ)，異常表達(dá)的基因可能在腫瘤形成中扮演重要角色，可認(rèn)為是潛在的新一類控制細(xì)胞增殖和凋亡的癌基因和抑癌基因[9]。本研究中Real-time PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果均顯示FAM96A在肝癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在人肝癌細(xì)胞系HepG2中的表達(dá)低于人正常胎肝細(xì)胞系L02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢?FAM96A在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。可能是抑癌基因通過間接作用抑制肝癌和其他腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Zhang等[10]從動(dòng)物水平探索FAM96A功能，建立H22荷瘤模型，觀察FAM96A對(duì)小鼠的抑瘤作用，研究結(jié)果表明FAM96A抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究分別從人體組織標(biāo)本及人肝癌細(xì)胞系兩方面證實(shí)FAM96A可能是潛在抑癌基因，在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑制作用。與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

目前，研究[11]認(rèn)為基因克隆、基因轉(zhuǎn)染是明確基因功能的主要方法。肝癌HepG2細(xì)胞容易獲得及培養(yǎng)，且轉(zhuǎn)染效率高。因此，本研究將FAM96A質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，觀察FAM96A基因過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。本研究中，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示FAM96A組細(xì)胞的增殖速度低于對(duì)照組，即過表達(dá)FAM96A可抑制肝癌細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示過表達(dá)FAM96A可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)AM96A在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系HepG2表達(dá)下降，且抑制HepG2細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。因此，F(xiàn)AM96A可作為一種新的抑癌基因而抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。

[1] 中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專業(yè)委員會(huì)，中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)臨床腫瘤學(xué)協(xié)作專業(yè)委員會(huì),中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)肝癌學(xué)組.原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治的專家共識(shí)[J].中華肝臟病雜志，2009，17(6)：403-410.

[2] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):69-90.

[3] Altekruse SF, McGlynn KA, Reichman ME. Hepatocellular carcinoma incidence, mortality, and survival trends in the United States from 1975 to 2005[J]. J Clin Oncol, 2009,27(9):1485-1491.

[4] Stehling O, Mascarenhas J, Vashisht AA, et al. Human CIA2A-FAM96A and CIA2B-FAM96B integrate iron homeostasis and maturation of different subsets of cytosolic-nuclear iron-sulfur proteins[J]. Cell Metal, 2013,18(2):187-198.

[5] Ito S, Tan LJ, Andoh D, et al. MMXD, a TFIIH-independent XPD-MMS19 protein complex involved in chromosome segregation[J]. Mol Cell, 2010,39(4):632-640.

[6] Yang W, Itoh F, Ohya H, et al. Interference of E2-2-mediated effect in endothelial cells by FAM96B through its limited expression of E2-2[J]. Cancer Sci, 2011,102(10):1808-1814.

[7] 張智勇，蔡遜，馬丹丹，等.96序列相似的家庭成員B在肝癌中的表達(dá)變化及功能研究[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2014,31(7)：1489-1491.

[8] 蔡遜，馬丹丹，田俊，等.FAM96B基因在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)且抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2016，45(2)：132-135.

[9] Si ML, Zhu S, Wu H, et al. MiR-21 mediated tumor growth[J]. Oncogene, 2007,26(19):2799-2803.

[10] Zhang MY, Wang JP. A multi-target protein of hTERTR-FAM96A presents significant anticancer potent in the treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Tumor Biol, 2017,39(4):1-10.

[11] 翟保平，李文濤，張斌，等.人類DCC基因克隆及真核表達(dá)載體構(gòu)建于鑒定[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011,28(2)：226-228.

ExpressionofFAM96AinhumanlivercancertissuesanditseffectonproliferationandapoptosisofhumanlivercancerHepG2cells

LIAOYusheng1,ZHANGHeng,HUANGManling,TIANJun

(1TheCentralHospitalofWuhanAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430070,China)

ObjectiveTo investigate the expression of family with sequence similarity 96 member A(FAM96A)in the liver cancer tissues and to evaluate its effects on the cell proliferation and apoptosis of human liver cancer cells HepG2.MethodsReal-time PCR and Western blotting were applied to detect the mRNA and protein expression levels of FAM96A in the liver cancer tissues and their adjacent tissues, HepG2 cells and L02 cells. Furthermore, the recombinant plasmid of pcDNA3.1-myc-FAM96A containing the whole sequence of human FAM96A gene (FAM96A group) and pcDNA3.1-vector pcDNA3.1-vector blank plasmid (control group) were respectively transfected into HepG2 cells. Then MTT essay and flow cytometry were applied to detect the proliferation and apoptosis rate of HepG2 cells in the two groups.ResultsFAM96A mRNA levels were significantly decreased in the liver tissues than in the adjacent tissues (0.704±0.178 vs. 1.707±0.267) and in HepG2 cells than in L02 cells (0.627±0.251 vs. 1.654±0.285), (bothPlt;0.05). While FAM96A protein expression levels were lower in the liver tissues as compared with those of the adjacent tissues and were lower in HepG2 cells than in L02 cells ( bothPlt;0.05). Moreover, MTT assay showed that the proliferation of the FAM96A group was significantly lower than that of the control group (Plt;0.05). FACS analysis indicated that the apoptotic rate was higher in the FAM96A group than in the control group (33.06%±3.15% vs. 5.08%±0.75%), (Plt;0.05).ConclusionThe FAM96A expression is significantly decreased in the liver cancer tissues and overexpression of FAM96A can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of HepG2 cells.

liver neoplasms; family with sequence similarity 96 member A (FAM96A); cell proliferation; apoptosis

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.003

R735.7

A

1002-266X(2017)41-0009-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81350006)。

廖宇圣(1977-),男，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)镕AM96A與FAM96B在消化系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá)及功能研究。E-mail：63669165@qq.com

張姮(1973-)女，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)镕AM96A與FAM96B的功能與機(jī)制研究。E-mail：653262549@qq.com

2017-07-12)