仇保豐 董蓉蓮 宋鴻雁 顧炳泉 +景瑾 劉文斌 +邵義祥 +高逢結(jié) +李建

摘要：根據(jù)GenBank中收錄的柔嫩艾美耳球蟲核糖體蛋白S3a基因序列，利用計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，從純化的柔嫩艾美耳球蟲第2代裂殖子中提取總RNA，然后應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出約810 bp的產(chǎn)物，將其連入pMD18-T載體，經(jīng)雙酶切和PCR鑒定正確后，進(jìn)一步進(jìn)行DNA序列測(cè)定。將本研究測(cè)序結(jié)果與GenBank收錄的柔嫩艾美耳球蟲S3a基因進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩序列間有6個(gè)堿基發(fā)生突變，其中3個(gè)為無義突變，其余為有義突變，同源性為979%；本研究擴(kuò)增的S3a基因包含了一個(gè)全長(zhǎng)795 bp的完整開放閱讀框（ORF），編碼264個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為29.9 KD，ORF堿基同源性為99.0%，推導(dǎo)氨基酸序列同源性為98.1%。將本研究克隆的核糖體蛋白S3a基因與GenBank中收錄的人和哺乳動(dòng)物、植物、真菌、禽鳥等共15種真核生物的核糖體蛋白S3a基因進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，雖然本研究克隆和GenBank中收錄的柔嫩艾美耳球蟲S3a基因之間同源性最高，但是兩者卻與碩大利什曼原蟲和布氏錐蟲這2種原蟲的S3a基因同源性較低，反而與禽鳥S3a基因的同源性較高。

關(guān)鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲；S3a基因；克??；分析

中圖分類號(hào)： Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0068-03

收稿日期：2015-09-27

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31301926）；江蘇省自然科學(xué)基金（編號(hào)：BK20130388）。

作者簡(jiǎn)介：仇保豐（1978—），男，安徽長(zhǎng)豐人，博士，獸醫(yī)師，從事動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品病原體的檢測(cè)及研究。Tel：（0513）68588403；E-mail：baofengqiu2008@163.com。

通信作者：宋鴻雁，博士，副教授，研究方向?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail：songhongyanv@ntu.edu.cn。

雞柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）S3a基因是從E. tenella第1代裂殖體λ ZapⅡ cDNA 文庫(kù)中篩選出來的1種核糖體蛋白（EtS3a）基因，由于它與具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和參與蛋白合成的哺乳動(dòng)物核糖體蛋白fte-1、植物核糖體蛋白cyc-07和酵母菌核糖體蛋白MFT1均具有較高的同源性，且其mRNA僅在E. tenella裂殖體和裂殖子階段能夠檢測(cè)到，故而推測(cè)EtS3a可能在激發(fā)E. tenella裂殖子和裂殖體發(fā)育、黏附和侵襲宿主細(xì)胞、適應(yīng)環(huán)境變化等過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[1]。除此之外，Cordeiro-Da-Silva等在研究中發(fā)現(xiàn)，碩大利什曼原蟲（Leishmania major）的S3a蛋白還具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞活性，參與免疫調(diào)節(jié)的作用[2]。Zemzoumi等報(bào)道碩大利什曼原蟲S3a蛋白可由胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，并與被膜結(jié)合，具有保護(hù)抗原的特性[3]。但截止目前，國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于E. tenella S3a基因克隆和分析的研究報(bào)道，這對(duì)進(jìn)一步研究E. tenella S3a蛋白的生物學(xué)功能和免疫學(xué)意義等造成不利影響。本研究通過對(duì)雞E. tenella江蘇分離株的S3a基因進(jìn)行克隆和分析，為相關(guān)研究工作者提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1球蟲卵囊E. tenella卵囊分離自江蘇某雞場(chǎng)，由南通出入境檢驗(yàn)檢疫局有害生物檢疫實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。

1.1.2試驗(yàn)雞1日齡AA肉雞購(gòu)自江蘇南通某商品雞孵化場(chǎng)，飼養(yǎng)于嚴(yán)格消毒無球蟲的籠舍中，飼喂的飼料中不含抗球蟲藥。

1.1.3試劑DEPC，購(gòu)自Amresco公司；M-MLV和Oligo（dT）15 Primer，購(gòu)自Promega公司；pMD18-T克隆載體、Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2 000 Marker、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和DNA膠回收試劑盒，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)和合成根據(jù)GenBank中收錄的E. tenella S3a基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增引物：S3a-F，5′-A[ZZ（Z]GGATCC[ZZ）]ATGGCGGTCGGTAAGAACAAG-3′；S3a-R，5′-TT[ZZ（Z]GAATTC[ZZ）]TCAGACAGAGTCTTGCACAG-3′，畫線部分為BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2cDNA模板的制備30只1日齡AA肉雞飼養(yǎng)至14日齡，經(jīng)口接種新鮮孢子化卵囊1×105 個(gè)/羽，接種后120 h殺雞取盲腸。參考文獻(xiàn)[4]的方法分離和純化E. tenella第2代裂殖子，再采用一步法[5]提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄cDNA作為PCR模板。

1.2.3S3a基因的克隆及鑒定以“1.2.2”節(jié)制備的cDNA為模板，用特異性引物進(jìn)行S3a基因的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下：10×Taq Buffer 2.5 μL，MgCl2 （25 mmol/L） 1.0 μL，dNTP Mix （10 mmol/L each） 0.5 μL，上、下游引物（50 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，滅菌雙蒸水14.5 μL，cDNA模板5 μL。S3a基因的PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 55 s，57 ℃ 55 s，72 ℃ 55 s，35個(gè)循環(huán)，然后72 ℃延伸15 min。循環(huán)反應(yīng)完畢后，將擴(kuò)增產(chǎn)物中加入5 μL上樣緩沖液在1%瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)束后在紫外燈下觀察結(jié)果。回收S3a基因目的條帶、連接 pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化DH5α，用雙酶切和PCR鑒定出陽(yáng)性克隆，并挑取3個(gè)克隆送寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。

1.2.4S3a基因序列分析用DNAStar 4.0軟件對(duì)S3a基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯，分析開放閱讀框（ORF）的堿基序列，并推導(dǎo)出編碼蛋白的氨基酸序列。收集GenBank中報(bào)道E. tenella S3a基因序列，用MegAlign Clustal V軟件對(duì)S3a基因的堿基序列和推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和分析。最后將所得S3a基因測(cè)序結(jié)果輸入http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/進(jìn)行網(wǎng)上比，同時(shí)分別選取原蟲、真菌、植物、鳥類、人和其他哺乳動(dòng)物的核糖體蛋白S3a基因，并用MEGA 6.06軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化發(fā)生樹，分析了本研究克隆S3a基因和上述物種S3a基因之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1S3a基因的克隆

提取E. tenella第2代裂殖子的總RNA并反轉(zhuǎn)錄，分別用S3a基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)第1、2、3泳道未能擴(kuò)增出目的片段，第4泳道有約810 bp的目的條帶（圖1），與預(yù)期大小相吻合。切膠回收第4泳道的目的條帶，連接pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α。

[TPQBF1.tif]

2.2S3a基因的鑒定

目的基因S3a連接T載體并轉(zhuǎn)化DH5α后，提取質(zhì)粒 T-S3a經(jīng)EcoRⅠ+BamHⅠ雙酶切鑒定和特異性引物的PCR鑒定，均能獲得與預(yù)期結(jié)果一致的目的條帶（圖2和圖3），挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆送寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序并進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，本研究所擴(kuò)增的S3a基因與GenBank收錄的E. tenella S3a基因同源性最高（達(dá)97.9%），說明本研究E. tenella S3a基因克隆成功。

2.3S3a基因序列分析

用DNAStar 4.0軟件編輯S3a基因測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上、下游引物間的堿基數(shù)量為810 bp，與預(yù)期大小一致。與GenBank中收錄的E. tenella S3a全基因（登陸號(hào)：AF042107.1）比較發(fā)現(xiàn)，本研究擴(kuò)增序列有6個(gè)堿基發(fā)現(xiàn)突變（分別為第332、357、420、459、520、526位，引物設(shè)計(jì)時(shí)人工突變的堿基未計(jì)算在內(nèi)，下同），比較推導(dǎo)氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，僅第332、520、526位堿基突變?yōu)橛辛x突變，引起氨基酸序列第111、174和176位3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，其余為無義突變。將江蘇株E. tenella S3a基因與GenBank收錄序列的ORF進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)本[CM（25]研究擴(kuò)增的江蘇株E. tenella[KG*3]S3a基因包含了795[KG*3]bp的[CM）]

[FK（W10][TPQBF2.tif；S+3mm]

[FK（W10][TPQBF3.tif；S+3mm]

完整開放閱讀框（ORF），編碼蛋白為264個(gè)氨基酸，蛋白分子量約29.9 ku，兩序列間ORF堿基同源性為99.0%，推導(dǎo)氨基酸序列同源性為98.1%。

已有研究表明，E. tenella S3a基因與哺乳動(dòng)物核糖體蛋白fte-1、植物核糖體蛋白cyc-07和酵母菌核糖體蛋白MFT1均具有較高的同源性[1]。本研究收集了GenBank中人和哺乳動(dòng)物、植物、真菌、鳥類共15種生物的核糖體蛋白S3a基因，其中包括E. tenella、Leishmania major和布氏錐蟲（Trypanosoma brucei）3種原蟲，人（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）和家貓（Felis catus）3種哺乳動(dòng)物，菠蘿（Ananas comosus）、小麥（Triticum aestivum）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon） 3種植物，金雕東北亞種（Aquila chrysaetos canadensis）、游隼（Falco peregrinus）、灰冠鶴（Balearica regulorum gibbericeps）、歐洲普通杜鵑（Cuculus canorus）和火雞（Meleagris gallopavo）5種禽鳥，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）1種真菌，結(jié)合本研究克隆的S3a基因共同用MegAlign Clustal V軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)上述S3a基因間的同源性在35.0%～979%之間不等，總體表現(xiàn)是生物分類關(guān)系較近的物種，如不同種禽鳥之間S3a基因的同源性相對(duì)較高；而生物分類關(guān)系較遠(yuǎn)的不同物種間，如禽鳥類和植物之間，S3a基因的同源性較低。但例外的是，雖然本研究克隆和GenBank中收錄的E. tenella S3a基因之間同源性最高，但是兩者卻與碩大利什曼原蟲和布氏錐蟲這2種原蟲的同源性較低，反而與禽鳥S3a基因的同源性較高。接著用MEGA 6.06軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化發(fā)生樹，也發(fā)現(xiàn)相同結(jié)果，即E. tenella S3a基因與禽鳥S3a基因分布在一個(gè)進(jìn)化關(guān)系較近的分支上，而與碩大利什曼原蟲和布氏錐蟲這2種原蟲所處的分支相距較遠(yuǎn)（圖4）。進(jìn)一步將E. tenella S3a基因序列輸入GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)，也發(fā)現(xiàn)E. tenella S3a基因與多種禽鳥S3a基因之間的同源性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他物種的S3a基因，但為何會(huì)出現(xiàn)此結(jié)果，還需要進(jìn)一步研究和探討。

[FK（W17][TPQBF4.tif]

3討論

真核生物核糖體蛋白S3a存在于40S核糖體亞基上，且位于大小核糖體亞基的接觸面上，該部位是核糖體結(jié)合翻譯啟動(dòng)因子2（eIF2）、eIF3、eF2、Met-tRNA、Phe-tRNA及 mRNA 的位置，因而S3a水平的變化將影響核糖體翻譯功能的啟動(dòng)，很可能特異性地抑制某些參與生命活動(dòng)的重要蛋白質(zhì)的合成，影響細(xì)胞代謝[6-7]。例如，人的fte-1（v-fos transformation effector）基因早已是公認(rèn)的v-fos轉(zhuǎn)化效應(yīng)蛋白基因，它編碼的蛋白與核糖體蛋白S3a為同一產(chǎn)物，fte-1蛋白參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)、蛋白合成及向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，另外還有在淋巴細(xì)胞中參與信號(hào)傳遞的作用[1，8]。國(guó)外學(xué)者在研究核糖體蛋白S3a時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)v-fos基因受到抑制時(shí)，已發(fā)生轉(zhuǎn)化效應(yīng)的細(xì)胞可恢復(fù)正常功能，從而推斷S3a蛋白在核糖體外還應(yīng)具有其他功能[9]。目前認(rèn)為，核糖體蛋白S3a在細(xì)胞中具有多種功能，除了參與翻譯起始之外，還在調(diào)節(jié)增殖、惡性轉(zhuǎn)化、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞免疫等方面起重要作用。因此，國(guó)內(nèi)外研究人員目前已對(duì)人、青鳉、家蠶、利什曼原蟲等大量真核生物的核糖體蛋白S3a進(jìn)行了深入的研究。GenBank中也收錄了大量來源于各種真核生物的S3a基因或疑似S3a（S3a-like）基因序列。

與此相對(duì)應(yīng)的是，盡管Ouarzane 等早在1998年就報(bào)道了從雞E. tenella第1代裂殖體λZapⅡ cDNA 文庫(kù)中篩選出E. tenella S3a基因，同時(shí)推測(cè)該基因編碼的蛋白可能在調(diào)節(jié)蛋白合成，進(jìn)而激發(fā)裂殖子、裂殖體侵襲和感染宿主細(xì)胞，適應(yīng)環(huán)境變化等過程中都發(fā)揮重要作用[1]。但截止到目前，國(guó)內(nèi)外既缺乏關(guān)于E. tenella S3a基因克隆和分析的報(bào)道，也沒有針對(duì)E. tenella S3a蛋白生物學(xué)功能的后續(xù)研究。GenBank中也僅收錄了Ouarzane 等上傳的1條的E. tenella S3a基因序列[1]。本研究利用PCR技術(shù)，從雞E. tenella江蘇分離株第2代裂殖子中成功克隆出S3a基因。將本研究克隆的江蘇株E. tenella S3a基因與GenBank中收錄的S3a基因序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，本研究擴(kuò)增序列有6個(gè)堿基發(fā)現(xiàn)突變，且其中第332、520、526位堿基突變?yōu)橛辛x突變，引起推導(dǎo)氨基酸序列第111、174、176位3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，其余為無義突變。2條S3a基因序列同源性為97.9%，ORF堿基同源性為990%，ORF推導(dǎo)氨基酸同源性為98.1%。至于在不同來源的雞E. tenella分離株中，S3a基因存在的堿基突變概率和位點(diǎn)的普遍性、規(guī)律性及其在生物進(jìn)化和適應(yīng)宿主中的意義等問題，這還需要比對(duì)大量不同來源的E. tenella S3a基因并進(jìn)行更深入的研究才能得出。

通常認(rèn)為雞球蟲的免疫原性主要在其無性生殖階段（裂殖生殖），而有性生殖階段（配子生殖）或子孢子幾乎沒有免疫原性。Ouarzane 等則研究發(fā)現(xiàn)，僅在第1代裂殖體和第2代裂殖子階段能夠檢測(cè)到E. tenella S3a基因的mRNA，在孢子化和未孢子化卵囊未能檢測(cè)到[1]。如果在球蟲第1代裂殖體和第2代裂殖子階段都大量表達(dá)的S3a蛋白能夠被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外發(fā)揮保護(hù)性抗原的作用，那么用S3a基因構(gòu)建的球蟲亞單位苗或核酸疫苗將會(huì)在抑制球蟲增殖、阻斷球蟲侵襲和感染中發(fā)揮一定作用。再加之Cordeiro-Da-Silva等在研究中發(fā)現(xiàn)，碩大利什曼原蟲的S3a蛋白還具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞活性，參與免疫調(diào)節(jié)的作用[2]。Zemzoumi等則報(bào)道了碩大利什曼原蟲S3a蛋白可由胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外并與被膜結(jié)合，具有保護(hù)抗原的特性[3]。Barros等在研究克氏錐蟲時(shí)也有類似的發(fā)現(xiàn)，他們一致認(rèn)為是S3a蛋白由胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)出來與體外的被膜結(jié)合，使S3a蛋白成為了保護(hù)性抗原[10]。因此，本研究對(duì)雞E. tenella S3a基因進(jìn)行了體外擴(kuò)增和分析，也可以為篩選理想的E. tenella保護(hù)性抗原、構(gòu)建新型疫苗和研制抗球蟲新藥等打下基礎(chǔ)。

除此之外，將本研究克隆的E. tenella S3a基因與GenBank中人和哺乳動(dòng)物、植物、真菌、[JP+1]鳥類共15種生物的核糖體蛋白S3a基因進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，雖然本研究克隆和GenBank中收錄的E. tenella S3a基因之間同源性最高，但是兩者卻與碩大利什曼原蟲和布氏錐蟲這2種原蟲的S3a同源性較低，反而與禽鳥S3a基因的同源性較高。這可能對(duì)研究雞E. tenella 寄生于宿主的過程中，S3a基因發(fā)揮的生物學(xué)功能和免疫學(xué)作用等有重要的啟發(fā)意義，應(yīng)該引起研究人員的關(guān)注。

[HS2][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：[HT8.SS]

[1][ZK（#]Quarzane M，Labbé M，Péry P. Eimeria tenella：cloning and characterization of cDNA encoding a S3a ribosomal protein[J]. Gene，1998，225（1/2）：125-130.

[2]Cordeiro-Da-Silva A，Borges M C，Guilvard E，et al. Dual role of the Leishmania major ribosomal protein S3a homologue in regulation of T-and B-cell activation[J]. Infection and Immunity，2001，69（11）：6588-6596.

[3]Zemzoumi K，Guilvard E，Sereno D，et al. Cloning of a Leishmania major gene encoding for an antigen with extensive homology to ribosomal protein S3a[J]. Gene，1999，240（1）：57-65.

[4]蔣建林，蔣金書.柔嫩艾美耳球蟲各階段蟲體純化方法的改進(jìn)[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，1（5）：99-102.

[5]薩姆布魯克 J，拉塞爾 D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]. 3版. 黃培堂，王嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等譯. 北京：科學(xué)出版社，2002：1256-1259.

[6]孫阿萍，呂曉平，張秋遲，等. 細(xì)胞凋亡過程中核糖體蛋白質(zhì)S3a水平變化的研究（一）[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2001，24（3）：1-2.[HJ1.7mm]

[7]Shemer R，Eibschitz I，Cavari B. Isolation and characterization of medaka ribosomal protein S3a （fte-1） cDNA and gene[J]. Gene，2000，250（1/2）：209-217.

[8]邵源，肖聲，翟文靜，等. CD2胞內(nèi)區(qū)結(jié)合蛋白的分子克隆與鑒定[J]. 科學(xué)通報(bào)，2000，45（11）：1163-1167.

[9]Nolte D，Taimor G，Kalff-Suske M，et al. The human S3a ribosomal protein：sequence，location and cell-free transcription of the functional gene[J]. Gene，1996，169（2）：179-185.

[10][ZK（#]Barros H C，Da Silva S，Verbisck N V，et al. Release of membrane-bound trails by Trypanosoma cruzi amastigotes onto modified surfaces and mammalian cells[J]. The Journal of Eukaryotic Microbiology，1997，43（4）：275-285.