郝和群，鄭慧芳，張 艦

(1. 皖西學(xué)院材料與化工學(xué)院，安徽六安 237012；2. 安徽省仿生傳感與檢測(cè)技術(shù)省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽六安 237012；3. 皖西學(xué)院高分子材料改性工程技術(shù)研究中心，安徽六安 237012)

研究論文

疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的制備與表征

郝和群1，2，鄭慧芳1，張 艦3*

(1. 皖西學(xué)院材料與化工學(xué)院，安徽六安 237012；2. 安徽省仿生傳感與檢測(cè)技術(shù)省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽六安 237012；3. 皖西學(xué)院高分子材料改性工程技術(shù)研究中心，安徽六安 237012)

利用O-羧甲基殼聚糖(O-CMC)的表面多種官能團(tuán)(如-NH2，-OH，-COOH等)與膽酸(CA)進(jìn)行化學(xué)修飾得到兩親性共聚物，再以反溶劑法將Fe3O4和阿霉素(DOX)包埋在兩親性共聚物疏水的核中，制備兩親性的磁性殼聚糖載藥納米粒子，并對(duì)磁性載藥納米粒子的形貌、粒徑大小、磁性、藥物控釋等進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：磁性殼聚糖納米粒子有較高的藥物包埋效率(92.3%)，與自由阿霉素相比，磁性復(fù)合物具有明顯的緩釋作用和pH響應(yīng)性；同時(shí)，有較好的超順磁性。這些說(shuō)明制備的疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子具有雙重響應(yīng)性，有望作為藥物輸送載體對(duì)腫瘤進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤、診斷和治療。

O-羧甲基殼聚糖 Fe3O4阿霉素 控釋

癌癥是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要疾病之一。在抗腫瘤研究領(lǐng)域，雖然許多國(guó)家在過(guò)去的幾十年里都投入了巨額的研究經(jīng)費(fèi)，但在降低癌癥死亡率方面并不是很理想。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因有很多，其中一個(gè)重要原因是缺乏對(duì)腫瘤的早期診斷、檢測(cè)以及療效監(jiān)測(cè)的方法。而早期診斷在很大程度上依賴(lài)于分子影像技術(shù)，如核磁共振成像(MRI)、X射線(xiàn)、CT、PET、超聲和光學(xué)成像等影像技術(shù)，獲取有用的生物學(xué)信息，滿(mǎn)足腫瘤的診斷、監(jiān)測(cè)[1-2]。

目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了多條靶向可控治療途徑，如以抗體識(shí)別直接靶向治療；通過(guò)特殊性能的納米微粒為藥物載體導(dǎo)向治療等。其中，通過(guò)聚合物納米載體實(shí)現(xiàn)藥物的靶向與可控釋放成為了近年來(lái)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。通過(guò)納米載體對(duì)藥物進(jìn)行控制釋放和靶向定位給藥可以在減少藥物用量的情況下有著更好的治療的效果，這些給患者帶來(lái)了許多的便利，也為患者減輕了很大的痛苦[3]。

O-羧甲基殼聚糖(O-CMC)是殼聚糖通過(guò)6位羥基與羧基反應(yīng)得到的，相比于殼聚糖，其好的水溶性、生物相容性、生物活性、抗腫瘤活性等在早期的文獻(xiàn)中已報(bào)道[4-5]。O-CMC表面富含多種官能團(tuán)，如-OH、-NH2和-COOH，利用這些官能團(tuán)，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾便得到不同功能作用的納米粒子。如疏水修飾可以制備兩親性共聚物，在水中自組裝形成膠束，可以將脂溶性分子包埋在其疏水的核中，而親水的殼在納米粒子的表面。基于上述的理論，本文以膽酸疏水修飾的O-CMC為載體制備兩親性的磁性殼聚糖載藥納米粒子，并對(duì)磁性載藥納米粒子的粒徑大小、形貌、磁性、藥物控制等方面進(jìn)行了表征和測(cè)試。

1 試 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

O-羧甲基殼聚糖，分子量10萬(wàn)，生物試劑，山東海得貝海洋生物有限公司；鹽酸阿霉素，純度>98%，浙江海正藥業(yè)有限公司；膽酸(CA)，純度98%，Bio Basic 公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺 (EDC)，分析純，SIGMA-ALDRICH公司；牛血清白蛋白(BSA，Grade Ⅳ)，Amersharm Bioscience公司；N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉(NHS)，分析純，SIGMA-ALDRICH公司；二甲基亞砜(DMSO)分析純，國(guó)藥集團(tuán)。其余試劑未經(jīng)說(shuō)明均為分析純，使用前均未純化，實(shí)驗(yàn)中所有的溶液均用電阻為18.2 MΩ 超純水，經(jīng) 0.45 μm 濾膜過(guò)濾后配制的溶液。

1.2 主要儀器設(shè)備

水浴鍋，長(zhǎng)城科工貿(mào)，W201B型；冷凍干燥儀，寧波新芝，SCIENTZ-10N；傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)賽默飛，IS5，測(cè)試波數(shù)范圍400～4 000 cm-1；X-射線(xiàn)粉末衍射儀，丹東通達(dá)，TD-3500型，測(cè)試角度為20°～80°；納米粒度儀，美國(guó)布魯克海文，90PLUS ZETA型；紫外可見(jiàn)分光光譜，北京普析，TU-1950，測(cè)試波長(zhǎng)范圍為190～700 nm；核磁共振儀(1H-NMR)，美國(guó)賽默飛， NEXUS-470型；動(dòng)態(tài)光散射儀，德國(guó)ALV，ALV/CGS-SF；透射電子顯微鏡，日本電子，JEM-2100plus；磁性分析儀(VSM)，美國(guó)Quantum，MPMS。

1.3 疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的制備

O-羧甲基殼聚糖的疏水性修飾的制備在文獻(xiàn)[6]的方案上進(jìn)行了修改，稱(chēng)取0.200 5 g CA ，0.156 4 g NHS和0.111 8 g EDC，溶于25 mL DMSO，并在避光、30 ℃和氮?dú)鈿夥障禄罨芤褐械哪懰?。活?.5 h后向上述溶液加入0.200 5 g O-羧甲基殼聚糖，繼續(xù)反應(yīng)24 h。所得溶液(O-CMC-CA)用截留分子量為3 500的透析袋對(duì)PBS緩沖液(10 mmol/L,pH7.4磷酸緩沖液含有0.15 mol/L氯化鈉)透析3天，除去沒(méi)有反應(yīng)掉的CA，再對(duì)去離子水透析3天，最后凍干備用。合成的O-CMC-CA共價(jià)復(fù)合物用紅外光譜及核磁共振對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

用共沉淀法制備Fe3O4納米粒子[7]，實(shí)驗(yàn)步驟如下：將0.04 mol FeCl3·6H2O和0.01 mol FeSO4·7H2O在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌充分溶解于50 mL水中，然后，在常溫下，將25 mL 10 mol/L的NaOH的溶液在30 min內(nèi)緩慢滴加到上述溶液中，繼續(xù)攪拌1 h，再升溫至90 ℃，反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后磁分離洗滌至中性，產(chǎn)物烘干備用。

疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的制備：通過(guò)反溶劑的方法，制備不同包埋效率的載藥磁性納米粒子。在殼聚糖的水溶液中加入一定量的有機(jī)溶劑乙醇，在室溫下微攪拌24 h，然后緩慢地將DOX和Fe3O4溶液逐滴加入到膽酸的修飾的羧甲基殼聚糖溶液，并調(diào)節(jié)pH至6.6，在室溫下微攪拌，最終聚合物濃度為4 mg/mL，DOX與聚合物的質(zhì)量比為1∶4，DOX與Fe3O4的質(zhì)量比為1∶1，平衡48 h。溶液全部轉(zhuǎn)移至截留分子量為3 500的透析袋里，對(duì)去離子水透析，直至完全除去乙醇，便得到包埋DOX和Fe3O4的磁性殼聚糖載藥納米粒子。

載藥納米粒子中抗腫瘤藥物阿霉素的包埋效率和負(fù)載量可以利用下面的公式計(jì)算得到。

其中Y表示阿霉素的包埋效率，W0表示投入阿霉素總質(zhì)量，W1表示體系中沒(méi)有包埋的自由的阿霉素質(zhì)量；L表示為阿霉素的包埋量，W2表示疏水修飾的殼聚糖納米粒子的質(zhì)量。

1.4 疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子中DOX體外釋放研究

將0.5 mL納米粒子溶液置于透析袋中(截留分子量為14 000)，然后將透析袋浸入24.5 mL PBS緩沖液或者0.1 mol/L、pH5.0的醋酸緩沖液中。在37C攪拌，每隔一定時(shí)間取出3 mL 釋放介質(zhì)，然后加入3 mL新鮮介質(zhì)。在釋放介質(zhì)中的阿霉素濃度通過(guò)測(cè)量480 nm處的吸光度得到。

2 結(jié)果與討論

2.1 疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的表征

用紅外光譜對(duì)合成的O-羧甲基殼聚糖疏水進(jìn)行表征。圖1A是O-羧甲基殼聚糖的紅外光譜圖，圖1B是用膽酸接枝改性后的O-羧甲基殼聚糖的紅外光譜圖。圖1A中1 634 cm-1是羧甲基中C=O伸縮振動(dòng)的強(qiáng)吸收峰，1 419 cm-1及1 546 cm-1處吸收峰為COO-的對(duì)稱(chēng)及不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰。當(dāng)膽酸接枝到O-羧甲基殼聚糖上時(shí)，在紅外譜圖中1 634 cm-1強(qiáng)吸收峰消失(圖1B)，出現(xiàn)了酰胺Ⅰ帶1 653 cm-1和酰胺Ⅱ帶1 584 cm-1的振動(dòng)峰，這是由于C=O 伸縮振動(dòng)和N-H變形振動(dòng)的組合[8]造成的，證明膽酸接枝在O-羧甲基殼聚糖的氨基上，形成新的酰胺鍵。

圖1 O-CMC(A)和O-CMC-CA(B)的紅外譜圖

2.2 DOX和Fe3O4的包埋效率及長(zhǎng)期穩(wěn)定性

采用納米粒度儀對(duì)磁性殼聚糖載藥納米粒子(DOX/Fe3O4/O-CMC-CA)的水合粒徑和長(zhǎng)期穩(wěn)定進(jìn)行了研究，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中可以看出，載藥納米粒子的水合直徑為182 nm，粒徑分布指數(shù)(PDI)分布在0.24左右，說(shuō)明粒徑分布比較均勻。當(dāng)載藥納米粒子在放置6個(gè)月后(4 ℃)，光散射結(jié)果顯示粒徑變化不大。同時(shí)從表1可以看出，阿霉素在新鮮制備的疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子中的包埋效率和包埋量分別達(dá)到92.3%和10.1%，放置6個(gè)月后包埋效率和包埋量稍有降低，但總體變化不大。這些結(jié)果表明制備的疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的穩(wěn)定性很好。

表1 疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的粒徑和穩(wěn)定性

圖2是所制備的樣品和純的Fe3O4X射線(xiàn)衍射樣品圖(XRD)。疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子與純Fe3O4類(lèi)似，都出現(xiàn)了六個(gè)特征峰，對(duì)照PDF卡片No.19-0629數(shù)據(jù)，2θ=30.54°、36.03°、43.25°、54.13°、57.12°和62.65°的六個(gè)衍射峰可指標(biāo)化為面心立方尖晶石結(jié)構(gòu)Fe3O4的(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)晶面。說(shuō)明聚合物對(duì)Fe3O4的晶體結(jié)構(gòu)并沒(méi)有發(fā)生明顯改變。利用謝樂(lè)(Scherrer)公式[9]計(jì)算(311)晶面可得純的Fe3O4的晶胞粒徑約為12 nm。

圖2 DOX/Fe3O4/O-CMC-CA納米粒子的XRD圖

圖3是疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的形貌。由圖可知，粒子相對(duì)比較均一，許多單個(gè)的Fe3O4成簇聚集在一起被共價(jià)復(fù)合物包裹在核中，構(gòu)成了磁性殼聚糖載藥納米粒子，粒子直徑平均在180 nm左右，與動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)得182 nm的結(jié)果大致相同。

圖3 DOX/Fe3O4/O-CMC-CA納米粒子透射電鏡照片

2.3 疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子中DOX的體外釋放模擬

通常腫瘤組織的pH值比正常組織的pH值低(10～12)，為了考察疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子中抗腫瘤藥物阿霉素在體液中釋放情況，選用pH值分別為7.4和5.0兩種緩沖液來(lái)考察阿霉素的釋放行為(圖4)。從圖4可知，在兩種不同釋放環(huán)境下，疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子釋放DOX的速率都比自由的DOX慢，說(shuō)明具有聚合物對(duì)DOX的釋放行為具有緩釋效果。另外，DOX/Fe3O4/O-CMC-CA納米粒子在pH5.0條件下較pH7.4的釋放速率快，一方面可以降低DOX對(duì)正常組織的毒副作用，另一方面有利于疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子在腫瘤部位釋放藥物。同時(shí)該釋放行為說(shuō)明所制備的疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子具有一定的pH響應(yīng)性。

圖4 載藥磁性納米粒子的體外累積釋放情況

2.4 疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的VSM表征

磁性納米粒子的磁性行為是決定其能否應(yīng)用于造影劑和磁靶向治療的重要因素。用磁性分析儀VSM測(cè)定DOX/Fe3O4/O-CMC-CA納米粒子的磁性行為,如圖5所示，其磁滯曲線(xiàn)在300 K條件下測(cè)得。由圖可知，DOX/Fe3O4/O-CMC-CA納米粒子在室溫下表現(xiàn)出零矯頑力和零剩余磁化強(qiáng)度，說(shuō)明我們制備的DOX/Fe3O4/O-CMC-CA納米粒子具有超順磁性行為。DOX/Fe3O4/O-CMC-CA納米粒子的飽和磁化度(Ms) 是8.1 emu/g，相比純Fe3O4的飽和磁化度78.0 emu/g要小很多。由于Fe3O4在載藥聚合物中的含量減少，同時(shí)，高聚物凝膠化使Fe3O4的自旋無(wú)序[13]，結(jié)果疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的飽和磁化度較低。但根據(jù)文獻(xiàn)，一般認(rèn)為Ms的值在7～22 emu/g范圍可用于生物應(yīng)用[14-16]，因此我們制備的疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子可用于腫瘤核磁共振(MRI)成像，以及可以通過(guò)外加磁場(chǎng)靶向作用將藥物輸送的病灶部位用于治療。

圖5 疏水修飾磁性殼聚糖載藥納米粒子的磁滯曲線(xiàn)

3 結(jié) 論

a) 本文成功合成了疏水修飾的殼聚糖，實(shí)現(xiàn)了其與DOX和Fe3O4的復(fù)合包埋，得到了磁性載藥納米粒子，包埋效率可達(dá)到 90%以上。

b) 該磁性載藥納米粒子具有雙重響應(yīng)性，即pH響應(yīng)性和磁靶向性，可以有效地輸送阿霉素到腫瘤組織和細(xì)胞中，對(duì)腫瘤進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤和診斷，可以實(shí)現(xiàn)MRI診斷和治療一體化。

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Preparation and characterization of hydrophobically modified magnetic drug-loaded chitosan nanoparticles

Hao Hequn1，2，Zheng Huifang1，Zhang jian3*

(1.CollegeofMaterialsandChemicalEngineering，Lu’anAnhui237012，China；2.AnhuiProvincialLaboratoryofBiomimeticSensorandDetectingTechnology，WestAnhuiUniversity，Lu’anAnhui237012，China；3.TheEngineeringTechnologyResearchCenterforModificationofPolymerMaterials，WestAnhuiUniversity，Lu’anAnhui237012，China)

Amphiphilic copolymers were prepared by the chemical modification of cholic acid with O-carboxymethyl chitosan(O-CMC)， while O-CMC have functional groups on the surface， such as-OH，-NH2，-COOH and so on. The magnetic drug-loaded chitosan nanoparticles were prepared by embedding Fe3O4and doxorubicin (DOX) in their hydrophobic nuclei using the antisolvent method. The morphology， size， magnetism， drug release of the nanoparticles was studied. The research results showed that the magnetic chitosan nanoparticles had higher drug entrapment efficiency (92.3%). Compared with free adriamycin， the magnetic complexes have obvious sustained-release and pH-responsive properties. Meanwhile， they have better superparamagnetic magnetic properties. These results indicated that hydrophobic modified magnetic chitosan nanoparticles can expected to be used as a drug delivery carrier to track， diagnose and treat tumors in real time.

O-carboxymethyl chitosan; Fe3O4; doxorubicin; controlled release

2017-01-04

安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目gxyqZD2016245和大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃201610376008。

郝和群(1978-)，女，安徽無(wú)為人，講師，博士，研究方向?yàn)樯镝t(yī)用高分子材料。

0636.1

A 章編號(hào)：1006-334X(2017)01-0015-04

*通訊作者: 張艦，zhangjianhhq@163.com。