李明，李全利，方望，湯健

(1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，合肥230022；2安徽醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院；3安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院)

·基礎研究·

Gel-HA-M復合材料聯(lián)合鈦網(wǎng)固定修復兔股骨缺損效果觀察

李明1，李全利2，方望3，湯健1

(1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，合肥230022；2安徽醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院；3安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院)

目的探討明膠-羥基磷灰石-米諾環(huán)素(Gel-HA-M)復合材料聯(lián)合鈦網(wǎng)固定對兔股骨缺損的修復作用。方法將30只雄性新西蘭大白兔隨機分為復合材料組、自體骨對照組及空白對照組，每組10只。三組均建立股骨缺損模型(缺損長度12～15 mm)，復合材料組植入Gel-HA-M復合材料聯(lián)合鈦網(wǎng)固定，自體骨對照組植入自體股骨聯(lián)合鈦網(wǎng)固定，空白對照組僅行鈦網(wǎng)固定。三組分別于術后4、8、12周隨機選取3、3、4只兔，處死后取出股骨行大體觀察、X線檢查，HE染色后觀察組織病理情況。結果術后4周：復合材料組植入材料與周圍骨組織界限稍模糊，X線檢查顯示鈦網(wǎng)周圍無明顯骨痂形成，HE染色可見片狀、條索狀、網(wǎng)狀軟骨樣基質(zhì)形成；自體骨對照組可見自體骨與斷端部分愈合，X線檢查顯示鈦網(wǎng)周圍無明顯骨痂形成，HE染色可見大量網(wǎng)狀編織骨形成；空白對照組有2只存在感染跡象，X線檢查顯示鈦網(wǎng)周圍無明顯骨痂形成，HE染色未見連續(xù)性骨樣基質(zhì)形成。術后8周：復合材料組植入材料的硬度與周圍骨組織接近，X線檢查顯示鈦網(wǎng)周圍骨痂逐漸增多，HE染色可見新生骨組織明顯增多，形成網(wǎng)狀致密的骨小梁組織；自體骨對照組骨缺損處基本愈合，X線檢查顯示鈦網(wǎng)周圍骨痂逐漸增多，HE染色可見新生骨組織進一步成熟，骨組織鈣化較之前增強；空白對照組未形成骨性愈合，X線檢查顯示鈦網(wǎng)周圍無明顯骨痂形成，HE染色未見連續(xù)性骨樣基質(zhì)形成。術后12周：復合材料組骨缺損區(qū)已達到骨性愈合，X線檢查顯示鈦網(wǎng)周圍大量骨痂形成、兩斷端連接，HE染色可見新生骨組織逐漸成熟，伴髓腔形成；自體骨對照組骨缺損區(qū)基本達到骨性愈合，X線檢查顯示鈦網(wǎng)周圍大量骨痂形成、兩斷端連接，HE染色可見編織樣骨組織趨于有序性排列；空白對照組斷端仍未形成骨性連接，X線檢查顯示鈦網(wǎng)周圍少量骨痂形成，HE染色未見連續(xù)性骨樣基質(zhì)形成，伴有纖維結締組織及炎性細胞大量增生。結論Gel-HA-M復合材料聯(lián)合鈦網(wǎng)固定對兔股骨缺損的修復效果與自體骨的修復效果相當，并有助于減少感染發(fā)生，是一種效果較好的人工合成骨缺損修復材料。

骨缺損；股骨；明膠；羥基磷灰石；米諾環(huán)素；鈦網(wǎng)；兔

近年來因創(chuàng)傷骨折、感染和骨腫瘤等引起的骨缺損患者日益增多，而較大的骨缺損常常無法自我修復[1]。臨床上常用自體骨移植或者用同種異體骨和動物源性的異種骨移植來修復骨缺損，但自體骨移植取材量有限且存在二次傷害[2,3]，同種異體骨和動物源性的異種骨移植有傳播疾病和免疫排斥的風險[4]，因此人工合成骨缺損修復材料逐漸成為研究熱點。羥基磷灰石與人體骨骼成分及結構相似，可被體內(nèi)的細胞及大分子識別，具有較高的生物活性、骨傳導性和生物相容性[5]。明膠是膠原的降解產(chǎn)物，具有低抗原性、無毒性、溶于水等優(yōu)點，可被機體吸收并刺激移植組織產(chǎn)生新的膠原，廣泛應用于人造皮膚、骨移植物等人工組織學領域，具有促進細胞黏附、增殖和分化的特性[6]。2013年1月～2016年11月，本研究采用新型納米復合材料明膠-羥基磷灰石-米諾環(huán)素(Gel-HA-M)聯(lián)合鈦網(wǎng)固定修復兔股骨缺損，取得了較好效果?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：健康新西蘭大白兔30只，體質(zhì)量(3.0±0.3)kg，均為雄性，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。Gel-HA-M原料：CaCl2·2H2O、NaF、明膠、Na2HPO4·12H2O購于美國Sigma公司，鹽酸米諾環(huán)素(純度99%)購于武漢遠程科技發(fā)展有限公司。鈦網(wǎng)：為寶雞鈦金屬公司生產(chǎn)的醫(yī)用純鈦金屬，采用純鈦材料制成0.8 cm厚鈦板，沖壓制孔，直徑1.2 mm、孔間距0.6 mm。

1.2 Gel-HA-M復合材料合成 溶液A：將12.191 g CaCl2·2H2O溶于250 mL蒸餾水中。溶液B：將17.9 g Na2HPO4·12H2O溶于250 mL蒸餾水中，取8.365 g明膠在37～40 ℃條件下溶于其中，加入0.7g NaF，待其完全溶解后，用1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值，使反應體系的pH值維持在10～11。溶液C：將0.334 67 g鹽酸米諾環(huán)素溶于50 mL蒸餾水。通過仿生合成原理，將溶液A緩慢滴入溶液B，參照上法調(diào)節(jié)溶液pH值，整個反應過程在水浴鍋中(保持溫度為40～44 ℃)、有磁力攪拌的條件下進行。待二者完全相溶后，將pH值調(diào)至7，再緩慢滴入溶液C，反應體系攪拌3 h后，40 ℃恒溫下靜置過夜。收集產(chǎn)品，離心，去離子水攪拌洗滌后離心3遍，冷凍干燥，即可得到淡黃色的Gel-HA-M，說明米諾環(huán)素已經(jīng)融入復合材料中。將材料壓縮制備成顆粒狀，鈷60照射消毒1 h后備用。取少量粉末于4 mL EP管中，加入99%乙醇，在超聲波中分散半小時，噴金后于SEM掃描電鏡下觀察材料形態(tài)。結果顯示，Gel-HA-M復合材料的形態(tài)主要為長梭形，長度約200 nm，寬度約57 nm。

1.3 骨缺損模型建立及分組處理 將30只大白兔按照隨機數(shù)字表法分為復合材料組、自體骨對照組及空白對照組，每組10只。三組均耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液1 mL/kg進行全身麻醉，麻醉起效后取側臥位，兔右后肢備皮，常規(guī)消毒鋪巾。于兔右股部中段外側縱行切開3～4 cm，循股四頭肌外側與股后肌群間隙進入，鈍性分離肌組織和周圍軟組織，暴露股骨骨干，不進行骨膜下剝離。于股骨中段用電鋸造成12～15 mm(為兔股骨干直徑1.5倍左右)的缺損，即建立兔股骨缺損模型。復合材料組將1.2中合成的Gel-HA-M復合材料植入股骨缺損處，將鈦網(wǎng)裁剪塑型成管狀，固定在缺損股骨的近、遠端并包繞Gel-HA-M復合材料；自體骨對照組將鋸下的股骨用生理鹽水沖洗，然后重新植入股骨缺損處，鈦網(wǎng)固定缺損股骨兩端并包繞自體股骨；空白對照組不植入任何材料，只采用鈦網(wǎng)固定缺損股骨兩端。三組關閉切口后均未注射抗生素。

1.4 骨缺損愈合情況觀察 ①大體情況：三組分別于術后4、8、12周隨機選擇3、3、4只兔，耳緣靜脈注射空氣進行處死。取出右下肢，去除軟組織，肉眼觀察植入材料與骨缺損界面的生長情況。②X線檢查情況：各組大體情況觀察完成后進行右下肢X線檢查，觀察鈦網(wǎng)固定及鈦網(wǎng)周圍骨痂形成情況。③組織病理情況：各組X線檢查完成后，取部分骨缺損組織，甲醛固定，甲酸脫鈣，石蠟包埋，3 μm厚度切片，常規(guī)HE染色，100倍顯微鏡下觀察組織病理變化。

2 結果

2.1 各組大體情況比較 術后4周：復合材料組手術切口基本愈合，無感染跡象，植入材料顏色變淡，與周圍骨組織界限模糊，其硬度明顯增加，與周圍骨組織硬度接近；自體骨對照組可見自體骨與斷端部分愈合；空白對照組有2只存在感染跡象，骨缺損區(qū)可見膿性積液，骨折端吸收，隨后補充2只納入空白對照組。術后8周：復合材料組鈦網(wǎng)周圍有大量骨痂生成，植入物材料的硬度與周圍骨組織接近，無炎癥反應；自體骨對照組可見骨缺損處基本愈合；空白對照組未形成骨性愈合，部分軟組織增生嵌入，兩斷端可見部分骨吸收。術后12周：復合材料組鈦網(wǎng)周圍骨痂進一步增多，與鈦網(wǎng)和股骨干形成一個整體，用咬骨鉗去除鈦網(wǎng)后，可見骨缺損區(qū)已達到骨性愈合。自體骨對照組可見骨缺損區(qū)骨折線模糊，基本達到骨性愈合。空白對照組骨缺損處有少量骨痂形成，但斷端仍未形成骨性連接。

2.2 各組X線檢查結果比較 三組術后4、8、12周股骨復位均滿意，股骨干力線對位良好，均無明顯側方移位、成角、分離等畸形，鈦網(wǎng)無明顯移位或松動跡象。三組術后4周均無明顯骨痂形成；復合材料組、自體骨對照組術后8、12周鈦網(wǎng)周圍骨痂逐漸增多，術后12周鈦網(wǎng)周圍大量骨痂形成，大部分區(qū)域有連續(xù)性骨癡生成，兩斷端連接，并包裹鈦網(wǎng)；而空白對照組術后8周鈦網(wǎng)周圍無明顯骨痂形成，術后12周鈦網(wǎng)周圍僅少量骨痂形成。

2.3 各組組織病理情況比較 術后4周：復合材料組可見片狀、條索狀、網(wǎng)狀軟骨樣基質(zhì)形成，軟骨周圍可見原始骨小梁組織，新生骨基質(zhì)周圍可見大量軟骨細胞和成骨細胞，軟骨內(nèi)成骨反應活躍；自體骨對照組可見大量網(wǎng)狀編織骨形成，骨細胞散在分布在骨組織中。術后8周：復合材料組可見新生骨組織明顯增多，形成網(wǎng)狀致密的骨小梁組織，并可見成骨細胞排列在骨小梁周圍；自體骨對照組可見新生骨組織進一步成熟，骨組織鈣化較之前增強。術后12周：復合材料組可見軟骨樣基質(zhì)明顯減少，新生骨組織逐漸成熟，形成板層骨并排列有序，可見髓腔形成。自體骨對照組可見編織樣骨組織趨于有序性排列及骨小梁應力性改變?？瞻讓φ战M術后4、8、12周均未見連續(xù)性骨樣基質(zhì)形成，伴有纖維結締組織及炎性細胞大量增生。

3 討論

骨缺損的修復是組織工程學的一部分，為了使骨折斷端重新形成骨性連接，需要在骨缺損處建立良好的修復條件，如手術去除斷端內(nèi)的骨折碎片、解剖復位后穩(wěn)定骨折端以及骨修復材料填充骨缺損區(qū)域以避免骨不連修復等[7,8]。由于天然骨組織主要是以明膠作為有機物和羥基磷灰石作為礦物質(zhì)而構成的，因此研究較多的是羥基磷灰石和明膠的復合物[9,10]。

目前，人工合成骨缺損修復材料在抗感染方面仍存在一些問題，如材料本身及其降解產(chǎn)物引起的炎癥反應、細菌感染、長期靜脈應用抗生素導致的耐藥、體內(nèi)藥物毒性積累等。如能將抗生素溶入骨修復材料中，可使材料在發(fā)揮骨修復作用的同時，緩慢釋放廣譜抗生素，在骨缺損處形成一個局部抗菌環(huán)境，既能減少炎癥反應和細菌感染的發(fā)生，又能避免長期全身應用抗生素帶來的毒副作用。作為廣譜抗生素，米諾環(huán)素對G+、G-及厭氧菌均具有較強的抑制作用，對骨組織親和力強，且近年來研究發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素對成骨細胞也有一定的作用[11]。臨床研究表明，人體可在不高于200 mg/d的劑量下安全耐受米諾環(huán)素[12]，體外實驗也證實復合物中加入米諾環(huán)素可通過緩釋作用發(fā)揮抑菌效果[13]。本研究合成的Gel-HA-M復合材料長度約為200 nm、寬度約為57 nm，這種納米結構能夠增加材料的粗糙度、親水性、蛋白吸附性和原始細胞黏附性，具有良好的生物相容性[14,15]；不但具有良好的促進骨再生和抗感染作用，且無需加入生長因子、骨形成蛋白等。

本研究結果顯示，復合材料組未見感染，組織病理學觀察亦未見炎癥反應，術后各時間點復合材料組及自體骨對照組局部骨小梁形成情況、骨性愈合情況均明顯優(yōu)于空白對照組；說明Gel-HA-M復合材料聯(lián)合鈦網(wǎng)固定對兔股骨缺損的修復效果較好，并有助于減少感染發(fā)生，其效果與自體股骨移植聯(lián)合鈦網(wǎng)固定相當。Gel-HA-M復合材料有望成為一種更經(jīng)濟、有效的人工合成骨缺損修復材料。

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安徽省科技攻關計劃項目(1301042096)。

湯健(E-mail： tangjiancm@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.009

R687.3

A

1002-266X(2017)32-0033-03

2016-12-19)