HPLC法測(cè)定葆宮止血顆粒中三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Rb1的含量

李銘

[摘要]目的 建立測(cè)定葆宮止血顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1以及人參皂苷Rb1含量的HPLC法。方法 采用安捷倫Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm），以乙腈-水為流動(dòng)相梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。結(jié)果 三七皂苷R1和人參皂苷Rg1，Rb1的線性范圍分別為0.277～5.540 μg（r=0.9998），0.253～5.060 μg（r=0.9998），0.262～5.230 μg（r=0.9997）。平均加樣回收率分別為89.5%（RSD=2.70%）、91.0%（RSD=1.87%）和90.8%（RSD=1.74%）（n=6）。結(jié)論 該方法快速簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于葆宮止血顆粒中三七的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]葆宮止血顆粒；三七皂苷R1；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1；高效液相色譜法

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）02（a）-0016-04

[Abstract] Objective To establish the determination of the content of Notoginsenoside R1，Ginsenoside Rg1 and Rb1 in Uterus-Repairing Hemostasis Granules by using HPLC.Methods By using the Agilent Eclipse XDB-C18 column （250 mm×4.6 mm），the acetonitrile-water was adopted to perform mobile phase gradient elution at flow rate of 1.0 ml/min；and the detection wavelength was 203 nm.Results The linear scope of Notoginsenoside R1，Ginsenoside Rg1 and Rb1 ranged from 0.277 to 5.540 μg （r=0.9998），from 0.253 to 5.060 μg （r=0.9998），from 0.262 to 5.230 μg （r=0.9997）.The average recovery rate was 89.5% （RSD=2.70%），91.0% （RSD=1.87%） and 90.8% （RSD=1.74%） （n=6）.Conclusion As a simple，reproducible and accurate method，it can be used for quality control of pseudo-ginseng in Uterus-Repairing Hemostasis Granules.

[Key words]Uterus-Repairing Hemostasis Granules；Notoginsenoside R1；Ginsenoside Rg1；Ginsenoside Rb1；HPLC

葆宮止血顆粒是由牡蠣、白芍、側(cè)柏葉、地黃、金櫻子、柴胡、三七、仙鶴草、椿皮、大青葉等十味藥制成的中藥復(fù)方制劑，為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)中藥第六十九冊(cè)收載品種，具有固經(jīng)止血，滋陰清熱之功效，臨床上用于沖任不固、陰虛血熱所致月經(jīng)過(guò)多、經(jīng)期延長(zhǎng)，經(jīng)色深紅、質(zhì)稠，或有小血塊、腰膝酸軟、咽干口燥、潮熱心煩、舌紅少津、苔少或無(wú)苔、脈細(xì)數(shù)；功能性子宮出血及上環(huán)后子宮出血等癥狀。葆宮止血顆粒其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)三七只有薄層鑒別而未做含量測(cè)定，為進(jìn)一步完善此產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效地進(jìn)行全面質(zhì)量控制，有必要對(duì)三七的有效成分進(jìn)行含量測(cè)定。目前測(cè)定三七主要有效成分含量的方法多采用高效液相色譜法梯度洗脫[1-17]，選用紫外檢測(cè)器[1-14]、蒸發(fā)光檢測(cè)器[15-17]進(jìn)行測(cè)定。也有用超高效液相色譜法[18]測(cè)定三七中的有效成分，但該法對(duì)儀器要求比較高，設(shè)備較昂貴，不易普及。本文參考文獻(xiàn)報(bào)道[1-14]，研究建立同時(shí)測(cè)定葆宮止血顆粒中三七主要有效成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1以及人參皂苷Rb1含量的高效液相色譜方法。該方法操作簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于該制劑中三七的質(zhì)量控制。

1儀器與試藥

美國(guó)安捷倫1260高效液相色譜儀，包括低壓四元梯度泵，真空脫氣機(jī)，二極管陣列紫外檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱；AE240電子分析天平（十萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）

人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)：110704-200921，中國(guó)食品藥品檢定研究所提供，供含量測(cè)定用）；人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)：110703-201027，中國(guó)食品藥品檢定研究所提供，供含量測(cè)定用）；三七皂苷R1對(duì)照品（批號(hào)：110745-201318，中國(guó)食品藥品檢定研究所提供，供含量測(cè)定用）；葆宮止血顆粒（批號(hào)：1403013， 1407050，1505005），為市售品；乙腈為色譜純，水為超純水，其他檢測(cè)用試劑為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為水，梯度洗脫，0～60 min（10%～60% A），60～70 min（60% A），70～80 min（60%～10% A），80～95 min（10% A）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；進(jìn)樣量為10 μl；柱溫為30℃。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的人參皂苷Rb1對(duì)照品10.46 mg，人參皂苷Rg1對(duì)照品10.12 mg，三七皂苷R1對(duì)照品11.08 mg，分別置于20 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1，三七皂苷R1對(duì)照品儲(chǔ)備液各5 ml置20 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1毫升中含人參皂苷Rb1 130.75 μg，人參皂苷Rg1 126.5 μg， 三七皂苷R1 138.5 μg的對(duì)照品混合溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取本品5包內(nèi)容物，精密稱定，研細(xì)，稱取約7.5 g細(xì)粉重量，置于50 ml量瓶中，加甲醇約40 ml，超聲處理30 min，取出放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，濾液水浴蒸干，殘?jiān)铀?0 ml 使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次10 ml，合并正丁醇提取液，用水洗滌2次，每次15 ml，取正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)? ml甲醇分3次溶解轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液作為供試品溶液。

2.2.3三七陰性對(duì)照溶液的制備 按藥品標(biāo)準(zhǔn)中的處方和制法制備不含三七的陰性樣品，照供試品溶液的制備方法操作制備三七陰性對(duì)照溶液。

2.3方法專屬性試驗(yàn)

精密量取上述對(duì)照品混合溶液，供試品溶液，陰性對(duì)照溶液各10 μl注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果三七皂苷R1的保留時(shí)間為21.3 min，人參皂苷Rg1的保留時(shí)間為22.8 min，人參皂苷Rb1的保留時(shí)間為32.5 min，樣品各組分分離良好，陰性樣品對(duì)三七皂苷R1和人參皂苷Rg1以及人參皂苷Rb1的測(cè)定無(wú)干擾，表明此方法的專屬性良好，見圖1。

2.4線性關(guān)系考察試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品混合溶液2，4，10，20，40 μl注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程Y人參皂苷Rb1=2.26×102X+0.446（r=0.9997），Y人參皂苷Rg1=6.44×102X+0.50（r=0.9998），Y三七皂苷R1=1.41×102X+0.17（r=0.9998）。結(jié)果表明，人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1，三七皂苷R1峰面積與進(jìn)樣量在0.262～5.230 μg，0.253～5.060 μg，0.277～5.540 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品混合溶液10 μl，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得三七皂苷R1峰面積的RSD為0.51%，人參皂苷Rg1峰面積的RSD為0.42%，人參皂苷Rb1峰面積的RSD為0.66%，表明分析方法精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液10 μl，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)行測(cè)定，按上述色譜條件下測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果三七皂苷R1峰面積的RSD為0.84%，人參皂苷Rg1峰面積的RSD為0.75%，人參皂苷Rb1峰面積的RSD為1.1%。測(cè)定結(jié)果表明在12 h內(nèi)供試品溶液中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積無(wú)明顯變化，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（批號(hào)：1403013）共6份，按供試品溶液的制備方法平行配制六份供試品溶液，同法測(cè)定，測(cè)得三七皂苷R1的含量為3.72 mg/包，RSD為2.33%，人參皂苷Rg1的含量為3.38 mg/包，RSD為1.75%，人參皂苷Rb1的含量為4.10 mg/包，RSD為1.88%，表明方法有較好的重復(fù)性。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

取同一批號(hào)（批號(hào)：1403013，平均裝量：15.316 g/包）的已知含量樣品5包，取顆粒研細(xì)混勻，稱取約3.75 g細(xì)粉重量，精密稱定，共6份，分別置50 ml量瓶中，精密加入上述3種對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 ml，加甲醇約40 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，按上述色譜條件下測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的平均回收率分別為89.5%（RSD為2.70%），91.0%（RSD為1.87%），90.8%（RSD為1.74%）（表1）。

2.9樣品含量測(cè)定

分別精密稱取不同批的葆宮止血顆粒，按上述供試品溶液的制備方法配制供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品混合溶液和供試品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。3個(gè)批號(hào)樣品中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1以及人參皂苷Rb1的含量測(cè)定結(jié)果見表2。

3討論

3.1流動(dòng)相的選擇

由于本品為中藥復(fù)方制劑，影響含量測(cè)定的干擾因素也較多，色譜圖中的峰較多，故對(duì)分離度要求較高。參考文獻(xiàn)[1-4]方法中的流動(dòng)相測(cè)定均不理想。后經(jīng)過(guò)探索乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸溶液，甲醇-0.1%磷酸溶液等不同的洗脫體系，不同的梯度洗脫程序，最終采用乙腈-水洗脫體系，按方法“2.1”項(xiàng)下的梯度洗脫程序使三七中3種主要的皂苷類成分獲得完全分離，峰形、理論板數(shù)都比較理想，基線漂移不明顯，該色譜條件可用于該制劑的含量測(cè)定。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)紫外掃描，得到三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1三者均在200～210 nm有較大吸收峰，再通過(guò)實(shí)驗(yàn)考察表明在波長(zhǎng)為203 nm時(shí)三者均有較好的響應(yīng)值，故本實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。

3.3樣品的提取

文獻(xiàn)報(bào)道中樣品的提取方法有甲醇超聲提取[5-8]、70%乙醇超聲提取[9]、水飽和的正丁醇超聲提取[10]、甲醇微沸2 h提取[11]、甲醇加熱回流1～2 h提取[12-14]。由于樣品中的三七總皂苷易溶于甲醇，綜合考慮操作的簡(jiǎn)便，采取對(duì)樣品加甲醇進(jìn)行超聲提取，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同超聲提取時(shí)間（10、20、30、40、50 min）進(jìn)行考察，結(jié)果顯示超聲提取30 min就可使樣品中的三七總皂苷完全提取出來(lái)，提取液經(jīng)水浴蒸干，殘?jiān)铀芙夂?，再用水飽和的正丁醇振搖提取，去除樣品中的一些其他成分干擾，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同水飽和的正丁醇提取液體積（20，10 ml），提取次數(shù)（2，3次）的進(jìn)行考察，經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察用水飽和的正丁醇提取3次（10，10，10 ml）就可將三七總皂苷提取完全。

3.4檢測(cè)器的選擇

相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1，其作為一種通用型檢測(cè)器，由于流動(dòng)相在檢測(cè)前就已蒸發(fā)，提高了基線的穩(wěn)定性，不會(huì)產(chǎn)生基線漂移，但由于該檢測(cè)器的基線噪音大，也影響了檢測(cè)的靈敏度，而采用紫外檢測(cè)器，基線噪音小，并且采用合理的梯度洗脫程序，使得基線漂移并不明顯。另外蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定時(shí)樣品濃度與峰面積呈對(duì)數(shù)線性關(guān)系，因此要采用對(duì)數(shù)計(jì)算?？紤]測(cè)定和計(jì)算的簡(jiǎn)便性，最終采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。

3.5本實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法梯度洗脫同時(shí)測(cè)定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量，經(jīng)方法學(xué)研究，結(jié)果表明該方法重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，回收率好，專屬性較強(qiáng)。且方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于葆宮止血顆粒中三七的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2016-12-09 本文編輯：顧雪菲）