香芪生乳合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

黃懿++++++潘濤+++++++田霞++++++肖作奇

[摘要]目的 建立香芪生乳合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法（TLC）對(duì)香芪生乳合劑中主要藥味進(jìn)行薄層色譜定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定制劑中芍藥苷的含量。結(jié)果 TLC可對(duì)制劑中當(dāng)歸、川芎、白芍、木香、黃芪等藥材進(jìn)行鑒別，斑點(diǎn)清晰，方法簡(jiǎn)單易行，專(zhuān)屬性好。HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，芍藥苷最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為231 nm，21.1～421.5 μg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，平均回收率為98.6%，RSD為1.7%。結(jié)論 該研究方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于香芪生乳合劑的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]香芪生乳合劑；芍藥苷；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法

[中圖分類(lèi)號(hào)] R943 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）10（c）-0008-05

[Abstract]Objective To establish the quality standard of Xiangqi Shengru Mixture.Methods Identification of main herbal medicines in Xiangqi Shengru Mixture were performed by TLC.The main effective component of paeoniflorin was determined by HPLC.Results Identification of Angelicae Sinensis Radix，Chuanxiong Rhizoma， Radix Paeoniae Alba，Aucklandiae Radix and Astragali Radix and so on was established by TLC.The method was simple，the spots were clear with highly specific attribute.HPLC detection results showed that the best detection wavelength was 231 nm，the linear range of the paeoniflorin was 21.1～421.5 μg/ml，the range of the spotting recovery rate was 98.6%，and RSD was 1.7%.Conclusion The method can be used for the quality control of Xiangqi Shengru Mixture，and it is simple，accurate with good repeatability and specificity.

[Key words]Xiangqi Shengru Mixture；Paeoniflorin；Quality standard；TLC；HPLC

香芪生乳合劑是由白芍、當(dāng)歸、通草、川芎、木香、黃芪等12味藥材制成的中藥復(fù)方制劑，有益氣養(yǎng)血、通經(jīng)下乳的作用，用于產(chǎn)后氣血虧損，乳汁不足。方中白芍、當(dāng)歸養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、補(bǔ)血和血；川芎、木香行氣、止痛，黃芪益氣、固脫，諸藥合用起到益氣養(yǎng)血、通經(jīng)下乳的作用。該制劑為湖南省婦幼保健院醫(yī)院制劑，年產(chǎn)值200余萬(wàn)元，臨床療效確切。為更好地控制該制劑質(zhì)量，參照文獻(xiàn)報(bào)道相關(guān)研究方法[1-7]，本研究采用薄層色譜法（TLC）建立當(dāng)歸、川芎、白芍、木香、黃芪等藥材的定性鑒別方法；采用高效液相色譜法（HPLC）建立處方中主要有效成分芍藥苷的含量測(cè)定方法。

1材料與方法

1.1儀器與試藥

電子分析天平（德國(guó)，Mettler Toledo XS205型，精度為0.1 mg），超聲清洗器（上?？茖?dǎo)，HS-2060），高效液相色譜儀（日本島津，LC-20A型），二極管陣列檢測(cè)器（日本島津，SPD-M20A），柱溫箱（日本島津，CTO-10AS）。

0.22 μm微孔濾膜（美國(guó)，密理博），薄層層析硅膠（中國(guó)青島海洋化工集團(tuán)公司），水（娃哈哈純凈水），乙腈（美國(guó)，Tedia，色譜純），其他常用試劑均為分析純。對(duì)照品及對(duì)照藥材均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，詳細(xì)情況如下：當(dāng)歸對(duì)照藥材（批號(hào)：120927～201014，供鑒別用），川芎對(duì)照藥材（批號(hào)：120918～200809，供鑒別用），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736～200833，供含量測(cè)定用），木香對(duì)照藥材（批號(hào)：120921～200607，供鑒別用），去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：111525～201008，供含量測(cè)定用），黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781～200613，供含量測(cè)定用）。香芪生乳合劑由湖南省婦幼保健院藥學(xué)部制劑室提供樣品（批號(hào)：150828， 151210）。

1.2當(dāng)歸、川芎的鑒別

取香芪生乳合劑（批號(hào)：150828，151210）20 ml，每次用乙酸乙酯20 ml振搖提取2次，過(guò)濾，取濾液蒸干，加乙酸乙酯1.0 ml溶解，即得供試品溶液。另分取當(dāng)歸對(duì)照藥材0.5 g和川芎對(duì)照藥材0.5 g，分別加20 ml乙酸乙酯，超聲20 min，過(guò)濾，取濾液蒸干，加乙酸乙酯1.0 ml溶解，即得對(duì)照藥材溶液。陰性對(duì)照溶液的制備：按處方稱(chēng)取除當(dāng)歸和川芎的其他藥材，制成陰性對(duì)照樣品。按《中國(guó)藥典》2015年版TLC試驗(yàn)[8]，取上述四種溶液各10 μl，點(diǎn)于薄層板上，展開(kāi)劑：環(huán)己烷∶乙酸乙酯（9∶1），展開(kāi)10 cm，取出，晾干，置365 nm紫外光燈下檢視，拍照記錄。

1.3白芍的鑒別

取香芪生乳合劑（批號(hào)：150828，151210）50 ml，用30 ml水飽和的正丁醇振搖提取2次，過(guò)濾，取濾液，用15 ml氨試液洗滌2次，棄去洗液，再用以20 ml正丁醇飽和的水洗滌2次，棄去洗液，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?.0 ml溶解，即得供試品溶液。另取稱(chēng)取芍藥苷對(duì)照品0.5 mg，加甲醇1.0 ml溶解，即得對(duì)照品溶液。陰性對(duì)照溶液的制備：按處方取除白芍的其他藥材，制成缺白芍的陰性。按《中國(guó)藥典》2015年版TLC試驗(yàn)[8]，吸取上述三種溶液各10 μl，點(diǎn)于薄層板上，展開(kāi)劑：三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸（40∶5∶10∶0.2），展開(kāi)10 cm，取出晾干，噴5%香草醛硫酸溶液顯色，105℃加熱至斑點(diǎn)清晰，拍照記錄。

1.4木香的鑒別

取香芪生乳合劑（批號(hào)：150828，151210）50 ml，30 ml乙酸乙酯振搖提取2次，過(guò)濾取乙酸乙酯液，水浴揮干，殘?jiān)右宜嵋阴?.0 ml 溶解，即得供試品溶液。另稱(chēng)取木香對(duì)照藥材0.5 g，加20 ml乙酸乙酯，超聲20 min，濾過(guò)取濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴?.0 ml 溶解，即得對(duì)照藥材溶液。另取去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每毫升含0.5 mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。陰性對(duì)照溶液的制備：按處方稱(chēng)取除木香的其他藥材，制成缺木香的陰性。按《中國(guó)藥典》2015年版TLC試驗(yàn)[8]，吸取上述三種溶液各10 μl，點(diǎn)于薄層板上，展開(kāi)劑：環(huán)己烷∶丙酮（10∶3），展開(kāi)10 cm，取出晾干，噴5%香草醛硫酸溶液顯色，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，拍照記錄。

1.5黃芪的鑒別

稱(chēng)取黃芪甲苷對(duì)照品0.5 mg，加甲醇1.0 ml溶解，即得對(duì)照品溶液。陰性對(duì)照溶液的制備：按處方稱(chēng)取除黃芪的其他藥材，制成缺黃芪的陰性對(duì)照。按《中國(guó)藥典》2015年版TLC試驗(yàn)[8]，取上述對(duì)照和陰性及“1.3”項(xiàng)下的供試品溶液各10 μl，點(diǎn)于同一薄層板上，展開(kāi)劑：三氯甲烷∶甲醇∶水（65∶35∶10）的下層溶液，展開(kāi)10 cm，取出晾干，噴10%硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置365 nm紫外光燈觀察，拍照記錄。

1.6芍藥苷的含量測(cè)定方法

1.6.1色譜條件 色譜柱：色譜柱（Agilent TC-C18，4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（15∶85）；流速： 1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：231 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量為10 μl。

1.6.2樣品液制備 對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取經(jīng)過(guò)減壓干燥后的芍藥苷對(duì)照品8.43 mg，放置于20 ml容量瓶中，適量甲醇溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（每毫升含芍藥苷421.5 μg）。

供試品溶液制備：取香芪生乳合劑5 ml于10 ml容量瓶中，用色譜甲醇定容，搖勻，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

陰性對(duì)照溶液制備：按香芪生乳合劑的處方稱(chēng)取除白芍外的其他藥材，按制劑生產(chǎn)工藝制備，取樣品溶液5 ml于10 ml容量瓶中，用色譜甲醇定容，搖勻，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得陰性對(duì)照溶液。

1.6.3專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密吸取“1.6.2”項(xiàng)下各溶液，按“1.6.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。

1.6.4線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取“1.6.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、8、10 ml，分別置于10 ml的容量瓶中，加水定容，搖勻，即為不同濃度的對(duì)照品溶液，分別取對(duì)照品溶液，按“1.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析。

1.6.5精密度試驗(yàn) 精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液，按“1.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)6 次，記錄芍藥苷峰面積。

1.6.6重復(fù)性試驗(yàn) 采用同一批次制劑樣品（20160130），按“1.6.2”項(xiàng)下方法平行制備6批供試品溶液，分別按“1.6.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄芍藥苷峰面積。

1.6.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱(chēng)供試品溶液，按“1.6.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、1、2、4、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄芍藥苷峰面積。

1.6.8加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的香芪生乳合劑9份于10 ml容量瓶中，每份2.5 ml，分別按含量80%、100%、120%精密加入一定量的對(duì)照品，加水2.5 ml，加甲醇定容，每個(gè)濃度平行制備3份，取適量溶液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。按“1.6.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。

1.6.9樣品的測(cè)定 按“1.6.2”中方法制備得到供試品溶液（批號(hào)為150828、151210、160130），按“1.6.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中芍藥苷含量。

2結(jié)果

2.1當(dāng)歸、川芎的鑒別

當(dāng)歸、川芎的鑒別結(jié)果見(jiàn)圖1。供試品與對(duì)照藥材相同的位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性在相關(guān)位置無(wú)斑點(diǎn)。

2.2白芍的鑒別

白芍的鑒別結(jié)果見(jiàn)圖2。供試品與對(duì)照品在相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性在相關(guān)位置無(wú)斑點(diǎn)。

2.3木香的鑒別

木香的鑒別結(jié)果見(jiàn)圖3。供試品與對(duì)照品相同的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性在相關(guān)位置無(wú)斑點(diǎn)。

2.4黃芪的鑒別

黃芪的鑒別結(jié)果見(jiàn)圖4。供試品與對(duì)照品相同的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性在相關(guān)位置無(wú)斑點(diǎn)。

2.5芍藥苷的含量測(cè)定結(jié)果

2.5.1專(zhuān)屬性試驗(yàn) 專(zhuān)屬性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。芍藥苷與相鄰其他色譜峰的分離度>1.5，拖尾因子符合要求（0.995），按芍藥苷計(jì)算，理論塔板數(shù)>5000。陰性樣品在與芍藥苷對(duì)照品相同保留時(shí)間（約17 min）處沒(méi)有色譜峰。

2.5.2線(xiàn)性關(guān)系考察 計(jì)算得回歸方程：y=21 589x-16 790，R2 = 0.9999。結(jié)果表明芍藥苷在21.1～421.5 μg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，橫坐標(biāo)（x）為芍藥苷濃度，縱坐標(biāo)（y）為色譜峰面積。

2.5.3精密度試驗(yàn) 計(jì)算得到芍藥苷峰面積的RSD為0.7%，說(shuō)明精密度良好。

2.5.4重復(fù)性試驗(yàn) 計(jì)算芍藥苷峰面積的RSD是1.3%，證明方法的重復(fù)性良好。

2.5.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 計(jì)算得到芍藥苷峰面積RSD是1.4%，證明供試品溶液在24 h穩(wěn)定性良好。

2.5.6加樣回收率試驗(yàn) 計(jì)算得到平均加樣回收率為98.6%，RSD為1.7%。

2.5.7樣品的測(cè)定 計(jì)算得到150828、151210、160130三批次香芪生乳合劑中芍藥苷的含量分別為0.546、0.591、0.564 mg/ml。

3討論

TLC利用不同成分對(duì)吸附劑吸附能力得不同，在展開(kāi)劑流吸附劑的過(guò)程中，連續(xù)的產(chǎn)生吸附、解吸附的循環(huán)，達(dá)到不同成分分離的目的，是現(xiàn)階段中藥復(fù)方制劑中藥味鑒別最常用的方法。HPLC是以經(jīng)典的液相色譜為基礎(chǔ)，在高壓下的液體為流動(dòng)相的色譜過(guò)程，一般配備高靈敏度的檢測(cè)器，具有高效的特征，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照能對(duì)復(fù)方制劑中的有效成分進(jìn)行含量測(cè)定。香芪生乳合劑中當(dāng)歸、川芎、白芍、黃芪、木香諸藥合用起到益氣養(yǎng)血、通經(jīng)下乳的作用[9-13]，基于此，本研究采用TLC法對(duì)制劑中的這些藥材進(jìn)行鑒別。當(dāng)歸和川芎有效成分相近，都含稿本內(nèi)酯、阿魏酸等成分，《中國(guó)藥典》2015年版中紅藥貼膏、婦科調(diào)經(jīng)片等多種制劑中當(dāng)歸和川芎都采用TLC同時(shí)鑒別，故本研究采用TLC法對(duì)當(dāng)歸和川芎同時(shí)鑒別。白芍在處方中為君藥，且芍藥苷為白芍的主要有效成分，含量較高，故選擇其作為含量測(cè)定的指標(biāo)。

根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版一部及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道芍藥苷在230 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收[14-18]，通過(guò)在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描芍藥苷對(duì)照品溶液和供試品溶液，結(jié)果在231 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇231 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

從三批次檢測(cè)結(jié)果看，該制劑生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可靠。該研究方法簡(jiǎn)單易行、可操作性強(qiáng)、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，可作為香芪生乳合劑的質(zhì)量控制方法，為該制劑的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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