歷凱+匡海學+殷越+張潔玉+王智+張秋樾+旺建偉

[摘要]通過代謝組學評價痛瀉要方對腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）大鼠模型血清內(nèi)源性物質(zhì)代謝干預效應，尋找潛在的生物標志物并分析其代謝途徑，探討痛瀉要方的作用機制及病證模型的證候本質(zhì)。將40只Wistar大鼠復制為IBS模型，隨機分為模型對照組和痛瀉要方給藥組4組，另設空白對照組10只。痛瀉要方（低、中、高）組分別灌胃劑量為0.203，0.406，0.812 g·mL^-1的痛瀉要方，空白對照組及模型對照組給予等體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)2周。各組大鼠于灌胃第0，15天采集血清，經(jīng)處理后供UPLC-Q-TOF-MS進行代謝組學分析。鑒定出8個潛在生物標志物，分析出8條主要代謝通路，其與IBS疾病的神經(jīng)遞質(zhì)代謝、炎性免疫、腦神經(jīng)功能及能量代謝等有關，痛瀉要方對IBS疾病的作用機制可能涉及血清素突觸和色氨酸代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、甘油磷脂代謝、煙酸和煙酰胺代謝等過程，其可能是IBS模型肝旺脾虛證的生物學基礎。

[關鍵詞] 痛瀉要方； 腸易激綜合征； 肝旺脾虛； 內(nèi)源性代謝物； 代謝組學

[Abstract] To evaluate the effect of Tongxie Yaofang on cardiac endogenous metabolism in irritable bowel syndrome（IBS） rats by using metabolomics method， find its potential biomarkers， analyze the metabolic pathways， and explore the pharmacological effects， mechanisms of action and syndrome essence of syndrome model. Forty Wistar rats were used to establish IBS models， and then randomly divided into four groups： model control group and Tongxie Yaofang treatment groups （high， medium， low dose）. Another 10 rats were used as normal group. The rats in Tongxie Yaofang-treated（low， medium and high dose） groups were orally administrated with Tongxie Yaofang extracts once a day for 2 weeks， respondingly with the doses of 0.203，0.406，0.812 g·mL^-1. The rats in normal group and model control group were given with equal volume of saline once a day for 2 weeks. On the 0 and 15th days， serum was collected and each sample extract was analyzed by UPLC-Q-TOF-MS. Eight potential biomarkers were identified and 8 major metabolic pathways were found to be related with IBS diseases neurotransmitter metabolism， inflammatory immunity， brain function and energy metabolism， etc. Tongxie Yaofang had certain pharmacological effects on IBS， and its mechanism may be related to serotonergic synapse， tryptophan metabolism， cysteine and methionine metabolism， glycerophospholipid metabolism， nicotinate and nicotinamide metabolism and so on， which might be the biological basis of IBS liver-spleen deficiency syndrome.

[Key words] Tongxie Yaofang； IBS； liver stagnation and spleen deficiency； endogenous metabolites； metabolomics

本研究組在前期工作中已進行了較深入的痛瀉要方對腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）大鼠模型腦-腸互動效應機制影響的研究^[1-2]，并對其作用機制有一定闡釋。對機體、病證的作用機制僅通過某些作用靶點、機制、通路來闡釋機體證候復雜性、方藥成分有效性的研究模式，是不能完全將藥物對病證的作用機制闡明清楚。而如何全面、系統(tǒng)的闡明方藥對病證整體效應，值得思考。代謝組學通過機體內(nèi)小分子代謝產(chǎn)物整體變化規(guī)律，還原相關聯(lián)的生物事件，以揭示機體的生物狀態(tài)實質(zhì)和藥物作用機制^[3]。代謝組學具有整體動態(tài)、綜合與分析等系統(tǒng)方法學特點，有與中醫(yī)治療疾病的整體觀念相近的特點^[4]。方藥則可對機體代謝途徑中某些環(huán)節(jié)作用特異性強，干預其代謝產(chǎn)物及代謝網(wǎng)絡^[5]。通過代謝組學與中醫(yī)方證相結合，從體內(nèi)代謝產(chǎn)物的角度明晰方藥代謝網(wǎng)絡干預效應，而明確對動物模型的作用機制及實質(zhì)。因此，本實驗將IBS病證結合模型和代表方藥——痛瀉要方作為有機系統(tǒng)進行研究，通過痛瀉要方對IBS動物模型血清內(nèi)源性代謝物干預效應的評價，研究其對IBS病證模型調(diào)控差異、調(diào)控效應，發(fā)掘出其生物標記物，建立其代謝模式特征，通過基于體內(nèi)作用的物質(zhì)質(zhì)量變化規(guī)律以探求痛瀉要方的作用本質(zhì)及所適應病證模型的證候本質(zhì)。

1 材料

高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)（UPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)），包括Waters AcquityTM Ultra型高效液相色譜儀，Triple TOF 5600⁺型飛行時間質(zhì)譜儀，MassLynxV4.1工作站（Waters公司，美國）；電噴霧離子源（AB SCIEX公司，美國）；KDC-40型低速離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司，中國）；D-78532型Tuttligen離心機（Hettich公司，德國）；Vortex3000型旋渦混合機（wiggens公司，德國）；Academic純水制備系統(tǒng)（Milli-Q公司，美國）；Forma 995型超低溫冰箱（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；B3200S-T型超聲震蕩儀（必能信超聲上海有限公司，中國）；KDC-160HR型高速臺式冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司，中國）；SK-1型快速混勻器（江蘇醫(yī)療儀器廠，中國）；cp2465型血管成形術球囊（EV3公司，美國）；E206Fr型兒童導尿管（3 mL，沈陽市博斯林醫(yī)療器械有限公司，中國）；DYM型硬膜外麻醉導管（1.0×1，揚州華夏醫(yī)療器械有限公司，中國）。

痛瀉要方源自《丹溪心法》，炒白術（Atractylodis Macrocephalae Rhizoma），炒白芍（Paeoniae Radix Alba），炒陳皮（Citri Reticulatae Pericarpium），炒防風（Saposhnikoviae Radix），上述樣品由黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院孫慧峰教授鑒定。精準稱量白術81 g，白芍54 g，陳皮40.5 g，防風27 g（6∶4∶3∶2），生藥用10倍蒸餾水浸泡0.5 h，加蒸餾水煎煮2次。第1次煎煮1.5 h，第2次煎煮1.0 h，然后將2次濾液合并，過濾雜質(zhì)，水浴加熱濃縮濾液，提取液減壓濃縮得到100 mL濃縮液，藥物提取物收率為2.03 g·mL^-1。制成凍干粉末后以HPLC測定主要成分白術內(nèi)酯Ⅰ，白術內(nèi)酯Ⅱ，白術內(nèi)酯Ⅲ，芍藥苷，質(zhì)量分數(shù)分別為0.043 8，0.031 4，0.154 5，0.234 1 mg·g^-1。4 ℃保存待用。臨用時以蒸餾水配制成生藥濃度為0.203（臨床等效量），0.406，0.812 g·mL^-1的藥液。

乙腈（色譜級，Thermo Fisher Scientific公司，美國，A998-4）；甲醇（色譜級，Dikma Technologies公司，美國，CAS-67-56-1）；甲酸（色譜級，Tedia公司，美國，F(xiàn)S0630-015）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料公司，中國，GB19298）。

2 方法

2.1 IBS模型復制、分組及給藥

Wistar大鼠，清潔級，雌雄兼用，出生8 d，體重（11±2）g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學（黑動字第P00102006）。大鼠自由進食飲水，室溫21～24 ℃，濕度50%～60%。采用乳鼠直腸擴張刺激法^[6]結合母嬰分離法^[7]，母鼠與其乳鼠共同飼養(yǎng)在籠內(nèi)，乳鼠第8～12天以血管成形術球囊（囊長15 mm）插入直腸，至球囊末端距離肛門2 cm，緩慢逐漸地向球囊注水以擴張腸道，2次/日，每次持續(xù)1 min，2次間隔30 min。第13～17天，以囊長20 mm的血管成形術球囊擴張直腸，其余條件不變。第18～21天改為兒童導尿管擴張直腸，注入水0.1 mL，其余條件不變。每天乳鼠直腸擴張后，單獨放入其他籠內(nèi)，與母鼠分離1 h，之后再與母鼠同放籠內(nèi)。造模2周。通過腹部撤離反射實驗（AWR）評價模型，評價成功者為成模的IBS模型。將成模的IBS大鼠按體重隨機分為4組，分別為模型對照組（M）、痛瀉要方[高（G）、中（Z）、低（D）]3組，各組10只，另設正常對照組（K）10只。痛瀉要方G，Z，D 3組每天分別灌胃給予8.12，4.06，2.03 g·kg^-1痛瀉要方藥液。正常對照組、模型對照組按等體積灌服生理鹽水。每組給藥2周。

2.2 生物樣本采集及處理方法

實驗造模第0，15天眼底采血2 mL，4 ℃下3 000 r·min^-1離心10 min，取上層血清。作為不同時間點血樣。置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。樣品常溫解凍，取血?00 μL，加入400 μL甲醇以稀釋，渦旋2 min以混勻充分，在4 ℃條件下3 000 r·min^-1離心15 min，以沉淀蛋白，吸取200 μL上層血清再加入10 μL內(nèi)標（1 g·mL^-1氯苯丙氨酸水溶液），以3 000 r·min^-1渦旋2 min，吸取上清液放置于玻璃進樣小瓶以備用。

2.3 代謝組學數(shù)據(jù)采集

進樣分析。色譜條件：Rapid Resolution色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速0.4 mL·min^-1；柱溫30 ℃；掃描范圍190～400 nm；檢測波長210，254，280 nm；進樣量2 μL；流動相0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫，0～3 min，98%～48%A，3～10 min，48%～2%A，10～12 min，2%～98%A，12～14 min，98%A。質(zhì)譜條件：正/負離子一級質(zhì)譜（MS）條件為ESI（電噴霧離子源），LockSprayTM校正系統(tǒng)進行在線質(zhì)量校正，掃描檢測m/z 50/1 500，掃描時間0.2 s，毛細管電壓3.00 kV，樣品錐孔電壓35 V，提取電壓4.0 V，離子源溫度120 ℃，脫溶劑溫度350 ℃，錐孔氣流量50 L·h^-1，脫溶劑氮氣流量650 L·h^-1，碰撞能6～30 V。

2.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學方法

2.4.1 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)處理應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。在評估原始數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布方差基礎上，組間差異比較采用單因素ANOVA方差分析，組間差異采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.4.2 生物標記物分析 測定的尿液代謝輪廓質(zhì)譜數(shù)據(jù)應用Markerlynx軟件進行數(shù)據(jù)降維和質(zhì)譜矩陣信息獲取。通過ssLynxV4.1工作站軟件中非監(jiān)督主成分分析（principal component analysis，PCA）、最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）對各組樣本的代謝組圖譜進行模式識別分析，對各個組別的觀測值進行區(qū)分。同時對所獲得計量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，依據(jù)變量重要性投影值（variable importance in projection，VIP）、VIP置信區(qū)間評價、篩選潛在生物標記物。取VIP>1.5的離子進行組間比較，組間差異采用t檢驗，P<0.05作為篩查條件，獲得潛在生物標記物。再進行二級質(zhì)譜分析，根據(jù)其相對分子質(zhì)量及分子團結構，進行針對性強的結構分析。根據(jù)分析結果，利用人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB）、斯克里普斯代謝組學和質(zhì)譜中心（METIIN）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）等數(shù)據(jù)庫及文獻資料對生物標記物信息檢索進行生物學意義及標志物代謝途徑的解釋，以確定數(shù)據(jù)分析。最終，通過文獻篩選出與IBS模型的發(fā)生與發(fā)展密切相關的核心生物標記物。

3 結果

3.1 血清代謝輪廓整體表征

基于優(yōu)化的液質(zhì)分析條件對各組大鼠0，15 d血清樣本進行分析，分別于正負離子掃描模式下對血清樣本進行設定質(zhì)量范圍的掃描分析，得出質(zhì)譜輪廓圖譜BPI，BPI圖上不同組別血清樣本的區(qū)分度較好，代謝物譜明顯不同，有較好的分離和響應效果，見圖1～4。

3.2 血清代謝數(shù)據(jù)PCA分析

進一步研究發(fā)現(xiàn)，各組大鼠正、負離子條件下血清樣本在PCA得分圖二維空間上均表現(xiàn)出完全分離狀態(tài)，表明經(jīng)直腸擴張結合母嬰分離刺激誘導，大鼠生理機能發(fā)生變化，進而反映在大鼠血清代謝輪廓的改變，反應了IBS肝旺脾虛證及痛瀉要方對模型干預的代謝表征。通過對各組樣本的代謝輪廓進行OPLS-DA分析，得到用于評價代謝輪廓分組貢獻率的scores plot圖，對各組血清樣本代謝組圖譜進行模式識別分析。由各圖可見，各組的數(shù)據(jù)點無重疊/重疊少，表明組間存在差異。依據(jù)VIP和VIP置信區(qū)間評價、篩選潛在生物標記物。

3.2.1 IBS疾病模型的血清代謝組學研究 PCA，OPLS-DA得分圖見圖5，6，IBS模型大鼠的血清與正常對照組血清相比，數(shù)據(jù)點無重疊，明顯分類于不同象限，在得分圖中顯現(xiàn)明顯的分離狀態(tài)，2組血清代謝區(qū)分很好，說明大鼠經(jīng)過造模后，正常對照組與IBS模型組大鼠的代謝產(chǎn)物存在明顯差異，血清中代謝物組發(fā)生顯著變化。給藥前與給藥后15 d，2組得分圖的分離均比較明顯，說明IBS模型大鼠在15 d內(nèi)比較穩(wěn)定。

3.2.2 痛瀉要方對適配IBS疾病模型干預的血清代謝組學研究 PCA，OPLS-DA得分圖見圖7，8。

0 d IBS大鼠與各痛瀉要方組的血清數(shù)據(jù)點重疊，明顯分類于相同象限，在得分圖中也顯現(xiàn)未分離狀態(tài)，說明大鼠經(jīng)過直腸擴張結合母嬰分離刺激誘導，模型組與各痛瀉要方藥組代謝產(chǎn)物相同，表明分組無差異，均為IBS大鼠，造模成功。IBS模型大鼠和各給藥組與正常對照組的血清相比，數(shù)據(jù)點無重疊，明顯分類于不同象限，在得分圖中顯現(xiàn)明顯的分離狀態(tài)，代謝區(qū)分很好，說明大鼠經(jīng)過造模后，IBS大鼠的代謝產(chǎn)物與正常大鼠相比，存在明顯差異，血清中代謝物組發(fā)生明顯的變化。

PCA，OPLS-DA得分圖見圖8，15 d IBS模型大鼠與各給藥組的血清數(shù)據(jù)點已離散，明顯分類于不同象限，在得分圖中也顯現(xiàn)分離狀態(tài)，各組血清代謝區(qū)分很好，說明IBS模型大鼠經(jīng)過痛瀉要方干預后，與模型對照組相比，代謝產(chǎn)物組已發(fā)生明顯的變化。痛瀉要方各劑量組在得分圖中顯現(xiàn)分離狀態(tài)，但區(qū)分程度一般，中、高劑量組數(shù)據(jù)點分布與正常對照組接近。

3.3 潛在生物標記物的鑒定

根據(jù)所得分子離子碎片的鑒定結果，通過HMDB數(shù)據(jù)庫、METLIN鑒定到尿液中可能的生物標記物有8種是與痛瀉要方治療IBS相關的具有顯著差異的代謝產(chǎn)物，并呈現(xiàn)一定程度的上調(diào)或下降趨勢，這些生物標志物分別歸屬于氨基酸、有機酸、糖類、糖苷類、膽堿類，見表1，2。其中有D-ribulose，malonic acid，valyl-serine，betaine，nicotinamide-riboside，5-hydroxy-L-tryptophan （5-HTP）5個生物標志物在KEGG查到代謝通路，主要涉及血清素突觸、色氨酸代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、磷酸肌醇代謝、甘油磷脂代謝、煙酸和煙酰胺代謝、維生素B₆及蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類代謝等相關通路。

4 討論

代謝組學是一門系統(tǒng)研究代謝產(chǎn)物變化及其規(guī)律的科學，以揭示機體生命活動代謝本質(zhì)。內(nèi)源性代謝物變化能直接反映體內(nèi)生化過程和狀態(tài)變化，藥物對主要生物標記物所涉及代謝通路的某些過程具有特異性作用，使其內(nèi)源性代謝物發(fā)生明顯變化^[8]。代謝組學通過檢測獲得體液的代謝指紋圖譜和分析引起代謝譜變化的原因，研究藥物引起的內(nèi)源性代謝物的變化，探察復方中藥在代謝調(diào)控中所起的作用和如何起作用，探明其確切的作用機制，并可能明確復方與病證的相關性。

痛瀉要方始載于《丹溪心法·泄瀉卷》，用于脾虛肝旺之痛瀉。本課題組在前期研究工作采用3種IBS復制方法進行痛瀉要方方證相關研究。其中一種為將乳鼠直腸擴張刺激法結合母嬰分離模型二法結合復制IBS，乳鼠直腸擴張刺激法為目前IBS造模應用最廣的方法、最合理的動物模型，屬于局部機械刺激；母嬰分離屬于早期生活事件，能模擬情緒焦慮，并有應激反應增強和內(nèi)臟高敏感性反應^[9]。結果表明，痛瀉要方對3種IBS模型的癥狀及腦腸肽表達指標均具不同程度的改善作用，與其他2種模型相比，以乳鼠直腸擴張刺激法結合母嬰分離組最優(yōu)，不僅具有扶脾之功，又有抑肝之效，具有明顯效應及關聯(lián)性，此模型證為肝旺脾虛，與痛瀉要方方證相關^[10]。因此，在此部分研究中，采用此模型作為IBS模型進行痛瀉要方的代謝組學研究。

本研究采用液質(zhì)聯(lián)用結合MassLynx軟件的統(tǒng)計分析方法對IBS大鼠血清進行代謝組學研究。從正常對照組、IBS模型組及痛瀉要方干預組的代謝表征來看，IBS大鼠血清中3-nitrotyrosine，D-ribulose，glutamyl-histidine，valyl-serine，bataine，nicotinamide-riboside表征降低，而malonic acid，5-HTP表征提高。痛瀉要方可使3-nitrotyrosine，D-ribulose，glutamyl-histidine，valyl-serine，bataine，nicotinamide-riboside含量提高，而malonic acid，5-HTP含量降低。由此推測痛瀉要方調(diào)節(jié)機制可能涉及以下幾個方面。

4.1 血清素突觸和色氨酸代謝

5-HTP涉及血清素突觸通路及色氨酸代謝。5-HTP由色氨酸經(jīng)色氨酸羥化酶轉(zhuǎn)化，再經(jīng)脫羧反應合成5-羥色氨（5-hydroxytryptamine，5-HT），又稱血清素。5-HT作為信號傳導分子在腸、腦間傳遞信息，是腦-腸軸的重要神經(jīng)遞質(zhì)^[11]，既具有調(diào)節(jié)腸道運動、分泌和感知等功能，還可調(diào)節(jié)情緒、睡眠等。5-HT含量變化與IBS諸多復雜病證的發(fā)生發(fā)展有著密切關聯(lián)，在其發(fā)病機制中占有主導地位。腸道中的5-HT參與腸道感覺、分泌及運動調(diào)控，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的5-HT可導致精神、行為障礙，調(diào)節(jié)情緒、睡眠等，參與腦-腸互動的生物化學信號異常過程^[12]。IBS模型大鼠血清的5-HTP代謝升高，表明IBS模型存在5-HT分泌、釋放及代謝異常等的病理機制，與前期研究相符^[13-14]。痛瀉要方可降低血清中5-HTP含量，結果說明痛瀉要方可能通過調(diào)節(jié)IBS模型大鼠5-HT代謝及神經(jīng)突觸而參與IBS內(nèi)臟高敏性、胃腸運動等調(diào)控而緩解癥狀，提示痛瀉要方改善肝旺脾虛證IBS與調(diào)節(jié)血清素突觸通路及色氨酸代謝有關。

4.2 半胱氨酸和甲硫氨酸代謝

Betaine，D-ribulose參與半胱氨酸和甲硫氨酸代謝，降低人體內(nèi)半胱氨酸潛在的毒性水平^[15]。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是半胱氨酸和甲硫氨酸代謝的中間產(chǎn)物。Hcy具有極高的生物活性，參與多種炎癥及免疫紊亂性疾病。腸道黏膜低度炎癥和免疫激活在IBS發(fā)病機制中占重要作用，而Hcy與IBS炎癥免疫的發(fā)生發(fā)展有著密切關系^[16]。Hcy的促炎作用還可影響腸道黏膜屏障而加重IBS病理生理狀態(tài)^[17-18]。另外，Hcy的含量與抑郁癥的發(fā)病率呈正相關^[19]。IBS患者常伴有抑郁、焦慮、情緒低落等心理障礙。IBS的生物-心理-社會模式病理生理的假定，強調(diào)了心理困擾在IBS的發(fā)病機制中的重要性^[20]，涉及腦-腸軸功能異常。因此，可以分析出Hcy不僅與IBS炎癥免疫反應有著密切關系，對IBS抑郁等心理應激亦有密切關聯(lián)。

結果表明，IBS模型大鼠血清中betaine，D-ribulose含量顯著降低，提示IBS大鼠的Hcy甲基化途徑抑制，存在Hcy轉(zhuǎn)硫代謝途徑異常。提示痛瀉要方可能通過升高betaine，D-ribulose代謝表征，調(diào)節(jié)半胱氨酸和甲硫氨酸代謝，降低Hcy產(chǎn)生，而改善IBS的腸道炎癥反應及心理情志變化。痛瀉要方改善IBS大鼠情志抑郁，急燥易怒，腹痛腹脹腸鳴等肝旺證與調(diào)控半胱氨酸和甲硫氨酸代謝途徑相關，體現(xiàn)了抑肝之功。

4.3 維生素B₆代謝

D-ribulose涉及維生素B₆代謝。維生素B₆作為輔酶，參與氨基酸、蛋白質(zhì)等多種代謝反應。缺乏維生素B₆，可導致蛋白質(zhì)水解及轉(zhuǎn)化為脂肪的過程停滯，生長停止。而實驗結果顯示給藥后D-ribulose上調(diào)，表明維生素B₆合成增加，促進蛋白質(zhì)代謝。

4.4 煙酸和煙酰胺的代謝

煙酰胺核糖核苷脫核糖核苷生成煙酸，煙酸在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為煙酰胺。腸黏膜機械屏障是腸黏膜屏障的結構基礎，防止細菌的侵襲及炎癥，腸道慢性炎癥及低度炎證常伴隨腸道黏膜屏障受損。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase 1，PARP-1）具有修復機體DNA和維持基因組穩(wěn)定作用，PARP-1過度激活，快速消耗煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD⁺），導致ATP消耗，導致細胞壞死和功能失調(diào)。煙酰胺能促進機體氧化還原反應，通過抑制PARP-1控制NF-κB調(diào)控的多種代謝轉(zhuǎn)錄通道^[21]，具有明顯擴張血管作用，可以明顯減輕腸道損傷。煙酸被用于合成NAD與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP），沉默信息調(diào)節(jié)因子1（sirtuin 1，SIRT1）是一種依賴于NAD⁺的去乙?；?。在慢性炎癥過程中，SIRT1具有減少炎性因子釋放、抑制炎性因子所致細胞毒性反應的作用，從而保護腸黏膜^[22]。

研究表明，IBS模型大鼠血清中煙酰胺核糖核苷含量顯著降低，表明IBS大鼠的煙酸和煙酰胺代謝途徑抑制，煙酰胺核糖核苷參與了IBS病理生理過程。提示痛瀉要方可能通過煙酰胺核糖核苷調(diào)節(jié)煙酸和煙酰胺代謝，改善IBS的炎癥反應，減輕腸道損傷。

4.5 甘油磷脂代謝

Valyl-serine參與甘油磷脂代謝，甘油磷脂在細胞識別和信號傳導過程中發(fā)揮重要作用。磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）是含有valyl-serine的甘油磷脂^[23]，作為腦神經(jīng)活化的主要成分，主要存在大腦中，具有調(diào)控大腦神經(jīng)功能作用，可改善大腦功能，修復大腦損傷，可促進Ach的釋放，增強Na⁺/K⁺-ATP酶的活性，提高認知能力^[24]，增強大腦機能^[25]；PS能降低應激激素水平，提高抑郁患者去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）和5-HT含量，減輕緊張壓力、緩解抑郁癥狀^[26-27]，對神經(jīng)系統(tǒng)具有重要作用。

研究表明，IBS模型大鼠血清中valyl-serine含量顯著降低。提示IBS大鼠的甘油磷脂尤其PS代謝異常，表明在IBS病理生理過程甘油磷脂在細胞識別和信號轉(zhuǎn)導的作用受到影響，IBS大鼠出現(xiàn)情緒低落、煩躁倦臥等癥狀，經(jīng)痛瀉要方干預后，IBS大鼠血清中valyl-serine表征增加，說明痛瀉要方參與甘油磷脂代謝，PS合成增加，改善神經(jīng)功能，緩解IBS的各種癥狀反應。提示痛瀉要方改善IBS大鼠情志抑郁，急燥易怒，腹痛腹脹腸鳴等肝旺證與調(diào)控甘油磷脂代謝途徑相關，體現(xiàn)了抑肝之功。

4.6 磷酸肌醇代謝

Malonic acid參與磷酸肌醇（inositol phosphate，IP）代謝。IP是一類磷脂的總稱，其中三磷酸肌醇（IP3）為三磷酸磷脂肌醇的酶代謝物，具有誘發(fā)Ca²⁺釋放的重要功能，可瞬間提高胞液中Ca²⁺濃度。Ca²⁺為重要的胞內(nèi)信使物質(zhì)，磷酸肌醇代謝對細胞信號傳遞過程發(fā)揮重要調(diào)節(jié)效應。Ca²⁺過度積聚可導致神經(jīng)元變性、損傷。實驗研究表明，IBS模型血清中malonic acid含量升高，參與磷酸肌醇代謝，有可能導致神經(jīng)元中Ca²⁺離子濃度明顯提升，導致信號轉(zhuǎn)導亢奮，痛瀉要方可能通過降低malonic acid含量，參與磷酸肌醇代謝，致神經(jīng)元中Ca²⁺釋放減少，阻止其積聚，抑制信號轉(zhuǎn)導活性，改善神經(jīng)可塑性而發(fā)揮效應^[28]。

4.7 糖、蛋白質(zhì)、能量代謝

D-ribulose還參與蛋白質(zhì)、氨基酸及糖類的生物合成代謝。絲氨酸參與脂肪和脂肪酸的新陳代謝，促進肌肉生長，維持免疫系統(tǒng)的健全。Betaine參與ABC轉(zhuǎn)運。能量代謝是機體內(nèi)代謝過程中所產(chǎn)生的能量釋放、轉(zhuǎn)移和利用，與“脾主運化”理論有著密切聯(lián)系。提示IBS大鼠具有機體能量代謝障礙、免疫機能紊亂及生長抑制表現(xiàn)，為中醫(yī)脾虛證表征。痛瀉要方干預后可提升D-ribulose代謝表征使其代謝網(wǎng)絡改善，表明痛瀉要方可從糖、氨基酸代謝等方面提高IBS脾虛證的能量代謝低下狀態(tài)。提示痛瀉要方改善IBS大鼠體倦乏力、神疲納呆等脾虛證與提高機體能量代謝相關并調(diào)控免疫機能，體現(xiàn)了扶脾之功。

5 結論

綜上所述，IBS模型復制及在痛瀉要方干預后，內(nèi)源性代謝物發(fā)生明顯變化，其中已可明確代謝通路涉及血清素突觸和色氨酸代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、維生素B6代謝、煙酸和煙酰胺代謝、甘油磷脂代謝、磷酸肌醇代謝及蛋白質(zhì)、氨基酸及糖類的生物合成代謝等幾個方面。由于調(diào)節(jié)的復雜性，目前還不完全清楚內(nèi)源性代謝物異常表達的生物學意義，然從結果分析可以看出，代謝物表征的異?？赡苁荌BS肝旺脾虛證的生物學基礎，而痛瀉要方則對與肝旺脾虛證相關的內(nèi)源代謝物發(fā)揮復雜的調(diào)節(jié)作用，體現(xiàn)了扶脾抑肝之功。

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[責任編輯 曹陽陽]