明日葉不同極性溶劑萃取物的活性研究

朱 芳韋萬麗 杜 瑩 陳 婷 周清娣 廖莉玲

(1. 貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550001；2. 悉尼大學(xué)化學(xué)學(xué)院，澳大利亞 悉尼 2006)

明日葉不同極性溶劑萃取物的活性研究

朱 芳1韋萬麗1杜 瑩1陳 婷1周清娣2廖莉玲1

(1. 貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550001；2. 悉尼大學(xué)化學(xué)學(xué)院，澳大利亞 悉尼 2006)

為比較明日葉不同極性部位的活性，將明日葉粗提取物過HPD-600大孔樹脂，收集50%乙醇洗脫物。采用不同極性有機(jī)溶劑對50%洗脫物進(jìn)行液—液萃取，將50%洗脫物分為乙酸乙酯相、正丁醇相、水相三個(gè)不同極性溶劑萃取物，測定不同極性溶劑萃取物的總黃酮和總多酚含量，研究各萃取物清除DPPH自由基、ABTS自由基能力和總還原能力以及對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。結(jié)果表明：乙酸乙酯相的總黃酮含量以及總多酚含量高于其他溶劑相，且體外抗氧化能力和對α-葡萄糖苷酶的抑制活性最強(qiáng)。明日葉不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性和對α-葡萄糖苷酶的抑制率隨著濃度的增加而增加。

明日葉；抗氧化；α-葡萄糖苷酶；抑制活性

明日葉是一種芹科多年生草本植物，藥食兼用。原產(chǎn)于日本，因富含多種天然活性物質(zhì)，被譽(yù)為“21世紀(jì)的健康食品”[1]。研究[2-4]表明明日葉富含的黃酮類物質(zhì)具有抗癌、降血糖、抗衰老等功效。目前，已經(jīng)有不少文獻(xiàn)[5-6]對明日葉總黃酮的提取和純化進(jìn)行了報(bào)道，但鮮有文獻(xiàn)對明日葉的活性部位進(jìn)行追蹤，而本研究擬采用簡便快捷的方法，先將明日葉粗提取物過HPD-600樹脂，再將大孔樹脂純化后的樣品分為乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水相部位，采用清除DPPH、ABTS自由基，總還原能力和對α-葡萄糖苷酶活性抑制的方法來評價(jià)明目葉不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性及對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，旨在追蹤明日葉的活性部位，為明日葉活性物質(zhì)的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

明日葉：上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院種植實(shí)驗(yàn)基地；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：分析純，貴州迪大科技有限責(zé)任公司；

二苯基苦味?；诫拢悍治黾?，東京化成株式會社；

α-葡糖糖苷酶：100 U/mg，Sigma-Aldrich Company；

4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷：分析純，Sigma-Aldrich Company;

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；

其余試劑均為分析純；

HPD-600樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司；

分光光度計(jì)：L5s型，上海儀電分析儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52型，上海亞榮生化儀器廠；

電子天平：A200S型，德國sartorius公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 將晾干的明日葉粉碎過40目篩，稱取60 g明日葉粉末與53%的乙醇按1∶17(g/mL)的料液比混勻，在82 ℃水浴提取兩次，每次2 h，合并兩次提取液，抽濾，50 ℃真空減壓濃縮至粉末狀得到粗品。取一定量的蒸餾水溶解粗品，配成總黃酮含量為2～3 mg/mL的溶液，以2 BV/h 的流速過HPD-600樹脂至樹脂吸附飽和后，用50%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，直至洗脫液無色。收集洗脫液旋干得到大孔樹脂純化的樣品，將大孔樹脂未吸附的部分旋干得到過柱液樣品。將大孔樹脂純化后的樣品，加適量的蒸餾水溶解，充分混勻后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中。依次用乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，旋干各相溶液分別得到乙酸乙酯相、正丁醇相、水相樣品，并按式(1)計(jì)算得率：

(1)

式中：

C——得率，%；

m1——旋干后各部分樣品質(zhì)量，g；

m2——起始加入的明日葉粉末質(zhì)量，g。

1.2.2 總黃酮含量的測定 采用NaNO2—Al(NO3)3比色法[7]。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，在200～700 nm波長范圍掃描，確定其最大吸收波長為515 nm。在515 nm處測定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度，并以吸光度(Y)對黃酮濃度(X)作圖，得回歸方程為：Y=11.466X-0.001 4，R2=0.999 9。按同樣方法測定不同溶劑萃取物樣品的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算各溶劑萃取物樣品的總黃酮含量。

1.2.3 總多酚含量的測定 參考文獻(xiàn)[8]。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，在最大吸收波長769 nm下測定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度。以吸光度(Y)對多酚濃度(X)作圖，得回歸方程Y=132.3X-0.001 7，R2=0.999 9。在同種方法下測定不同樣品的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算各溶劑萃取物樣品的總多酚含量。

1.2.4 抗氧化能力測定

(1) 清除DPPH自由基能力的測定：根據(jù)文獻(xiàn)[9]，修改如下：取一定質(zhì)量的樣品，用30%的乙醇溶液溶解配成不同濃度的樣液。分別向比色管中加入1 mL樣液，再加入0.1 mg/mL的DPPH溶液1.6 mL，最后用無水乙醇定容至6 mL。搖勻避光保存30 min后，在517 nm波長處測定吸光度，每個(gè)樣品平行測定3次。按式(2)計(jì)算清除率：

(2)

式中：

R0——自由基清除率，%；

A1——待測體系的吸光度；

A2——不加自由基體系的吸光度；

A3——不加樣液體系的吸光度。

(2) 清除ABTS自由基的測定：根據(jù)文獻(xiàn)[10]，修改如下：取7 mmol/L的ABTS溶液50 mL與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液50 mL混合均勻后，置于暗處反應(yīng)12～16 h，制備ABTS+·溶液。使用前用蒸餾水按1∶40(體積比)進(jìn)行稀釋，使得ABTS+·溶液吸光度在734 nm處為0.698。取0.2 mL樣液與4 mL ABTS+·溶液混勻，室溫下反應(yīng)10 min后。測其吸光度，平行測定3次，清除率按式(2)計(jì)算。

(3) 總還原能力測定：根據(jù)文獻(xiàn)[11]修改如下：取0.5 mL 樣液，加入1 mL PBS(0.2 mol/L，pH=6.8)溶液， 1%六氰合鐵酸鉀溶液1 mL混勻，于50 ℃水浴20 min后，快速冷卻至室溫。加入10%三氯乙酸溶液1 mL，混勻后離心10 min，取2.5 mL上清液，加2.5 mL蒸餾水和0.1%氯化鐵溶液0.5 mL，靜置10 min后，在700 nm處測其吸光度記為Ai，用蒸餾水代替樣液測得A0。每個(gè)樣品平行測定3次。

1.2.5 對α-葡萄糖苷酶活性的抑制 根據(jù)文獻(xiàn)[12]修改如下：分別向離心管中加入樣液0.2 mL， 0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶0.2 mL，于37 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)10 min后，加入5 mmol/L的PNPG 0.1 mL，在37 ℃條件下繼續(xù)反應(yīng)15 min后，加入0.2 moL/L的Na2CO31.4 mL終止反應(yīng)，用0.1 moL/L pH=6.8的緩沖溶液定容至10 mL。在402 nm處測定其吸光度，平行3次，按式(3)計(jì)算抑制率。

(3)

式中：

R1——對α-葡萄糖苷酶的抑制率，%；

A空——不加樣液體系的吸光度；

A樣——待測體系吸光度；

A背景——不加酶體系的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 明日葉不同極性溶劑萃取物總黃酮和總多酚的含量

由表1可知，不同部分的樣品得率相差較大，粗品得率為23.42%，經(jīng)大孔樹脂純化后的樣品得率為2.35%，而不被吸附的過柱液部分得率較高。純化后的樣品經(jīng)不同極性的溶劑萃取后，各相萃取物得率相差不大，其中水相的得率最高。說明大孔樹脂純化部分樣品中水溶性物質(zhì)較多。

粗品經(jīng)大孔樹脂HPD-600純化后，總黃酮含量提升近6.3倍，總多酚含量提升近5.8倍。而過柱液中總黃酮和總多酚含量較低，說明HPD-600樹脂對明日葉中的黃酮可以很好地富集。純化后的樣品經(jīng)不同極性溶劑萃取分段后，各段的總黃酮和總多酚含量相差較大，乙酸乙酯部分總黃酮和總多酚含量最高，說明明日葉中的黃酮類物質(zhì)屬于中等極性。

2.2 明日葉不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性

不同極性溶劑萃取物清除DPPH·效果見圖1、表2。由圖1可知，不同極性溶劑萃取物對DPPH·的清除能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)，最終趨向平穩(wěn)；但不同萃取物在相同濃度下，清除率相差較大。由表2可知，清除DPPH·的能力大小依次是VC>乙酸乙酯相>大孔樹脂純化品>正丁醇相>水相>粗品>過柱液。

不同溶劑萃取物清除ABTS+·的效果見圖2、表2。由圖2可知，不同極性溶劑萃取物對ABTS+·的清除率隨濃度的增大而增大，且對ABTS+·的清除能力相差較大。由表2可知，清除能力依次是VC>乙酸乙酯相>大孔樹脂純化品>正丁醇相>水相>粗品>過柱液。

由圖3可知，不同極性萃取物的還原能力隨濃度的增大而增強(qiáng)，還原能力依次是VC>乙酸乙酯相>大孔樹脂純化品>正丁醇相>水相>粗品>過柱液。

Figure 3 Ferric-reducing antioxidant power of different polar solvents of extracts fromAngelicaKeiskei

綜上所述，明日葉不同極性溶劑萃取物清除DPPH·、ABTS+·及總還原能力順序均為VC>乙酸乙酯相>大孔樹脂純化品>正丁醇相>水相>粗品>過柱液，表明不同極性部位樣品的抗氧化能力大小順序是VC>乙酸乙酯相>大孔樹脂純化品>正丁醇相>水相>粗品>過柱液。而各樣品的總黃酮、總多酚的含量順序與其抗氧化能力順序一致，即存在正相關(guān)性，說明黃酮、多酚是明日葉主要的抗氧化物質(zhì)。而乙酸乙酯相的黃酮、多酚含量最高，因此乙酸乙酯抗氧化活性最強(qiáng)，活性物質(zhì)也較多。

2.3 明日葉不同極性溶劑萃取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

α-葡萄糖苷酶在人體糖類的代謝過程中發(fā)揮重要作用，α-葡萄糖苷酶抑制劑可以降低酶的活性，減緩碳水化合物的分解，使得血糖降低[13]。體外降血糖活性多采用以PNPG為底物的酶抑制劑篩選模型來衡量物質(zhì)對α-葡萄糖苷酶的抑制活性[14]。各樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制效果見圖4、表2。由圖4可知，抑制率隨著樣品濃度的增加而增加。由表2可知，抑制率依次是阿卡波糖>乙酸乙酯相>水相>大孔樹脂純化品>正丁醇相>粗品>過柱液?？梢钥闯雒魅杖~乙酸乙酯對α-葡萄糖苷酶有很好的抑制作用，在0.5 mg/mL時(shí)，其抑制率能達(dá)85%，與阿卡波糖的抑制作用相差不大。因此，對α-葡萄糖苷酶抑制活性最強(qiáng)部位為乙酸乙酯部位，由于乙酸乙酯總黃酮含量高達(dá)73%，總多酚含量達(dá)27%，推測其活性物質(zhì)可能為黃酮、多酚物質(zhì)。可以從乙酸乙酯相進(jìn)一步分離其活性物質(zhì)，此外，水相部位黃酮、多酚含量低于大孔樹脂后樣品，但其α-葡萄糖苷酶抑制活性卻高于大孔樹脂純化后的樣品，說明水相中存在非黃酮、多酚的活性物質(zhì)，有待進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

明日葉不同極性溶劑萃取物均有較強(qiáng)的還原能力并能有效地清除DPPH、ABTS自由基，具有良好的抗氧化活性，抗氧化活性最強(qiáng)的是黃酮、多酚含量最高的乙酸乙酯相，其他萃取物的抗氧化活性強(qiáng)弱順序均與總黃酮、總多酚的含量大小順序一致，即抗氧化活性與總黃酮、總多酚含量呈正相關(guān)關(guān)系，說明明日葉中總黃酮、總多酚是主要的抗氧化成分之一。在對α-葡萄糖苷酶的抑制活性測定中，發(fā)現(xiàn)，不同極性萃取物均有一定的抑制活性，其中總黃酮含量最高的乙酸乙酯相萃取物活性最高，與阿卡波糖的抑制效果相當(dāng)，其次，水相萃取物的抑制活性也較強(qiáng)，但黃酮含量不高，說明在水相萃取物中可能含有其他的活性物質(zhì)，有待進(jìn)一步研究。通過對明日葉不同極性萃取物的抗氧化活性和對α-葡萄糖苷酶的抑制活性測定證實(shí)明日葉中的活性最強(qiáng)的部位在乙酸乙酯相，可通過進(jìn)一步的分離純化得到有效成分，為明日葉產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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The studies onactivities of extracts fromAngelicaKeiskeiusing different polar solvents

ZHU Fang1WEIWan-li1DUYing1CHENTing1ZHOUQing-di2LIAOLi-ling1

(1.SchoolofChemistryandMaterialsScience,GuizhouNormalUniversity,Guiyang,Guizhou55000,China2.SchoolofChemistry,theUniversityofSydney,Sydney2006,Australia)

In order to compare the activities of different extracts using several polar fractions of extracts fromAngelicaKeiskei, the crude extracts were adsorbed by HPD-600 macroporous resin, and 50% ethanol eluents were collected as products. The products were separated into three different polar solvents for extracting, i.e., ethyl acetate fraction, n-butanol fraction and aqueous fraction, and extracted by organic solvents of different polarities based on liquids-liquids extracting method. Moreover, the contents of total phenolic and flavonoid in different extracts were determined, and then the activities on scavenging DPPH, ABTS radical, ferric-reducing power and inhibiting toα-glucosidase were also studied. The results showed that the ethyl acetate-soluble fraction had high contents of total phenolic and flavonoid with the strongest antioxidant andα-glucosidase inhibitory activities. The antioxidant activity and inhibitory rate ofα-glucosidase of the extracts fromA.Keiskeiincreased according with the their concentration increasing.

AngelicaKeiskei; antioxidant ability;α-glucosidase; inhibitory activity

貴州省科學(xué)技術(shù)廳中藥現(xiàn)代化攻關(guān)項(xiàng)目(編號：黔科合ZY字【2012】3012號)；貴陽市科技局現(xiàn)代藥業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目(編號：筑科合同[2012204]號)；教育部春暉計(jì)劃(編號：Z2016012)

朱芳，女，貴州師范大學(xué)在讀碩士研究生。

廖莉玲(1963—)，女，貴州師范大學(xué)教授，碩士。 E-mail:lll6383@163.com

2016-12-11

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.033