九頭獅子草抗菌有效組分分析

張麗娟ZHANG Li-juan 王 正 廖尚高 -

(1. 貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院，貴州 貴陽 550001；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖北 十堰 442000；3. 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004)

九頭獅子草[Peristrophejaponica(Thunb.)Brem.]為爵床科(Acanthaceae)九頭獅子草屬(PeristtropheNees)植物，別名辣葉青藥、尖經(jīng)藥、咳風(fēng)尖、暈病藥等，其性味辛、涼，具有清肺瀉火、消腫解毒的功能，在貴州省布依族民間廣泛應(yīng)用于小兒高熱、小兒驚風(fēng)等病癥的治療[1]。以咽喉清喉片(貴州奧特藥業(yè))和甘果含片(浙江永寧制藥廠)等為代表的具有抗菌、抗病毒、解熱、抗炎作用的中藥制劑，已在市場上獲得了廣泛認(rèn)可?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，九頭獅子草以烷烴和甾醇類化合物為其主要成分，也含少量黃酮、木脂素類等化合物[2-4]，具有很好的解熱鎮(zhèn)痛[5-6]、鎮(zhèn)咳祛痰、殺菌止癢、抗炎、保肝、抗肝炎病毒[7]等作用。羅忠圣[8]、覃容貴等[9-10]證實(shí)，九頭獅子草的各種粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌均有較強(qiáng)的抑制作用。但迄今為止，九頭獅子草抗菌活性的有效部位及其相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)未見報(bào)道。本研究擬采用大孔樹脂柱層析將九頭獅子草95%乙醇提取物分成了化學(xué)組成不同、極性差異較大的3個(gè)部位，分別對(duì)各部位進(jìn)行抗菌活性評(píng)價(jià)，從中篩選出抗菌活性組分，再應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)對(duì)該活性組分進(jìn)行化學(xué)分析，以期為九頭獅子草的抗菌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及深度開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

九頭獅子草:由貴陽醫(yī)學(xué)院藥用植物學(xué)及生藥學(xué)教研室鑒龍慶德副教授鑒定，為Peristropejaponica(Thunb) Brem的干燥全草；

標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希氏菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、奇異變形桿菌(ATCC 35659)：美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)；

MH瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司；

D101大孔樹脂：天津浩聚樹脂科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

桌上式潔凈工作臺(tái)：HJ-VD-650型，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：HPX-9052MBE型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；

手提式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-SG46-280S型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；

GC-MS聯(lián)用儀：Agilent Technologies 7890A型，美國安捷倫科技公司。

1.2 方法

1.2.1 組分制備 稱取干燥九頭獅子草全草250 g，用10倍質(zhì)量的95%乙醇回流提取2次，每次2 h。合并濾液后濃縮得浸膏18.0 g，D101大孔樹脂濕法上樣，依次用水、80%乙醇、丙酮溶液洗脫，洗脫液分別濃縮至浸膏，得到大極性的組分A、中極性的組分B以及小極性的組分C。臨用前取各組分低溫冷凍干燥成粉末，再用二甲基亞砜配制成所需濃度。

1.2.2 有效組分篩選

(1) 菌懸液的制備：將供試菌株分別接種于MH瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取平板上形態(tài)相同的菌落，用滅菌生理鹽水校正菌液濃度至2.40×10-5mol/L。校正后的菌液均在15 min內(nèi)接種[11-12]。

(2) 紙片擴(kuò)散法抑菌試驗(yàn)：用無菌棉簽蘸取菌懸液，在瓊脂表面均勻涂布。平板室溫干燥3～5 min后，用無菌鑷子將直徑6 mm的無菌干燥濾紙片貼在已接種測試菌的瓊脂表面，每塊平板貼4片，并用移液槍吸取各組分溶液1 μL，均勻添加在紙片上，每組分每供試菌平行重復(fù)3次試驗(yàn)。將平板置37 ℃孵育18～20 h后觀察結(jié)果，測定抑菌圈直徑大小。用二甲基亞砜做陰性對(duì)照，慶大霉素(1 280 μg/mL)做陽性對(duì)照[11-12]。

(3) MIC及MBC的測定：采用試管2倍稀釋法測定MIC。取15支滅菌試管為一組。其中每組第13、14、15管分別標(biāo)上肉湯對(duì)照、檢測菌對(duì)照、溶劑對(duì)照。每支試管分別加入MH 肉湯2 mL。取抗菌活性最好的組分用MH肉湯稀釋成60 mg/mL的藥液。吸取2 mL 60 mg/mL的藥液加入到第1 管，混勻后吸取2 mL 加入到第2 管，以此類推，直至第12管。第1～12管的藥物濃度分別為60.00，30.00，15.00，7.50，3.75，1.88，0.94，0.47，0.24，0.12，0.06，0.03 mg/mL。除肉湯對(duì)照管外，其余各管均加入菌液0.1 mL，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，觀察生長情況。在對(duì)照管符合要求的情況下，以無菌生長的最低稀釋度為MIC。在MIC測定的基礎(chǔ)上，將未見細(xì)菌生長的各管培養(yǎng)物渦旋混勻后，分別吸取0.1 mL接種于2塊MH固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18 h。用活菌計(jì)數(shù)法測定平板上的菌落，平均數(shù)小于5個(gè)的最小稀釋度的藥物濃度即為MBC。該試驗(yàn)重復(fù)3次，并以1 280 μg/mL為初始濃度的慶大霉素做陽性對(duì)照[11-12]。

(4) 有效組分中化學(xué)成分的GC-MS分析：將樣品用色譜甲醇溶解配制成1 mg/mL的待檢品。色譜條件：色譜柱為DB-17(30 m×250m×0.25m)彈性石英毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度230 ℃；程序升溫：起始溫度70 ℃，以20 ℃/min速率升溫至230 ℃；分流比1∶1；進(jìn)樣量1L；載氣流量2 mL/min；溶劑延遲3.50 min。離子源:電子轟擊源；以氦氣為載氣；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；電子轟擊能量70 eV；電子倍增器電壓1 435 V；接口溫度230 ℃；掃描質(zhì)量范圍m/z30～800。運(yùn)用Agilent GC-MS化學(xué)工作站對(duì)所獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫檢索鑒定成分，按面積歸一化法進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 九頭獅子草各組分的抑菌活性

九頭獅子草的各組分藥液(60 mg/mL)對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及奇異變形桿菌均有不同程度的抑菌作用(見表1)，其中組分C對(duì)4種菌株抑制較為明顯，為九頭獅子草的主要抗菌有效組分。

? “-”表示溶劑空白無抑菌圈。

2.2 有效組分的MIC及MBC測定

九頭獅子草組分C對(duì)各試驗(yàn)菌株的MIC及MBC測定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，組分C對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌抑菌作用較強(qiáng)，對(duì)銅綠假單胞菌抑菌活性稍弱。并且組分C的MIC均小于MBC。

2.3 GC-MS分析

通過優(yōu)化條件，有效組分的主要色譜峰得到了較好的分離(見圖1)。定性、定量分析結(jié)果(見表3)表明，有效組分C中主要含有十八烷酸等26種化合物，這26種化合物的含量占有效組分可測成分含量的80.95%。其中棕櫚酸含量最高(26.14%)，其次是亞油酸(12.08%)、硬脂酸(8.84%)和油酸(6.48%)等。

Figure 1 Total ion current chromatogram of the effective fractions fromPeristrophejaponica(Thunb.) Brem by GC-MS

? 含量低于0.15%的成分未在表中列出。

3 結(jié)論

九頭獅子草各組分均有不同程度的抗菌作用，其中大孔樹脂柱層析丙酮洗脫部位抗菌活性最強(qiáng)(組分C)，對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及奇異變形桿菌均有一定的抗菌作用。GC-MS分析表明，組分C中主要含有脂肪酸及其衍生物，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的此類化合物具有較好的抗菌活性相一致。張希等[14]研究發(fā)現(xiàn)棕櫚油酸、油酸、亞油酸等能有效抑制致病性大腸埃希氏菌O157:H7以及白色念珠菌的生長繁殖；Sun等[15]通過比較脂肪酸及其單脂肪酸甘油酯對(duì)幽門螺旋桿菌的抑菌效果也發(fā)現(xiàn)，油酸和亞麻酸是抗菌作用最為有效的不飽和脂肪酸；Walters等[16]發(fā)現(xiàn)亞油酸能有效抑制終極腐霉菌、立枯絲核菌、燕麥葉炫菌、可可叢枝病菌(植物病害菌)的生長；葉湘漓等[17]研究發(fā)現(xiàn)椪柑籽的主要成分為油酸、亞油酸、棕櫚酸等，椪柑籽油具有調(diào)節(jié)動(dòng)物血脂的作用。這些脂肪酸及其衍生物主要是作用于微生物細(xì)胞膜，引起電子傳遞鏈中斷、氧化磷酸化解偶聯(lián)、細(xì)胞內(nèi)容物溶出，同時(shí)抑制胞內(nèi)酶活性，減弱細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，并通過自身過氧化、自動(dòng)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的 H2O2以及活性氧殺死細(xì)菌[18]。以上研究說明，以棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等為主要成分的脂肪酸類化合物可能是組分C的主要抗菌藥效物質(zhì)，也可能是九頭獅子草的主要抗菌活性成分。由于GC-MS僅能對(duì)組分中可揮發(fā)的成分進(jìn)行分析，組分C的其它成分是否也與其抗菌作用相關(guān)，尚需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。在后期研究中，可以將九頭獅子草揮發(fā)性成分提取純化后開發(fā)成新型食品防腐劑[19]。

[1] 《中華本草》編委會(huì). 中華本草: 第七卷[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1999: 467.

[2] 皮慧芳, 楊希雄, 阮漢利, 等. 九頭獅子草化學(xué)成分的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2008, 20(2): 1 011-1 013.

[3] 蔣小華, 謝運(yùn)昌, 賓祝芳. GC-MS分析九頭獅子草揮發(fā)油的化學(xué)成分[J]. 廣西植物, 2014, 34(2): 170-173.

[4] 何平, 陳琳, 趙超, 等. 九頭獅子草研究進(jìn)展[J]. 貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 34(1): 239-241.

[5] 覃容貴, 范菊娣, 龍慶德, 等. 民族藥九頭獅子草解熱有效部位的篩選[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2012, 32(22): 1 797-1 800.

[6] 覃容貴, 范菊娣, 龍慶德, 等. 九頭獅子草有效部位解熱作用及其作用機(jī)制研究[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2012, 18(21): 211-214.

[7] 楊成雄, 潘朝旺, 王洪林. 九頭獅子草水浸膏對(duì)2.2.15細(xì)胞中對(duì)HBsAg、HBeAg的分泌和HBV DNA復(fù)制的抑制作用[J]. 中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志, 2010, 20(5): 294-296.

[8] 羅忠圣, 周鎂, 黃秀平, 等. 九頭獅子草對(duì)小鼠的抑菌、止癢、抗炎作用[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2016, 36(3): 555-557.

[9] 覃容貴, 李淑芳. 九頭獅子草的抗菌作用研究[J]. 貴陽醫(yī)學(xué)院院報(bào), 2006, 25(2): 130-131.

[10] 覃容貴, 羅忠圣. 九頭獅子草醇提物藥效學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中藥材, 2006, 29(9): 961-963.

[11] 陳奇, 卞如濂, 陳修. 中藥藥理研究方法學(xué)[M]. 2版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2006: 274.

[12] 徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 4版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2010: 1 651.

[13] 張璐. 脂肪酸及其衍生物抑菌活性定量構(gòu)效關(guān)系研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2010: 53.

[14] 張希, 楊明, 宋飛. 脂肪酸及其衍生物的抑菌活性[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào): 農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版, 2013, 39(2): 155-160.

[15] SUN C Q, O'CONNOR C J, ROBERTON A M. Antibacterial actions of fatty acids and monoglycerides against helicobacter pylori[J]. Fems Immunology & Medical Microbiology, 2003, 36(1/2): 9-17.

[16] WALTERS D, RAYNOR L, MITCHELL A, et al. Antifungal activities of four fatty acids against plant pathogenic fungi[J]. Mycopathologia, 2004, 157(1): 87-90.

[17] 葉湘漓, 熊興耀, 涂洪強(qiáng), 等. 椪柑籽油的化學(xué)成分分析及其對(duì)高脂血癥大鼠血脂的影響[J]. 食品與機(jī)械, 2009, 25(2): 62-64.

[18] DESBOIS A P, SMITH V J. Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2010, 85(6): 1 629-1 642.

[19] 李燕, 戴佳錕, 馬賽箭, 等. 天然食品防腐劑及其在鮮切果蔬中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械, 2013, 29(5): 230-233.