潘姝璇PAN Shu-xuan 王嘉怡 - 陳 建 n 夏 陳 鄧俊琳 - 蒲 彪

(1. 四川省農業(yè)科學院農產品加工研究所，四川 成都 610066；2. 四川農業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014；3. 四川大學華西公共衛(wèi)生學院，四川 成都 610041)

發(fā)芽糙米(germinated brown rice，GBR)是糙米在一定的濕度和溫度下發(fā)芽至一定芽長(一般為0.5～1.0 mm)，所得到的由幼芽和帶糠層的胚乳組成的糙米制品[1]。人們在養(yǎng)身的過程中發(fā)現糙米能產生較強的飽腹感，且對身體健康有很多益處[2]。但糙米口感粗糙。通過發(fā)芽處理后的糙米經歷了種子萌發(fā)階段激活了大量的內源酶，酶解作用導致糙米中多糖等活性物質的含量、結構、種類及其生物活性都有所改變或增強，不僅口感得到了一定程度的改善，而且富含許多生物活性物質，如γ-氨基丁酸、菲汀、谷維素、神經酰胺、阿魏酸、多糖等。因此發(fā)芽糙米營養(yǎng)物質豐富，具有特殊的營養(yǎng)功效[3]。

很多報道[4-7]表明植物中的多糖對自由基有一定的抗氧化活性，可以作為新的潛在抗氧化劑進行研究。氧化是許多生物能量生產的基本過程，但是過量的自由基在體內會產生一些氧化反應過程不僅與脂質過氧化作用密切相關，還會引起疾病。因此，對高效的抗氧化劑的開發(fā)并用于保護機體免受自由基的破壞是十分必要的[8]。熱水浸提法為傳統(tǒng)且最為常用的水溶性多糖制備方法，但耗時長、效率低[9]。微波輔助提取法是利用微波對物質進行萃取的一種新興技術，具有耗時短、效率高、節(jié)省溶劑、最終產生的物質產量高而不改變其性質等優(yōu)勢[10-12]。作為一種替代傳統(tǒng)方法的潛在方法，該方法受到越來越多的關注[13-14]。

目前，在發(fā)芽糙米中的功能成分的研究報道中對多糖的研究甚少，劉曉飛等[15]曾采用超聲波輔助雙水相法萃取對發(fā)芽糙米多糖的工藝優(yōu)化及其抗氧化活性進行過研究。本試驗擬采用微波輔助法對發(fā)芽糙米多糖(germinated brown rice polysaccharides, GBRP)進行提取，用響應面試驗對其工藝進行優(yōu)化，并研究GBRP的抗氧化活性，旨在為發(fā)芽糙米的增值利用和新型多糖的制備提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)芽糙米：由東北產糙米經某谷物公司生產車間1 000 kg 級大生產制備；

石油醚(35～60 ℃)、濃硫酸、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

葡萄糖：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

苯酚：分析純，成都市萇征化玻有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·) ：梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；

中藥粉碎機：FY-250型，永康市久品工貿有限公司；

微波科學實驗爐：ORW08S-3H型，南京奧潤微波科技有限公司；

掃描型紫外可見分光光度計：UV-6100型，上海美普達儀器有限公司；

高速冷凍離心機：Gentrifuge 5180R型，德國Eppendorf公司；

電子天平：FA2104型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.2 發(fā)芽糙米的前處理

將50 kg發(fā)芽糙米用碾米機去除胚乳(即分離除去大量淀粉)得到5.5 kg發(fā)芽糙米米糠(含有約10%碎米)。取該米糠1.0 kg浸泡于5 L 石油醚中并攪拌4 h脫脂處理后，過濾，置于通風櫥風干，粉碎，過60目篩，密封保存，備用。

1.3 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[16]。

1.4 微波輔助提取GBRP

1.4.1 提取工藝 稱取1.0 g前處理的發(fā)芽糙米米糠，在40 ℃ 下用去離子水按一定的液料比混合后，置于微波科學實驗爐，設定微波功率，采用不同的液料比、微波提取時間、微波功率、提取次數(具體數據設計見1.4.1)4個因素進行微波輔助提取。提取完后將混合物離心(8 000 r/min，10 min)，取5 mL上清液加25 mL乙醇沉淀。醇沉之后再離心(8 000 r/min，10 min)，去上清液，將沉淀冷凍干燥后，復溶于5 mL去離子水中，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

1.4.2 單因素試驗 參考文獻[17～18]的條件，以去離子水為提取劑，分別就微波功率、微波時間、液料比和微波次數做單因素試驗。

(1) 微波功率：固定微波溫度40 ℃，微波時間4 min，液料比20∶1 (mL/g)，提取次數2次，采用以上選出的結果，考察不同微波功率200，300，400，500，600，700 W對GBRP提取率的影響。

(2) 微波時間：固定微波溫度40 ℃，液料比20∶1(mL/g)，提取次數2次，采用以上選出的結果，考察不同微波時間2，3，4，5，6，7 min對GBRP提取率的影響。

(3) 液料比：固定微波溫度40 ℃，提取次數2次，采用以上選出的結果，考察不同液料比10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1 (mL/g)對GBRP提取率的影響。

(4) 提取次數：其他條件采用以上選出的結果，考察不同提取次數1，2，3，4，5次對GBRP提取率的影響。

1.5 GBRP的抗氧化活性試驗

1.5.1 GBRP溶液的配制 稱取50 g發(fā)芽糙米米糠，按照試驗得到的最優(yōu)提取條件提取GBRP，醇沉后冷凍干燥得GBRP固體，將其配制為不同濃度的多糖溶液，測定其抗氧化活性。

1.5.2 還原力測定 根據文獻[19]的方法，取不同濃度的樣品溶液5.0 mL，依次加入pH值6.6的1.0 mL 0.2 mo1/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、1.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液，充分混合，于50 ℃水浴20 min，冷卻后加入10%三氯乙酸1.0 mL，并以5 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL，再加1 mL蒸餾水和0.1 mL 0.1%三氯化鐵，靜置10 min后在波長700 nm 處測吸光值。以超純水作為陰性對照，以VC溶液為陽性對照，重復測3次，還原力Y1以吸光值為指標。

1.5.3 清除·OH能力的測定 根據文獻[20]的方法修改如下，取不同濃度的樣液5.0 mL，加入9 mmol/L 硫酸鐵溶液1.0 mL后，加8.8 mmol/L 雙氧水溶液0.1 mL，搖勻，靜置10 min，加入9 mmol/L的水楊酸溶液300 μL，37 ℃水浴30 min后，于波長510 nm處測吸光度；以超純水代替雙氧水為樣品本底組；以超純水代替樣品溶液為空白對照組；以VC作為陽性對照，重復測3次?！H清除率按式(1)計算：

(1)

式中：

Y2——·OH清除率，%；

AX——樣品組吸光值；

AXo——樣品本底組吸光值；

A——空白對照組吸光值。

(2)

式中：

AX——樣品組吸光值；

A——空白對照組吸光值。

1.5.5 清除DPPH·能力的測定 根據文獻[22]的方法，取不同濃度的樣液5.0 mL，加入1.0 mL(0.2 mmol/L)DPPH· 乙醇溶液，避光反應30 min，于517 nm波長處測定吸光度Ax。超純水為空白組；將相同量無水乙醇置換DPPH·溶液為本底組，以同濃度的VC溶液作為陽性對照，重復測3次。DPPH·清除率按式(3)計算：

(3)

式中：

Y4——DPPH·清除率，%；

AX——樣品組吸光值；

AXo——樣品本底組吸光值；

A——空白對照組吸光值。

1.5.6 抑制脂質過氧化能力的測定 根據文獻[23]的方法，分別加入脂質體磷酸鹽緩沖分散系(LLS)1.0 mL、400 μmol/L三氯化鐵溶液1.0 mL、不同濃度的樣品5.0 mL，避光于37 ℃ 水浴1 h，加入三氯乙酸-硫代巴比妥酸-鹽酸 2.0 mL，沸水浴15 min，以6 000 r/min離心15 min，取上清液于波長535 nm處測吸光度?？瞻坠芤哉麴s水代替樣品測得吸光度，重復測3次。脂質過氧化抑制率按式(4)計算：

(4)

式中：

Y5——脂質過氧化抑制率，%；

AX——樣品組吸光值；

A——空白對照組吸光值。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

標準曲線方程為y=0.015 4x+0.002 8，R2=0.999 5，表明標準溶液的吸光度與不同濃度之間有很好的線性關系。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 微波功率對GBRP提取率的影響 由圖1可知， GBRP提取率在微波功率600 W以下時逐漸增加；微波功率在600 W時，提取率達到最大值(2.30%)；而功率繼續(xù)增加時，GBRP提取率隨著功率的增加而緩慢降低，可能是在微波功率較小時，促進發(fā)芽糙米米糠中多糖的溶出；當微波功率達到一定值后，過高的功率對溶出的多糖結構產生了影響，多糖的提取率降低。因此微波功率在600 W時為最佳條件。

圖1 微波功率對GBRP提取率的影響

Figure 1 Effect of microwave power on the extraction efficiency of polysaccharides from germinated brown rice

2.2.2 微波時間對GBRP提取率的影響 由圖2可知，GBRP提取率在 4 min內隨著時間的延長而增加；在4 min時達到最大提取率(2.01%)；提取時間繼續(xù)延長后多糖的提取率卻明顯降低，可能是長時間的微波輻照會破壞多糖的結構，也可能是長時間的微波處理使提取環(huán)境中局部溫度升高而導致多糖的損失，進而影響了多糖的提取率。因此微波時間在4 min時為最佳條件。

圖2 微波時間對GBRP提取率的影響

Figure 2 Effect of extraction time on the extraction efficiency of polysaccharides from germinated brown rice

2.2.3 液料比對GBRP提取率的影響 由圖3可知，多糖的提取率隨液料比的增加先增加后減少，當液料比為25∶1(mL/g)時提取率最大(2.68%)。這可能是，液料比較少時隨著溶劑量的增加，物料與溶劑間的濃度差增加，有利于多糖的傳遞速度且增加了多糖的溶出量；液料比較大時微波對物料輻照能力減弱，或使非多糖物質的溶出量增加，從而導致了多糖含量的降低。因此液料比在25∶1 (mL/g)時為最佳條件。

圖3 液料比對GBRP提取率的影響

Figure 3 Effect of liquid-solid ratio on the extraction efficiency of polysaccharides from germinated brown rice

2.2.4 提取次數對GBRP提取率的影響 由圖4可知，提取1次的效果不佳，提取2次的多糖提取率(2.56%)相較于提取1次的(1.46%)增加了約1倍；提取次數超過2次后，提取率卻不再顯著增大。從效率和成本等多方面考慮，提取2次為宜。

圖4 提取次數對GBRP提取率的影響

Figure 4 Effect of number of extractions on the extraction efficiency of polysaccharides from germinated brown rice

2.3 響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取GBRP條件

2.3.1 響應面優(yōu)化試驗設計 根據各單因素試驗結果，采用響應面Box-Behnken模型，選擇自變量為微波功率、液料比、微波時間，以GBRP提取率(Y)為響應值，設計三因素三水平試驗。試驗因素及水平見表1。

2.3.2 響應面試驗設計及結果 根據表2試驗結果，運用Design-Expert 8.0數據統(tǒng)計軟件進行多元回歸擬合，得到GBRP提取率對自變量微波功率、微波時間和液料比的二次多項回歸方程：

Y=2.8+0.076A-0.26B-0.28C-0.085AB-0.072AC-0.37BC-1.1A2-0.59B2-0.48C2。

(5)

表1 GBRP響應面分析因素及水平表

表2 GBRP響應面試驗設計及結果

Table 2 Experimental design and result of response surface of germinated brown rice prolysaccharides

試驗號ABCY/%110-11．6821010．983-1010．924-1-101．2251-101．4961100．8370002．788-1100．9090110．80100002．79110002．87120-1-11．93130002．82140002．75150-112．101601-12．1017-10-11．33

表3 GBRP響應面回歸方程的方差分析表?

Table 3 Variance analysis table of response surface regression equation of germinated brown rice prolysaccharides

來源平方和自由度均方F值P值顯著性模型10．0791．12 470．19<0．0001??A0．0510．0519．550．0031??B0．5610．56233．900．0031??C0．6310．63263．61<0．0001??AB0．0310．0312．150．0102?AC0．0210．028．840．0207?BC0．0110．012．68<0．0001??A25．0815．082135．45<0．0001??B21．4811．48623．35<0．0001??C20．9510．95400．96<0．0001??失擬檢驗0．0132．79×10-3 1．35 0．3775不顯著 純差0．0142．07×10-3總差10．0916

由表3可知，模型顯著(P模型<0.000 1)，失擬檢驗不顯著(P失擬>0.05)，可用于提取GBRP試驗的預測；各因素對GBRP提取率的影響程度大小為微波時間>液料比>微波功率；A、B、C、BC、A2、B2、C2影響極顯著，AB、AC影響顯著，說明各因素對GBRP提取率的影響均為非線性關系。

2.3.3 響應面的優(yōu)化與驗證 在回歸方程優(yōu)化所得最佳條件下，即微波功率604.89 W，液料比23.81∶1 (mL/g)，微波時間3.85 min，GBRP提取率的預測值為2.85%；在改進后所得條件下，即在微波功率604 W，液料比24∶1(mL/g)，微波時間3.83 min，驗證實驗所得提取率平均值為2.82%，誤差值為1.05%，說明回歸方程能有效地反映各因素對GBRP提取率的影響，證明應用響應面法優(yōu)化微波輔助法提取GBRP的回歸模型可靠。

2.4 GBRP的抗氧化活性

2.4.1 GBRP還原力的測定 由圖5可知，微波輔助法提取的GBRP還原力逐漸增加，當濃度達到0.4 mg/mL時，吸光度達到0.196，之后趨于平穩(wěn)；而VC在該濃度時吸光度達1.073，GBRP的還原力約為VC的1/5。

圖5 GBRP的還原力

2.4.2 GBRP對·OH的清除作用 由圖6可知，微波輔助法提取的GBRP對·OH清除能力也是隨著濃度的增大而增加，達到一定濃度值后趨于相對平穩(wěn)。當GBRP濃度達到0.5 mg/mL時，對·OH的清除率達到最大值(88.41%)。但VC在此濃度對·OH清除率僅為64.46%。由擬合曲線Y=183.57X+112.04 (R2=0.909)計算得到GBRP的半最大效應濃度(EC50)值為0.211 mg/mL。說明GBRP溶液對·OH 有很強的清除能力，不僅高于文獻[24]報道的普通糙米米糠多糖對·OH的最高清除率(63.8%)，也明顯高于VC的清除能力。提示糙米在發(fā)芽時啟動并激活了各種酶，經酶促作用改變了多糖的活性，提高了多糖的抗氧化能力。

圖6 GBRP對·OH的清除作用

Figure 6 Scavenging effect on hydroxyl radical of prolysaccharides from germinated brown rice

圖7 GBRP對的清除作用

Figure 7 Scavenging effect on Super oxide anion radical of polysaccharide from germinated brown rice

2.4.4 GBRP對DPPH·的清除作用 由圖8可知，超聲波輔助提取的GBRP溶液對DPPH·清除能力隨著濃度的增大而增加，清除率達到最大值后趨于平穩(wěn)。當GBRP濃度達到0.4 mg/mL時，對DPPH·清除率達到最大值(52.71%)，但VC在此濃度對DPPH·清除率達90.49%。由擬合曲線Y=24.728X+41.712 (R2=0.875)計算得GBRP的EC50值為0.34 mg/mL。結果表明，GBRP溶液對DPPH· 的清除能力低于VC的，而與文獻[24]和[25]報道的同濃度的普通糙米米糠多糖溶液對DPPH·的清除能力(51.8%)相近。

圖8 GBRP對DPPH·的清除作用

Figure 8 Scavenging effect on DPPH radical of polysaccharide from germinated brown rice bran

2.4.5 GBRP對脂質過氧化的抗氧化作用 脂質過氧化過程將產生多種小分子產物，如丙二醛，會引起多種細胞功能的衰退，并且會導致多種疾病的發(fā)生[26]。由圖9可知，微波輔助法提取的GBRP溶液對抑制脂質過氧化能力隨GBRP濃度的增大而逐漸增加，當GBRP濃度為0.5 mg/mL時，對抑制脂質過氧化能力趨于平穩(wěn)(60.86%)，而VC濃度在0.5 mg/mL 時僅為39.97%。由擬合曲線Y=568.12X+6.473 4 (R2=0.865 2)計算得到GBRP的EC50值為0.077 mg/mL。GBRP溶液的抑制脂質過氧化能力不僅高于文獻[27]報道的普通糙米米糠多糖的(49.30%)，還高于VC的。提示糙米經發(fā)芽過程改變了多糖的活性，提高了多糖的抗氧化能力，特別是對脂質過氧化的抗氧化能力明顯增強。

圖9 GBRP抑制脂質過氧化能力

3 結論

本試驗對微波輔助提取GBRP的工藝條件及其抗氧化活性進行研究。結果表明，其最佳提取工藝條件為提取溫度40 ℃、微波功率604 W、液料比24∶1 (mL/g)、微波時間3.83 min、提取次數2次，該條件下GBRP提取率為2.82%；同未發(fā)芽的糙米多糖的抗氧化活性進行對比后證明微波輔助有利于GBRP的提取，并且通過多指標結果表明糙米經發(fā)芽活化，改變了其多糖活性，GBRP的抗氧化性高于普通糙米多糖的。

GBRP對·OH的清除率和抑制脂質過氧化能力不僅高于普通糙米多糖，甚至高于同濃度VC的，表明發(fā)芽糙米可作為高抗氧化性多糖進行研究開發(fā)，并可作為功能食品、化妝品等增值產品的一個新的原料。但該試驗僅對發(fā)芽糙米的粗提多糖進行了研究，后期將從成分和結構角度對GBRP進一步深入分析。

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