蜂膠黃酮的乙醇分級(jí)提取及其抗氧化活性比較

姜紅宇JIANG Hong-yu 盤(pán) 雪 李目武 - 王宗成,2 -,2

(1. 湖南科技學(xué)院湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心，湖南 永州 425100；2. 中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410083)

蜂膠是蜜蜂用于維持整個(gè)群體健康的有效物質(zhì)，一個(gè)5～6萬(wàn)只的蜂群一年只能生產(chǎn)蜂膠70～110 g，被譽(yù)為“紫色黃金”[1]。蜂膠主要有黃酮類(lèi)化合物、萜類(lèi)化合物、酚類(lèi)化合物、有機(jī)酸類(lèi)化合物、醛與酮類(lèi)化合物、酯與醇類(lèi)化合物等[2-4]。蜂膠被稱(chēng)為“黃酮類(lèi)化合物的寶庫(kù)”[5]，蜂膠黃酮類(lèi)化合物與蜂膠的大部分生理及藥理學(xué)活性，如抗菌、抗病毒、抗氧化、抗高血壓、降血糖、增強(qiáng)免疫力、抗癌、促進(jìn)細(xì)胞再生、美容養(yǎng)顏、鎮(zhèn)痛等作用密切相關(guān)[6-9]。因此，關(guān)于蜂膠黃酮提取分離的研究頗多[10-13]。付英娟[11]采用不同溶劑對(duì)陜西產(chǎn)蜂膠進(jìn)行了黃酮提取，其最佳超聲波輔助提取條件為乙醇濃度79.51%，提取時(shí)間19.31 min，提取功率538.28 W，液料比39.48∶1；馬士巧等[12]采用不同極性溶劑提取東北黑蜂膠中的活性成分，并研究了其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)用甲醇和乙醇提取得到的黃酮、多酚和三萜都較高，且抗氧化活性也都較強(qiáng)；張?jiān)葡愕萚13]采用水和3個(gè)不同濃度的乙醇溶液對(duì)泰山產(chǎn)蜂膠進(jìn)行黃酮提取，發(fā)現(xiàn)70%乙醇提取效果最好。然而，這些研究都是采用一種特定的溶劑進(jìn)行提取，未見(jiàn)分級(jí)提取的研究和不同蜂膠黃酮活性物質(zhì)的極性大小與活性強(qiáng)弱間關(guān)系的研究。為了篩查永州粗蜂膠中活性成分的極性差異以及根據(jù)活性強(qiáng)弱選擇合適方法提取分離高活性的蜂膠黃酮，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，選擇水和9個(gè)不同濃度的乙醇分級(jí)提取永州粗蜂膠中的活性成分，以黃酮含量為指標(biāo)，比較不同提取條件下蜂膠黃酮含量及其抗氧化活性的差異，通過(guò)不同溶劑提取的永州粗蜂膠中黃酮質(zhì)量、含量和抗氧化活性差異分析永州粗蜂膠中黃酮性質(zhì)，以期為蜂膠黃酮開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

1.1.1 原料與試劑

粗蜂膠：產(chǎn)地湖南永州，冷凍24 h后粉碎，過(guò)20目篩，置干燥箱中備用；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：98.0%，北京方程生物科技有限公司；

乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)。

1.1.2 儀器設(shè)備

電子天平：TE124S型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

分光光度計(jì)：UV2800S型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-201D型，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 參照文獻(xiàn)[14]，配置0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，以不加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白對(duì)照，在λ=510 nm處分別測(cè)定0.01～0.06 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為：A=16.853C+0.040 2，R2=0.996 7，說(shuō)明具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

1.2.2 蜂膠黃酮的分級(jí)提取與含量測(cè)定 精密稱(chēng)取10.00 g 粗蜂膠于250 mL平底燒瓶中，按1∶20(g/mL)的料液比加入蒸餾水，置于集熱式磁力攪拌器中70 ℃提取1 h后，取出平底燒瓶，趁熱倒入燒杯中用保鮮膜密封，置于陰涼處24 h[13]。樣品分為3層，上層為蜂蠟，中間為水提取液，下層為處理后蜂膠。用玻璃棒將上層蜂蠟取出，在25 ℃烘箱中烘干并進(jìn)行稱(chēng)重。將水提取液轉(zhuǎn)移到已經(jīng)稱(chēng)重的平底燒瓶中，于60 ℃下減壓濃縮除去溶劑，再于25 ℃烘箱中烘干，稱(chēng)重作為樣品1。

將下層處理后蜂膠用20%的乙醇溶液轉(zhuǎn)移至已經(jīng)稱(chēng)重的平底燒瓶中，乙醇溶液用量為處理后蜂膠的1∶20(g/mL)，70 ℃回流提取1 h后取出，用保鮮膜密封，沉降后分為2層，上層為乙醇提取液，下層為處理后蜂膠。將上層乙醇提取液轉(zhuǎn)移到已經(jīng)稱(chēng)重的平底燒瓶中，于60 ℃下減壓濃縮除去溶劑，再于25 ℃烘箱中烘干，稱(chēng)重作為樣品2。同理，分別用30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液和無(wú)水乙醇，制備樣品3、樣品4、樣品5、樣品6、樣品7、樣品8、樣品9和樣品10。提取完10個(gè)樣品后，原平底燒瓶中殘余物在25 ℃烘箱中烘干并進(jìn)行稱(chēng)重。

將樣品1～10號(hào)，分別溶于50%乙醇中，并定容至100 mL，從中取出5 mL用50%乙醇稀釋至50 mL，作為樣品溶液測(cè)定吸光度，依據(jù)回歸方程計(jì)算黃酮含量。測(cè)定后，發(fā)現(xiàn)樣品8～10號(hào)，由于濃度過(guò)低，直接取非稀釋液測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮含量。

1.2.3 蜂膠黃酮的抗氧化活性測(cè)定

(1) 還原能力：參照文獻(xiàn)[15]。

(2) 清除DPPH自由基能力：參照文獻(xiàn)[16]。

(3) 清除ABTS自由基能力：參照文獻(xiàn)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品的蜂膠黃酮的乙醇分級(jí)提取試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，蜂膠在水中析出蜂蠟后，在水中的溶解量最少，隨著乙醇濃度的升高，溶解量先增大后減少，在50%的乙醇中溶解質(zhì)量最多(14.52%)，整個(gè)分級(jí)提取過(guò)程中，累積溶解百分?jǐn)?shù)(除去蜂蠟)達(dá)到76.75%，說(shuō)明永州粗蜂膠在水和乙醇中可溶性成分非常高，且蜂蠟含量較低，為13.37%。

由表1可知，水提取液中提取到的黃酮質(zhì)量比20%和30%乙醇提取液中的略高，隨著乙醇濃度的升高，提取到的黃酮質(zhì)量先增加后減少，在50%乙醇提取液中得到的黃酮質(zhì)量最高，隨后減少，說(shuō)明黃酮基本提取完全。在水提取、40%乙醇提取、50%乙醇提取和60%乙醇提取過(guò)程中得到的黃酮含量較高，分別為59.9%，41.8%，50.8%，63.4%，說(shuō)明永州粗蜂膠中含有一些水溶性黃酮，因此水提取得到的蜂膠黃酮質(zhì)量和含量較高，與馬士巧等[12]報(bào)道的東北黑蜂膠水提物中總酚含量高、黃酮含量低，以及張?jiān)葡鉡13]報(bào)道的泰山蜂膠水提黃酮含量較低還是有差異的。另外，在40%～60%乙醇提取過(guò)程中得到的蜂膠黃酮質(zhì)量和含量較高，含有大量中等極性的黃酮。整個(gè)分級(jí)提取過(guò)程中，累積提取得到的黃酮達(dá)到2.66 g，提取到的總蜂膠黃酮占全部提取物的34.64%，但是80%乙醇、90%乙醇和無(wú)水乙醇提取得到的黃酮質(zhì)量較少，雜質(zhì)較多，從成本上考慮得到的提取物可以舍棄，將其他提取物合并計(jì)算，得到的黃酮可達(dá)2.58 g，提取到的蜂膠黃酮占提取物中的含量可達(dá)到41.18%，此時(shí)所得提取物中蜂膠黃酮含量明顯高于梁巧楣[18]報(bào)道用70%乙醇冷浸再乙酸乙酯萃取湖南衡陽(yáng)產(chǎn)蜂膠得到的蜂膠浸膏中黃酮含量(30.7%)。整個(gè)分級(jí)提取過(guò)程中，從粗蜂膠中累積提取得到的黃酮得率為26.59%，從數(shù)據(jù)可知用水、20%～70%乙醇從粗蜂膠提取得到的黃酮得率較高，用80%乙醇、90%乙醇和無(wú)水乙醇提取黃酮得率較低，從成本上考慮后者得到的提取物可以舍棄，此時(shí)黃酮得率可達(dá)到25.81%，明顯高于安硯波等[19]報(bào)道用72.48% 乙醇超聲輔助提取山東產(chǎn)蜂膠的得率(13.07%)。說(shuō)明采用乙醇分級(jí)提取法提取永州粗蜂膠黃酮具有較好的提取分離效果，得到的蜂膠黃酮純度較高、得率較高。

2.2 蜂膠黃酮的抗氧化活性

2.2.1 還原能力 由表2可知，隨蜂膠黃酮濃度和VC濃度的增加，還原能力增強(qiáng)，呈現(xiàn)量效關(guān)系，其中50%乙醇提取和60%乙醇提取黃酮還原能力較強(qiáng)，且顯著高于VC(P<0.05)；水提取黃酮、40%乙醇提取黃酮、70%乙醇提取黃酮比VC還原能力稍弱；30%乙醇提取黃酮還原能力最差。說(shuō)明粗蜂膠中含有不同類(lèi)型的蜂膠黃酮，提取活性較高的蜂膠黃酮，可以選擇水提取水溶性黃酮，還可以選擇40%～70%乙醇提取中等極性黃酮；80%、90%乙醇和無(wú)水乙醇提取的黃酮還原能力相近且較差。

2.2.2 清除DPPH自由基能力 由表3可知，隨蜂膠黃酮濃度和VC濃度的增加，清除DPPH自由基能力增強(qiáng)，呈現(xiàn)量效關(guān)系；50%乙醇提取和60%乙醇提取的黃酮清除DPPH自由基的能力顯著性高于VC的(P<0.05)，且50%乙醇提取的黃酮清除DPPH自由基能力最強(qiáng)；70%乙醇提取的黃酮和VC清除DPPH自由基能力相差不大；水提取的黃酮、40%乙醇提取黃酮比VC清除DPPH自由基能力稍弱；30%乙醇提取的黃酮清除DPPH自由基能力最差。說(shuō)明粗蜂膠中含有不同類(lèi)型的蜂膠黃酮，提取活性較高的蜂膠黃酮，可以選擇水提取水溶性黃酮，還可以選擇40%～70%乙醇提取中等極性黃酮；80%乙醇、90%乙醇和無(wú)水乙醇提取的黃酮清除DPPH自由基能力相近且較差。

2.2.3 清除ABTS自由基能力 由表4可知，隨蜂膠黃酮濃度和Vc濃度的增加，清除ABTS自由基能力增強(qiáng)，且呈現(xiàn)量效關(guān)系；50%乙醇提取的黃酮清除ABTS自由基的能力顯著高于VC的(P<0.05)；水提取的、40%乙醇提取、60%乙醇提取的和70%乙醇提取的黃酮清除ABTS自由基的能力與VC的相近；30%乙醇提取的黃酮清除ABTS自由基能力最差。說(shuō)明粗蜂膠中含有不同類(lèi)型的蜂膠黃酮，提取活性較高的蜂膠黃酮，可以選擇水提取水溶性黃酮，還可以選擇40%～70%乙醇提取中等極性黃酮；80%乙醇、90%乙醇和無(wú)水乙醇提取的黃酮清除ABTS自由基能力相近且較差。

? a：水提取過(guò)程中上層析出的蜂蠟質(zhì)量；b：不含蜂蠟的溶解質(zhì)量；c：乙醇分級(jí)提取到的總蜂膠黃酮占全部提取物中的含量。

? 同列中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

? 同列中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

? 同列中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

采用乙醇分級(jí)提取永州粗蜂膠能得到純度較高、得率較高的蜂膠黃酮，提取物中蜂膠黃酮的含量可達(dá)到41.2%，黃酮得率可達(dá)到25.81%，且可以按照極性大小進(jìn)行分離，說(shuō)明乙醇分級(jí)提取分離粗蜂膠黃酮具有可行性，且永州粗蜂膠中不但含有大量中等極性黃酮，還含有較多水溶性黃酮。但是分級(jí)提取前用熱水溶解蜂蠟，并冷卻析出除去了這部分不含黃酮的成分，蜂蠟是否具有輔助藥效活性，還有待進(jìn)一步研究。

乙醇分級(jí)提取的不同蜂膠黃酮的抗氧化活性具有明顯差異，且隨蜂膠黃酮濃度的增加，抗氧化活性增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。說(shuō)明永州粗蜂膠中含有不同類(lèi)型的蜂膠黃酮，提取活性較高的蜂膠黃酮，可以選擇水提取水溶性黃酮和40%～70%乙醇提取中等極性黃酮。由于不同地區(qū)蜂膠的抗氧化活性差異較大[20]，且未見(jiàn)乙醇分級(jí)提取得到的不同蜂膠黃酮樣品的抗氧化活性差異報(bào)道，與其他文獻(xiàn)抗氧化活性沒(méi)有較好的可比性，此外黃酮類(lèi)物質(zhì)只是衡量物質(zhì)抗氧化活性的一個(gè)指標(biāo)，能不能將黃酮類(lèi)物質(zhì)含量作為唯一衡量抗氧化的指標(biāo)，值得進(jìn)一步研究。

乙醇分級(jí)提取獲得的不同蜂膠黃酮樣品中黃酮質(zhì)量、含量與抗氧化活性之間有一定的相關(guān)性，說(shuō)明乙醇分級(jí)提取蜂膠黃酮從提取效果、分離效果和抗氧化活性上都具有一定優(yōu)勢(shì)。

[1] 羅火林, 劉星星, 龔上佶, 等. 不同地區(qū)蜂膠和樹(shù)膠的紅外譜圖分析[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2015, 35(11): 3 058-3 062.

[2] 張翠平, 平舜, 黃帥, 等. 蜂膠的地理來(lái)源、植物來(lái)源及化學(xué)成分的研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2013, 48(22): 1 889-1 892.

[3] 田進(jìn)軍, 薛艷, 候振健. 偽三元相圖法制備O/W型蜂膠微乳[J]. 食品與機(jī)械, 2011, 27(3): 127-129.

[4] 徐響, 張紅城, 董捷. 蜂膠功效成分研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(9): 286-289.

[5] 房柱. 蜂膠——黃酮化合物的寶庫(kù)[J]. 蜜蜂雜志, 1998(9): 11-12.

[6] 潘婭, 鄭德俊, 周莉玲, 等. 蜂膠生理活性與藥理作用研究淺釋[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2004, 22(2): 381-382.

[7] SAWICKA D, CAR H, BORAWSKA M H, et al. The anticancer activity of propolis[J]. Folia Histochemica Et Cytobiologica, 2012, 50(1): 25-37.

[8] MASSARO C F, KATOULI M, GRKOVIC T, et al. Anti-staphylococcal activity of C-methyl flavanones from propolis of Australian stingless bees (Tetragonula carbonaria) and fruit resins of Corymbia torelliana (Myrtaceae)[J]. Fitoterapia, 2014, 95(2): 247-257.

[9] AGüERO M B, GONZALEZ M, LIMA B, et al. Argentinean propolis from Zuccagnia punctata cav. (Caesalpinieae) exudates: phytochemical characterization and antifungal activity[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2010, 58(1): 194-201.

[10] 張翠平, 胡福良. 蜂膠中的黃酮類(lèi)化合物[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2009, 21(6): 1 084-1 090.

[11] 付英娟. 蜂膠中有效成分的提取及應(yīng)用研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2007: 18-31.

[12] 馬士巧, 馬海樂(lè), 潘忠禮, 等. 黑蜂蜂膠不同極性提取物的體外抗氧化活性[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2016, 16(8): 53-58.

[13] 張?jiān)葡? 楊志孝, 安蔚, 等. 不同溶劑對(duì)蜂膠黃酮提取率影響的研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2006, 17(1): 9-10.

[14] 王宗成, 蔣玉仁, 劉小文, 等. 響應(yīng)面優(yōu)化生姜莖葉總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2015, 27(9): 1 582-1 588.

[15] 歐陽(yáng)凱, 何先元, 陳飛, 等. 四齒四棱草總皂苷提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究[J]. 食品與機(jī)械, 2016, 32(7): 141-145.

[16] 劉安, 羅松, 李祁廣, 等. 不同工藝制備辣椒籽油的體外抗氧化活性比較[J]. 食品與機(jī)械, 2016, 32(6): 168-170.

[17] 陸俊, 羅丹, 張佳琦, 等. 三葉木通不同部位多酚、黃酮含量及抗氧化活性比較[J]. 食品與機(jī)械, 2016, 32(8): 132-135.

[18] 梁巧楣. 蜂膠總黃酮的制備及含量測(cè)定[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 17(17): 2 123-2 126.

[19] 安硯波, 王浩. 響應(yīng)面法優(yōu)化蜂膠總黃酮的提取工藝[J]. 中國(guó)蜂業(yè), 2016, 67(9): 46-49.

[20] 玄紅專(zhuān), 胡福良. 不同地區(qū)蜂膠抗氧化活性與化學(xué)組分的研究進(jìn)展[J]. 蜜蜂雜志, 2009, 29(2): 7-10.