姜 思，劉瑩瑩，佟少明

(1.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連116081；2.遼寧省植物生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116081)

?

4種常用抗生素對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)及光化學(xué)活性的影響

姜 思1,2，劉瑩瑩1,2，佟少明1,2

(1.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連116081；2.遼寧省植物生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116081)

采用4種不同濃度的抗生素對(duì)(氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、氯霉素(Cmp)及四環(huán)素(Tet))萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)進(jìn)行無(wú)菌化處理，研究抗生素種類及濃度對(duì)萊茵衣藻的細(xì)胞密度、葉綠素a含量及光化學(xué)活性的影響，以確定對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞無(wú)害并能抑制伴雜菌生長(zhǎng)的抗生素種類及使用濃度。結(jié)果表明：低于100 μg/mL的氨芐青霉素(Amp)及20 μg/mL的氯霉素(Cmp)處理，會(huì)使萊茵衣藻的細(xì)胞密度及葉綠素a的含量增加，卡那霉素(Kan)及四環(huán)素(Tet)各濃度的處理都會(huì)使細(xì)胞密度及葉綠素a的含量下降，并呈現(xiàn)抗生素的劑量依賴效應(yīng)；50 μg/mL的Amp及10 μg/mL的Cmp在處理3 d后會(huì)增加萊茵衣藻的實(shí)際光合效率(YII)及相對(duì)電子傳遞效率(rETR)，而后下降；Kan及Tet各濃度的處理都會(huì)使YII及rETR顯著下降。結(jié)合4種抗生素對(duì)萊茵衣藻伴生菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明在4種抗生素中，Cmp在抑菌范圍內(nèi)并不會(huì)明顯地抑制萊茵衣藻細(xì)胞的生長(zhǎng)與光化學(xué)活性，可用于萊茵衣藻細(xì)胞無(wú)菌化培養(yǎng)中。

萊茵衣藻；抗生素；微藻；光化學(xué)活性

萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)隸屬于綠藻門(mén)、團(tuán)藻目、衣藻屬，為低等的具鞭毛單細(xì)胞水生植物，廣泛分布在海洋、江河、湖泊等水域，通過(guò)光合作用獲得能量，也可以在有碳源的完全黑暗的環(huán)境中生長(zhǎng)。高度的適應(yīng)性、快速的傳代能力及其至關(guān)重要的代謝途徑使得萊茵衣藻成為生物學(xué)研究領(lǐng)域的模式生物，常被用作研究真核生物鞭毛的組裝、基體功能及功能障礙等病理效應(yīng)的模型。萊茵衣藻所含有的核、葉綠體及線粒體三套基因組，目前均已完成了測(cè)序，極大地促進(jìn)了藻類代謝、葉綠體生物起源、光合作用機(jī)制、營(yíng)養(yǎng)元素脅迫以及產(chǎn)氫等方面的研究。

微藻的無(wú)菌培養(yǎng)和保存是研究微藻生理、生化、營(yíng)養(yǎng)、藥理學(xué)及毒理學(xué)等必不可少的步驟之一，也是基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在微藻培養(yǎng)過(guò)程中，由于藻種常伴有雜藻或雜菌，而無(wú)法準(zhǔn)確進(jìn)行藻間或藻菌相互作用、兼養(yǎng)和異養(yǎng)等方面的研究?？股乜梢种扑?xì)菌的繁殖，在除菌、抑菌方面表現(xiàn)出了強(qiáng)大作用，利用微藻比雜菌具有對(duì)抗生素更強(qiáng)的耐受性，選擇使用一種或多種抗生素進(jìn)行無(wú)菌處理則較容易獲得無(wú)菌藻系。如孫雯等采用了8種常用抗生素對(duì)雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)進(jìn)行無(wú)菌化處理，結(jié)果表明：在培養(yǎng)前期加入灰黃霉素的抑菌效果最好，且對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制最?。慌囵B(yǎng)中后期添加青霉素的抑菌效果較明顯；混合使用灰黃霉素和青霉素時(shí)抑菌效果明顯優(yōu)于使用單一抗生素。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)微藻無(wú)菌化培養(yǎng)及對(duì)抗生素敏感性研究的報(bào)道相對(duì)較少，主要集中在綠藻、顫藻、螺旋藻及紫球藻等方面。

本研究中，筆者根據(jù)抗生素在抗菌機(jī)制和抗菌譜上的差別，選擇了常用的4種抗生素，氨芐青霉素(ampicillin，Amp)、卡那霉素(kanamycin，Kan)、氯霉素(chloramphenicol，Cmp)及四環(huán)素(tetracycline，Tet)應(yīng)用于萊茵衣藻的培養(yǎng)中，通過(guò)生長(zhǎng)曲線、葉綠素a含量、光化學(xué)活性等指標(biāo)來(lái)探究每種抗生素的存在濃度與萊茵衣藻的生長(zhǎng)和光化學(xué)活性之間的聯(lián)系，確定分離及純化萊茵衣藻時(shí)對(duì)藻細(xì)胞無(wú)害、同時(shí)又能抑制伴生雜菌生長(zhǎng)的抗生素種類及濃度，以期為萊茵衣藻無(wú)菌系的建立提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)

萊茵衣藻(C.reinhardtii)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫(kù)，使用TAP(tris acetate phosphate)液體培養(yǎng)基，其成分按文獻(xiàn)配制，培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，光照強(qiáng)度為60 μmol/(m·s)，光暗時(shí)間比為12∶ 12。培養(yǎng)過(guò)程中每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶數(shù)次，防止微藻附壁下沉，待進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將其按5×105個(gè)/mL的密度接種后，用抗生素處理，然后測(cè)定分析微藻的相關(guān)生理指標(biāo)。在藻種傳代培養(yǎng)過(guò)程中，嚴(yán)格按照無(wú)菌操作規(guī)程進(jìn)行，細(xì)菌培養(yǎng)使用LB固體培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻細(xì)胞密度測(cè)定

將4種抗生素分別加入到處于指數(shù)生長(zhǎng)期的萊茵衣藻藻液中，各抗生素的終濃度分別設(shè)定4個(gè)梯度(表1)，以未加入抗生素的藻液作為對(duì)照組。采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每天定時(shí)吸取少量搖勻的藻液，置于視野為40×10倍的光學(xué)顯微鏡下觀察，記錄藻細(xì)胞總數(shù)。

表1 4種抗生素的質(zhì)量濃度

1.2.2 葉綠素a含量的測(cè)定

4種不同濃度的抗生素處理指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液時(shí)，每天每個(gè)處理組各取5 mL的藻液，以6 000 r/min離心10 min，去除上清液后，將藻細(xì)胞用90%丙酮在黑暗條件下提取2次，每次24 h，最后將提取液定容至10 mL，使用紫外分光光度計(jì)在750、663、645和630 nm下測(cè)定吸光度。

1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

利用多激發(fā)波長(zhǎng)調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(德國(guó)，Walz)測(cè)定藻細(xì)胞的光化學(xué)活性[10]。不同種類及濃度的抗生素處理后，每天取樣，測(cè)定熒光參數(shù)。檢測(cè)過(guò)程如下：首先將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的萊茵衣藻培養(yǎng)液黑暗處理12 h，然后取2 mL藻液加入石英杯中，設(shè)置檢測(cè)光(measure light，ML)波長(zhǎng)為440 nm，并將實(shí)時(shí)熒光(current fluorescence level)Ft調(diào)至1.5，運(yùn)行腳本sigma 500 chl并進(jìn)行O-I1擬合，保存萊茵衣藻光學(xué)截面積數(shù)據(jù)，在sp-analysis模式下進(jìn)行快速光曲線測(cè)定，將保存的光學(xué)截面積數(shù)據(jù)應(yīng)用于快速光曲線，最后在view-mode模式下，記錄葉綠素?zé)晒獾某跏贾?F0)及最大值(Fm)、實(shí)際光量子產(chǎn)額(YII)及相對(duì)電子傳遞效率(rETR)。

1.3 抗生素對(duì)萊茵衣藻伴生細(xì)菌的抑制作用

采取平板涂布結(jié)合取樣鏡檢的方法，對(duì)經(jīng)抗生素處理7 d后的藻液中存在的細(xì)菌數(shù)目進(jìn)行檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中，將處理組和對(duì)照組藻液用TAP液體培養(yǎng)基稀釋100倍后，涂布在LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)24 h以上，直至長(zhǎng)出菌落為止，根據(jù)單菌落的數(shù)目確定藻液中細(xì)菌的密度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)平行處理，取平均值(Mean±SD)。以T檢驗(yàn)比較對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間的差異顯著性，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

圖1 不同濃度的Amp(a)、Cmp(b)、Kan(c)及Tet(d)處理對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of Amp (a),Cmp (b),Kan (c) and Tet(d) at different concentration on growth of C. reinhardtii

目前，用于微藻無(wú)菌化處理研究所使用的抗生素種類多樣，但針對(duì)于不同微藻所使用的抗生素種類及其施加劑量不同，其抑菌的效果也不同。抗生素既可以通過(guò)與微藻的某些成分結(jié)合，直接作用于藻體，從而改變微藻的生理生化性質(zhì)，造成微藻生長(zhǎng)狀態(tài)的改變，又可以通過(guò)抑制與微藻共生的伴生菌的生長(zhǎng)，從而間接影響藻類的生長(zhǎng)[11]。本研究根據(jù)抗生素在抗菌機(jī)制和抗菌譜上的差別，選擇了基因工程中常用的4種抗生素Amp、Cmp、Kan及Tet應(yīng)用于萊茵衣藻的無(wú)菌化研究，通過(guò)生長(zhǎng)曲線、葉綠素a含量、光化學(xué)活性等指標(biāo)并結(jié)合4種抗生素的抑菌效果來(lái)探究4種抗生素對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)及光合作用的影響。

2.1 不同抗生素對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)的影響

經(jīng)抗生素處理7 d后，萊茵衣藻生長(zhǎng)狀況如圖1所示。由圖1(a)可知：當(dāng)Amp的處理質(zhì)量濃度為50及100 μg/mL時(shí)，對(duì)萊茵衣藻的生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，其中100 μg/mL促進(jìn)生長(zhǎng)的效果高于50 μg/mL；當(dāng)Amp處理質(zhì)量濃度為120 μg/mL時(shí)，對(duì)萊茵衣藻的生長(zhǎng)有輕微的抑制作用；當(dāng)處理質(zhì)量濃度達(dá)到140 μg/mL時(shí)，則顯著抑制萊茵衣藻的生長(zhǎng)(P<0.05)。由圖1(b)可知：不同濃度的Cmp處理對(duì)萊茵衣藻的生長(zhǎng)均有顯著促進(jìn)作用；當(dāng)Cmp質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)，就表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用(P<0.05)，濃度越高，促進(jìn)生長(zhǎng)的效應(yīng)越顯著。由圖1(c)可知：當(dāng)Kan的處理質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，對(duì)萊茵衣藻的抑制作用已達(dá)到顯著(P<0.05)，7 d后，藻液變黃，當(dāng)Kan的終質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，極顯著抑制萊茵衣藻的生長(zhǎng) (P<0.01)，藻液7 d后變透明，鏡檢結(jié)果顯示藻細(xì)胞內(nèi)部中空，幾乎全部死亡。由圖1(d)可知：Tet質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)，表現(xiàn)出對(duì)萊茵衣藻的生長(zhǎng)具有顯著抑制作用(P<0.05)，隨著Tet濃度的增加，抑制萊茵衣藻生長(zhǎng)的作用更加明顯，藻液顏色逐漸變黃并且加深，7 d后鏡檢結(jié)果顯示，藻細(xì)胞內(nèi)部中空，幾乎全部死亡。

圖2 不同濃度的Amp(a)、Cmp(b)、Kan(c)及Tet(d)處理對(duì)萊茵衣藻葉綠素a含量的影響Fig.2 Effects of Amp (a),Cmp (b),Kan (c) and Tet(d) at different concentration on the content Chl a of C. reinhardtii

不同抗生素對(duì)于微藻的毒性效應(yīng)有所不同，而不同微藻種類對(duì)于抗生素的敏感性也有差異。在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，氨芐青霉素、卡那霉素及鏈霉素的質(zhì)量濃度都小于200 μg/mL時(shí)，對(duì)綠色巴夫藻(Pavlovaviridis) 的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，而在質(zhì)量濃度分別低于800、500及200 μg/mL 時(shí)，對(duì)米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)有促進(jìn)作用，但如果分別高于此質(zhì)量濃度，則表現(xiàn)出顯著的抑制作用，可見(jiàn)不同藻類對(duì)于不同抗生素及不同的質(zhì)量濃度的響應(yīng)程度及閾值都存在較大差異[12]。在本研究中，4種抗生素處理對(duì)萊茵衣藻的細(xì)胞密度存在著較大差異，Amp的低濃度(50和100 μg/mL)處理及Cmp各濃度(低于20 μg/mL)的處理，促使藻細(xì)胞密度增加，表明低濃度的Cmp和Amp基本上對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞無(wú)毒性，另外，由于抗生素的加入會(huì)殺死藻液中的部分抑生菌，從而促使藻細(xì)胞生長(zhǎng)的速度加快；Kan及Tet各濃度的處理，都會(huì)抑制藻細(xì)胞密度的增加，處理的后期會(huì)完全殺死藻細(xì)胞。對(duì)于萊茵衣藻等綠藻來(lái)說(shuō)，諸如Amp等抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的β-內(nèi)酰胺類的抗生素對(duì)藻細(xì)胞基本無(wú)毒性，而諸如Kan、Tet及Cmp等抑制蛋白質(zhì)合成作用的抗生素對(duì)藻細(xì)胞具有較高的毒性，但在本研究中，低濃度的Cmp(低于20 μg/mL)卻沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)萊茵衣藻的毒性，可能是因?yàn)橐种频鞍踪|(zhì)合成的抗生素主要通過(guò)與原核生物線粒體的小亞基結(jié)合來(lái)抑制其生長(zhǎng)及繁殖，在微藻等光合生物中，由于葉綠體在結(jié)構(gòu)上與線粒體相似，這類抗生素可能與葉綠體作用，從而抑制蛋白質(zhì)合成等代謝過(guò)程[13]。而Cmp主要和細(xì)菌中的核糖體50S大亞基結(jié)合，抑制肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性，從而阻止蛋白質(zhì)的合成，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可能是因?yàn)镃mp在萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，從而導(dǎo)致無(wú)毒性或者毒性不明顯。鑒于原核和真核細(xì)胞還存在著本質(zhì)上的差別，因此抗生素的抑菌作用機(jī)制在綠藻等真核細(xì)胞內(nèi)并非和原核生物是直接對(duì)應(yīng)的，其抗生素和微藻之間相互作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.2 不同抗生素對(duì)萊茵衣藻葉綠素a含量的影響

不同種類及濃度的抗生素處理過(guò)程中，葉綠素a含量的變化如圖2所示。由圖2(a)可知：當(dāng)Amp的處理質(zhì)量濃度為50及100 μg/mL時(shí)，萊茵衣藻的葉綠素a含量顯著高于未處理組，其中100 μg/mL的Amp的處理含量增加得更明顯；當(dāng)藻液中Amp終質(zhì)量濃度為120及140 μg/mL時(shí)，萊茵衣藻的葉綠素a的含量低于對(duì)照組。由圖2(b)可知：不同濃度的Cmp處理都會(huì)顯著提高萊茵衣藻中葉綠素a的含量，但當(dāng)質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，葉綠素含量低于5 μg/mL的處理組，但略高于對(duì)照組。由圖2(c)可知：各濃度的處理，萊茵衣藻的葉綠素a含量都顯著低于對(duì)照組，4 d后，葉綠素a的含量開(kāi)始下降。由圖2(d)可知：各濃度的處理使萊茵衣藻的葉綠素a含量都顯著低于對(duì)照組，1 d后，葉綠素a的含量開(kāi)始下降。

葉綠素a的含量是用來(lái)表征藻細(xì)胞生物量變化的另一重要參數(shù)。前期研究發(fā)現(xiàn)，小球藻(C.vtdgarisBeij.)、金藻8701(IsochrysisgalbanaParke 8701)和小新月菱形藻(NitzschiadosteriumHer.)葉綠素a含量受到氯霉素、遺傳霉索、青霉素3種抗生素的影響，其中0～200 μg/mL遺傳霉素明顯抑制3種微藻葉綠素a的含量，質(zhì)量濃度低于100 μg/mL氯霉素對(duì)小球藻和金藻葉綠素a含量的影響較小，但當(dāng)質(zhì)量濃度大于50 μg/mL時(shí)，會(huì)使小新月菱形藻葉綠素a的含量顯著下降；3種藻對(duì)青霉素的敏感性存在差異，當(dāng)質(zhì)量濃度低于100 μg/mL時(shí)能夠促進(jìn)3種藻葉綠素a的含量，而相對(duì)增長(zhǎng)率卻隨著青霉素濃度的升高而逐漸下降[12]。在本研究中，4種抗生素處理后，葉綠素a含量的變化與藻細(xì)胞密度的變化趨勢(shì)基本上是一致的，即低濃度的Amp(50和100 μg/mL)處理及Cmp各濃度的處理，促使藻細(xì)胞葉綠素a的含量增加，而Kan及Tet各濃度的處理都會(huì)顯著減少萊茵衣藻的葉綠素a的含量。低濃度的青霉素處理使藻細(xì)胞葉綠素a的含量上升，可能是因?yàn)橐环矫娲龠M(jìn)細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的合成，另一方面降低細(xì)胞中葉綠素酶的活性來(lái)延緩葉綠素的降解，從而提高葉綠素a的含量；而高濃度抗生素的處理會(huì)使藻細(xì)胞葉綠素a的含量下降，原因可能是：①抗生素的脅迫可以引起葉綠體膨脹破裂，類囊體膜解體，從而導(dǎo)致葉綠體從組織中流失，抗生素處理的會(huì)導(dǎo)致藻體細(xì)胞的rETR值下降，也暗示了光合囊體膜遭到了破壞；②細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，葉綠素合成受阻；③抗生素直接與藻體的某些成分結(jié)合，抑制葉綠體片層中捕光色素-蛋白復(fù)合體的合成，導(dǎo)致轉(zhuǎn)能效率降低[14]。

2.3 抗生素對(duì)萊茵衣藻光化學(xué)活性的影響

2.3.1 不同抗生素對(duì)萊茵衣藻YII的影響

圖3顯示了在4種抗生素各濃度的處理下，萊茵衣藻的YII在7 d內(nèi)的變化情況。圖3(a)顯示： 50 μg/mL的Amp處理使萊茵衣藻的YII值在7 d內(nèi)均高于未處理組；當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，處理后第1天的YII值略高于未處理組，但從第2天開(kāi)始下降，到第4天明顯低于未處理組；當(dāng)質(zhì)量濃度為120 μg/mL及140 μg/mL時(shí)，均使萊茵衣藻的YII值在處理后就顯著低于未處理組，處理濃度越高，YII值下降越快，其中當(dāng)質(zhì)量濃度為140 μg/mL時(shí)，萊茵衣藻的YII值在7 d后下降為0.36，而未處理組的YII值為0.53。圖3(b)顯示： 5 μg/mL的Cmp處理沒(méi)有顯著影響萊茵衣藻的YII值，當(dāng)質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，萊茵衣藻在生長(zhǎng)7 d內(nèi)的YII值略高于未處理組；質(zhì)量濃度為15 μg/mL及20 μg/mL的處理均使萊茵衣藻的YII值在處理后顯著低于未處理組，處理濃度越高，YII值下降得越快，其中當(dāng)質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，萊茵衣藻的YII值在7 d后下降為0.30，而未處理組的YII值為0.53。圖3(c)及圖3(d)顯示：各濃度的處理均使萊茵衣藻的YII值在處理后就顯著低于未處理組，并且處理濃度越高，YII值下降得越快，其中質(zhì)量濃度40 μg/mL的Kan及20 μg/mL的Tet在處理后的第1天就使萊茵衣藻的YII值從未處理時(shí)的0.47下降到0.001。

圖3 不同濃度的Amp(a)、Cmp(b)、Kan(c)及Tet(d)處理對(duì)萊茵衣藻YII的影響Fig.3 Effects of Amp (a),Cmp (b),Kan (c) and Tet(d) at different concentration on YII of C. reinhardtii

圖4 不同濃度的Amp(a)、Cmp(b)、Kan(c)及Tet(d)處理對(duì)萊茵衣藻rETR的影響Fig.4 Effects of Amp (a),Cmp (b),Kan (c) and Tet(d) at different concentration on rETR of C. reinhardtii

2.3.2 不同抗生素對(duì)萊茵衣藻rETR值的影響

圖4顯示了在4種抗生素各濃度的處理下，萊茵衣藻的rETR值在7 d內(nèi)的變化情況。圖4(a)顯示了質(zhì)量濃度為50及100 μg/mL的Amp處理使萊茵衣藻的rETR值均高于未處理組，且50 μg/mL處理的rETR值高于100 μg/mL處理的rETR；當(dāng)Amp質(zhì)量濃度為120及140 μg/mL時(shí)，從處理后第2天開(kāi)始，rERT值顯著低于未處理組。圖4(b)顯示：Cmp處理時(shí)，除20 μg/mL質(zhì)量濃度外，其他3個(gè)處理濃度的rETR值均高于未處理組，且5 μg/mL處理的rETR值大于10 μg/mL處理的rETR值，10 μg/mL處理的rETR值大于15 μg/mL處理的rETR值。圖4(c)顯示：Kan各濃度處理的rETR值均小于未處理組，且處理的濃度越高，rETR值下降得越低。圖4(d)顯示：Tet的處理在質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)，第1天的值升高，隨后下降，到第3天時(shí)與未處理組相同，隨后下降顯著低于未處理組，其他3個(gè)處理濃度均低于未處理組。

葉綠素?zé)晒獾淖兓軌蛘鎸?shí)地反映光能吸收、激發(fā)光能傳遞和光化學(xué)反應(yīng)等光合作用的原初反應(yīng)過(guò)程。YII及rETR分別指光系統(tǒng)II的實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率或?qū)嶋H光量子產(chǎn)額及經(jīng)過(guò)光系統(tǒng)II的相對(duì)線性電子流[15]。在本研究中，萊茵衣藻的YII及rETR對(duì)抗生素的處理非常敏感。YII的值在低質(zhì)量濃度的Amp(50 μg/mL)及Cmp(10 μg/mL)處理的前期(3 d前)升高，可能與藻液中抑生菌的去除有關(guān)，但在3 d后，YII的值有所下降，說(shuō)明低濃度的Amp及Cmp的處理會(huì)對(duì)YII有輕微的抑制作用；對(duì)于Kan及Tet的處理，在加入抗生素后YII就急劇下降，說(shuō)明Kan及Tet的處理會(huì)嚴(yán)重抑制萊茵衣藻的光反應(yīng)，也有報(bào)道證明，鏈霉素會(huì)選擇性地給合小球藻的核糖體70S亞基，從而抑制小球藻的PSII的D1、CP43及CP47等蛋白的合成，來(lái)降低小球藻的光合效率[13]；rETR值在低質(zhì)量濃度的Amp(50及100 μg/mL)及Cmp(5、10及15 μg/mL)處理的rETR值都高于未處理組，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，rETR值逐漸降低；Kan及Tet的處理都會(huì)使rETR的值急劇下降；rETR值隨著抗生素的加入下降，rETR值的大小反映了PSII反應(yīng)中心在光下的開(kāi)放程度，它的降低暗示了光反應(yīng)中心的關(guān)閉，可能是由于抗生素的存在阻礙了光合電子傳遞過(guò)程中的由電子傳遞體QA到QB的電子傳遞過(guò)程，也可能是抗生素作用于電子傳遞鏈上的蛋白酶，抑制酶的活性，進(jìn)而影響電子傳遞，從而影響光合作用效率[13]。本研究結(jié)果可以看出，4種抗生素的處理對(duì)YII與rETR值的影響具有很強(qiáng)的相關(guān)性，但影響的程度有些不同，光合效率降低的部分原因是由于電子傳遞效率的下降，除此之外可能還包括熱能散失及非光化學(xué)淬滅等因素。關(guān)于抗生素對(duì)光化學(xué)活性的影響機(jī)制，目前仍然沒(méi)有確切的解釋，其機(jī)制有待進(jìn)一步揭示。

2.4 抗生素對(duì)萊茵衣藻伴生細(xì)菌的抑制作用

將抗生素處理7 d后和對(duì)照組的藻液用無(wú)菌TAP培養(yǎng)液稀釋100倍，分別涂布在LB培養(yǎng)基上，菌落生長(zhǎng)情況如圖5所示，結(jié)合圖5細(xì)菌數(shù)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，表明在筆者所選取的濃度內(nèi)，隨著4種抗生素濃度的增加，細(xì)菌的數(shù)量隨之減少，濃度越高效果越明顯。當(dāng)藻液中Cmp的終質(zhì)量濃度達(dá)到20 μg/mL時(shí)，可以完全抑制藻液中細(xì)菌的生長(zhǎng)。在20 μg/mL質(zhì)量濃度下，雖然Tet對(duì)藻液中細(xì)菌的抑制作用也很明顯，但由于Tet質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)，就已經(jīng)表現(xiàn)出對(duì)萊茵衣藻的生長(zhǎng)具有顯著抑制作用(P<0.05)；藻液中Kan的終質(zhì)量濃度達(dá)到60 μg/mL時(shí)，即使可以完全抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，但其質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，對(duì)萊茵衣藻的抑制作用已達(dá)到顯著(P<0.05)；另外，當(dāng)藻液中Amp的終質(zhì)量濃度140 μg/mL時(shí)，并沒(méi)有完全抑制藻液中細(xì)菌的生長(zhǎng)，仍可以觀察到有少數(shù)細(xì)菌菌落長(zhǎng)出。因此，Amp、Tet及Kan不適合應(yīng)用于萊茵衣藻的無(wú)菌化中。

圖5 4種抗生素各處理濃度的藻液中的細(xì)菌檢驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Bacteria inspection in C.reinhardtii culture broth treated by 4 kinds of antibiotics

3 結(jié)論

4種抗生素Amp、Cmp、Kan及Tet的不同濃度對(duì)萊茵衣藻的細(xì)胞密度、葉綠素a含量及光化學(xué)活性都產(chǎn)生顯著的影響。Amp(低于100 μg/mL)及Cmp(低于20 μg/mL)，對(duì)萊茵衣藻的生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用，而Kan及Tet的各處理濃度都會(huì)顯著抑制萊茵衣藻的生長(zhǎng)；萊茵衣藻的光化學(xué)活性對(duì)4種抗生素的處理比較敏感，雖然在處理的3 d內(nèi)，Amp(低于50 μg/mL)及Cmp(低于10 μg/mL)由于“毒物效應(yīng)”會(huì)增加萊茵衣藻的YII及rETR值，但處理后期是呈現(xiàn)下降趨勢(shì)的，因此4種抗生素的長(zhǎng)期存在都會(huì)使萊茵衣藻的PSII反應(yīng)中心受損，光合電子傳遞過(guò)程受阻及光合效率降低。此外，低濃度的Cmp可用于萊茵衣藻細(xì)胞無(wú)菌化培養(yǎng)中，而Amp、Kan及Tet則不適合用于萊茵衣藻的無(wú)菌化培養(yǎng)。本研究結(jié)果表明，水生環(huán)境中抗生素的存在，會(huì)顯著影響萊茵衣藻的生長(zhǎng)及光化學(xué)活性，尤其是不斷累積的抗生素也會(huì)對(duì)萊茵衣藻等微藻的生態(tài)平衡產(chǎn)生影響。

[1] HARRIS E H.Chlamydomonas as a model organism.Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,2001,52(4):363-406.

[2] KELLER L C,ROMIJN E P,ZAMORA I,et al.Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.Curr Biol,2005,15(12):1090-1098.

[3] JOHANNINGMEIER U,FISCHER D.Perspective for the use of genetic transformants in order to enhance the synthesis of the desired metabolites:engineering chloroplasts of microalgae for the production of bioactive compounds.Adv Exp Med Biol,2010,698(1):144-151.

[4] JOO H N,LEE C G.Antibiotics addition as an alternative sterilization method for axenic cultures inHaematococcuspluvialis.J Ind Eng Chem,2007,13(1):110-115.

[5] 林偉,陳騳,劉秀云.海洋微藻除菌及除菌與自然帶菌微藻生長(zhǎng)特點(diǎn)比較.海洋與湖沼,2000,31(6):647-652.

[6] DIVAN C L，SCHNOES H K.Production of axenicGonyaulaxcultures by treatment with antibiotics.Appl Environ Microb,1982,44(1):250-254.

[7] 孫雯,黃和,林海龍,等.抗生素對(duì)雨生紅球藻無(wú)菌化培養(yǎng)的影響.生物加工過(guò)程,2015,13 (4):11-16.

[8] 麻曉霞,馬麗萍,石勛祥,等.微藻對(duì)常用抗生素敏感性的研究進(jìn)展.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2012,40(1):83-86.

[9] K?RNER S,NICKLISCH A.Allelopathic growth inhibition of selected phytoplankton species by submerged macrophytes.J Phycol,2002,38(5):862-871.

[10] SCHREIBER U,KLUGHAMMER C,KOLBOWSKI J.Assessment of wavelength-dependent parameters of photosynthetic electron transport with a new type of multi-color PAM chlorophyll fluorometer.Photosynth Res,2012,113(1/3):127-144.

[11] FAUST M，ALTENBURGER R，BACKHAUS T，et al.Predictive assessment of the aquatic toxicity of multiple chemical mixtures.J Environ Quality,2000,29(4):1063-1068.

[12] 劉瑩瑩,張文蕾,侯和勝,等.抗生素在微藻工程中的應(yīng)用研究進(jìn)展.生命科學(xué),2016,28(9):1010-1015.

[13] PERALES-VELA H V，GARCíA R V，GóMEZ-JUáREZ E A，et al.Streptomycin affects the growth and photochemical activity of the algaChlorellavulgaris.Ecotoxicol Environ Safety,2016,132:311-317.

[14] ALBERTE R S，F(xiàn)RIEDMAN A L，GUSTAFSON D L，et al.Light-harvesting systems of brown algae and diatoms.Isolation and characterization of chlorophyll ac and chlorophyll afucoxanthin pigment-protein complexes.Biochim Biophys Acta,1981,635(2):304-316.

[15] BAKER N R.Chlorophyll fluorescence:a probe of photosynthesis in vivo.Annu Rev Plant Biol,2008,59:89-113.

(責(zé)任編輯 管珺)

Effects of four antibiotics on growth and photochemicalactivities ofChlamydomonasreinhardtii

JIANG Si1,2，LIU Yingying1,2，TONG Shaoming1,2

(1. College of Life Sciences,Liaoning Normal University,Dalian 116081,China；2. Key Laboratory of Plant Biotechnology of Liaoning Province,Dalian 116081,China)

Four antibiotics (ampicillin (Amp),kanamycin (Kan),chloramphenicol (Cmp),tetracycline (Tet))at different concentrations were added to the culture broth in order to explore axenic cultivation ofChlamydomonasreinhardtii.The optimal antibiotics and concentration were determined by effects on the growth and photosynthetic activities ofC.reinhardtii.Cell density and chlorophyll a content increased proportionately by the treatment below 100 μg/mL Amp and 20 μg/mL Cmp,respectively.Inhibitory effects of the antibiotics appeared at all concentrations of Kan and Tet.YII and rETR increased at 50 μg/mL Amp and 10 μg/mL Cmp,respectively within 3 days and then decreased,whereas YII and rETR decreased sharply at all concentration of Kan and Tet.Furthermore,the combination results of bacterial inspectionshowed that Cmp had better antibacterial effect for axcnic culture ofC.reinhardtii.

Chlamydomonasreinhardtii; antibiotics; microalgae; photosynthetic activity

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.02.003

2016-11-02

遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610165072)

姜 思(1994—)，男，遼寧普蘭店人，研究方向：生物技術(shù)；共同第一作者，劉瑩瑩(1993—)，女，遼寧凌源人，研究方向：生物技術(shù)；佟少明(聯(lián)系人)，副教授，E-mail:tongsm@163.com

Q949.2

A

1672-3678(2017)02-0013-08