孫秀鵬

摘要 綜述了貝類三倍體育種的原理、方法、影響因素。在分析國內(nèi)外研究現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上，展望了貝類三倍體育種未來的發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞 貝類；三倍體；育種；原理；方法；影響因素；意義

中圖分類號 S968.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）04-0234-03

Abstract This article introduced principles，methods and influencing factors of shellfish triploid breeding.It analyzed the research status at home and abroad，and then put forward essential research considerations related to shellfish triploid breeding.

Key words shellfish；triploid；breeding；principle；method；influencing factor；singificance

貝類具有食物鏈短、定居性強(qiáng)、養(yǎng)殖和育苗技術(shù)完善、養(yǎng)殖成本低等優(yōu)點(diǎn)，是我國海水養(yǎng)殖的主要種類之一。貝類養(yǎng)殖已成為我國沿海經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要支柱之一[1]。近年來，貝類養(yǎng)殖研究的熱點(diǎn)是利用細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)對貝類的品種進(jìn)行改良，提升貝類養(yǎng)殖產(chǎn)品的品質(zhì)和產(chǎn)量。貝類三倍體育種技術(shù)通過改變貝類染色體組的方式來改變其遺傳基礎(chǔ)，使其個(gè)體大小、生長速度、抗病能力等形態(tài)特點(diǎn)優(yōu)于普通二倍體個(gè)體，遺傳特性優(yōu)良[2-3]。由此，在國內(nèi)廣泛開展對貝類的三倍體育種的研究。

1 貝類三倍體產(chǎn)生的機(jī)理

貝類在自然條件下多為二倍體，細(xì)胞內(nèi)含有2組染色體組。研究表明，絕大多數(shù)貝類在性成熟后排放出的精子已經(jīng)完成2次減數(shù)分裂，每個(gè)精子中只含有個(gè)體細(xì)胞中1/2的染色體數(shù)，而排出的成熟卵子一般停留在第一次減數(shù)分裂的前期或中期，只有在受精或者其他因素刺激后，卵子才會完成2次減數(shù)分裂釋放出第一極體和第二極體，隨后進(jìn)入卵裂。貝類卵子減數(shù)分裂的延遲現(xiàn)象為貝類三倍體育種提供了條件[4-7]。

獲得貝類三倍體的途徑主要有2種：一種方式是將二倍體貝類和四倍體貝類進(jìn)行雜交，從理論上可以100%得到三倍體個(gè)體[8-10]；另一種是抑制受精卵第一極體或第二極體的釋放，使極體內(nèi)所含的1組染色體保留在受精卵內(nèi)，受精卵的染色體增加1組形成三倍體[11-15]。

2 三倍體育種方法

2.1 物理方法

2.1.1 靜水壓。靜水壓法是使用水靜壓設(shè)備對處理對象施加壓力，抑制其紡錘體的微絲、微管的形成，抑制細(xì)胞分裂，抑制極體排出。200～500 kg/s是靜水壓處理常用的壓力范圍，處理時(shí)間約為10 min，根據(jù)物種不同而有所變化[12]。

2.1.2 溫度休克。溫度休克改變細(xì)胞內(nèi)酶的構(gòu)型，使細(xì)胞內(nèi)酶促反應(yīng)的進(jìn)行受到影響，導(dǎo)致細(xì)胞分裂過程中所需的ATP供應(yīng)途徑受阻，使完成減數(shù)分裂染色體加倍的細(xì)胞不能分裂。溫度休克分為熱休克和冷休克，所處理的溫度因物種不同而有所不同，一般在該物種生存溫度范圍的上下限[11，16-21]。

2.1.3 低滲。低滲法通過降低受精卵所處的海水鹽度進(jìn)行誘導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量代謝紊亂，微絲、微管形成受到影響[22-24]，細(xì)胞分裂受到抑制。此方法成本低、操作簡單、誘導(dǎo)率高，適宜在生產(chǎn)中使用[13]。

此外，還有通過對受精卵施加電脈沖誘導(dǎo)形成三倍體的方法。

2.2 化學(xué)法

化學(xué)法是在受精卵發(fā)育的適當(dāng)時(shí)期使用化學(xué)藥品進(jìn)行誘導(dǎo)，使其在第一極體或第二極體釋放時(shí)受到抑制，從而形成三倍體個(gè)體。6-二甲氨基嘌呤（6-dimethylamintpurin，簡稱6-DMAP）、細(xì)胞松弛素B（CytochalasinB，簡稱CB）、秋水仙素、咖啡因等為常用試劑。這些藥物作用的機(jī)理不同但都能誘導(dǎo)受精卵抑制正常的細(xì)胞分裂形成三倍體[25-28]。

2.2.1 6-二甲氨基嘌呤（6-dimethylamintpurin，簡稱6-DMAP）。6-DMAP是嘌呤毒素的一種類似物，通過作用于細(xì)胞內(nèi)特定激酶，破壞細(xì)胞微管的聚合中心，抑制極體的釋放[7，29-31]。6-DMAP易溶于水，低毒，無致癌性，價(jià)格低廉且誘導(dǎo)高效，最近在貝類多倍體誘導(dǎo)中代替細(xì)胞松弛素B被廣泛應(yīng)用[8]。6-DMAP的適宜濃度范圍為300～450 μmml/L，處理時(shí)間10～20 min[9]。

2.2.2 細(xì)胞松弛素B（CytochalasinB，簡稱CB）。細(xì)胞松弛素B是真菌的代謝產(chǎn)物之一，該藥物可特異性地作用于細(xì)微絲，導(dǎo)致細(xì)胞微絲和肌球蛋白構(gòu)成的“收縮環(huán)”解體，阻止細(xì)胞分裂從而抑制極體釋放，產(chǎn)生三倍體。細(xì)胞松弛素B有劇毒，使用其產(chǎn)生三倍體是通過破壞受精卵的細(xì)胞結(jié)構(gòu)而完成的，經(jīng)過細(xì)胞松弛素B處理的受精卵三倍體率很高，也會使處理過的受精卵孵化率降低[5-6]。細(xì)胞松弛素B的有效濃度為0.2～1.0 mg/L，一般溶解在二甲基亞砜中使用，處理時(shí)間10～15 min[6]。

2.2.3 秋水仙素。秋水仙素能夠抑制微管的合成，使已有的微管解聚，阻止紡錘體形成[22]，三倍體得以誘導(dǎo)形成。此藥物在植物中應(yīng)用廣泛，但在貝類及其他動物中應(yīng)用較少。

2.2.4 咖啡因?？Х纫蛲ㄟ^提高受精卵細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，使對Ca2+濃度極其敏感的微管受到破壞，紡錘絲的形成受到影響，從而抑制細(xì)胞分裂形成三倍體?？Х纫虻挠行舛?、處理時(shí)間分別為5～15 mmol/L、10～15 min?？Х纫蚝蜔嵝菘颂幚矸ńY(jié)合使用誘導(dǎo)效果更加顯著[10，22]。

2.2.5 其他藥劑。三氯甲烷、氯化鈣、聚乙烯乙二醇等藥物對抑制細(xì)胞分裂形成三倍體都有一定的作用，但誘導(dǎo)效果較差，很少采用。

2.3 生物學(xué)方法

理論上將二倍體貝類和四倍體貝類進(jìn)行雜交，可以100%得到三倍體個(gè)體。此方法操作簡便、三倍體率高、避免了理化處理對受精卵的損傷，是理想的產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖育種方式[14]。

此外，人工雌核發(fā)育和細(xì)胞融合法也可以用于誘導(dǎo)貝類三倍體。

3 影響貝類三倍體育種的因素

影響貝類三倍體育種的因素主要有受精卵處理?xiàng)l件的確定、受精卵發(fā)育的同步性和受精卵的密度。

3.1 受精卵的處理?xiàng)l件

多倍體育種過程中，有效的誘導(dǎo)途徑和處理時(shí)間是育種成功的關(guān)鍵。選擇適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)途徑，以能夠抑制極體釋放的最小劑量處理受精卵，可以有效地減小外界處理對受精卵造成的影響。在此基礎(chǔ)上對受精卵的發(fā)育過程進(jìn)行詳細(xì)研究以確定其極體釋放的時(shí)間點(diǎn)，確定誘導(dǎo)條件的處理時(shí)間。綜合一定范圍內(nèi)誘導(dǎo)途徑與處理時(shí)間結(jié)果的的差異，決定對同一物種誘導(dǎo)率、幼蟲成活率最高的一組條件[15]。

3.2 受精卵發(fā)育的同步性

多倍體人工育種是對處于某一特定發(fā)育階段的受精卵進(jìn)行處理，因而被處理的受精卵之間保持同步性是高效誘導(dǎo)三倍體的關(guān)鍵。受精卵發(fā)育的同步性主要與卵子的質(zhì)量、受精卵發(fā)育的溫度有關(guān)。闕華勇等[17]發(fā)現(xiàn)近江牡蠣在25～28 ℃時(shí)受精卵發(fā)育同步性較高。Uttin等[16]發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔卵的質(zhì)量與卵子的脂類儲量相關(guān)，提高卵子的脂類儲量有助于增強(qiáng)卵子對CB處理造成傷害的承受能力。

3.3 受精卵密度

在誘導(dǎo)過程中，提高受精卵的密度可以減少誘導(dǎo)用的藥物劑量，但卵細(xì)胞密度過高會使卵子沉積于容器底部，影響藥物與卵細(xì)胞的相互作用，降低誘導(dǎo)率[18]。

4 貝類三倍體育種的意義

三倍體細(xì)胞是非偶數(shù)染色體組，無法正常產(chǎn)生生殖細(xì)胞，從而導(dǎo)致個(gè)體性腺發(fā)育不良或無法發(fā)育。不育的三倍體不像正常個(gè)體在性成熟階段發(fā)育性腺消耗能量，使個(gè)體將更多的能量用于生長。三倍體不育的特點(diǎn)可以使其在生產(chǎn)過程中達(dá)到如下目的：①控制貝類養(yǎng)殖過程中的過速繁殖，防止干擾天然資源。②獲得生長速度快的三倍體個(gè)體，有助于提高經(jīng)濟(jì)效益[22]。③通過對二倍體種間雜交不成功的2個(gè)良種貝類進(jìn)行三倍體誘導(dǎo)雜交，整合其優(yōu)良性狀，如溫度耐受性、抗病性、生長快速性等。

5 貝類三倍體育種研究進(jìn)展

關(guān)于貝類三倍體研究自1981年Stanley等[19]報(bào)道了人工誘導(dǎo)美洲牡蠣三倍體成功以來，取得了快速發(fā)展，目前已在30余種貝類中開展了多倍體育種的研究。尤其在近幾年，隨著對多倍體育種操作的研究深入，一些三倍體貝類在人工養(yǎng)殖過程中表現(xiàn)出多種優(yōu)良性狀。部分三倍體育種技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)，如三倍體牡蠣于美國的產(chǎn)業(yè)化。我國貝類三倍體育種項(xiàng)目雖然開展較晚，但在國家863項(xiàng)目支持下，在櫛孔貝類、皺紋盤鮑等貝類上開展了研究工作，目前一些種類已經(jīng)初具產(chǎn)業(yè)化規(guī)模。

6 貝類三倍體育種研究展望

貝類養(yǎng)殖是我國海水養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一，但由于長期以來，養(yǎng)殖貝類由于近親繁殖、養(yǎng)殖環(huán)境污染以及疾病等原因造成了產(chǎn)量的下降，嚴(yán)重影響其快速健康發(fā)展。因而希望通過三倍體育種技術(shù)培育出生長迅速、抗逆性強(qiáng)的品種，改善貝類養(yǎng)殖業(yè)所面臨的問題。

我國在貝類三倍體育種方面已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究并取得了長足進(jìn)步，但還存在著一些問題。誘導(dǎo)方法上，化學(xué)方法誘導(dǎo)效果好，但成本高、具有毒性，對貝類及養(yǎng)殖周邊環(huán)境都有影響；物理方法操作簡單、成本低廉，但誘導(dǎo)效果不好；生物方法所應(yīng)用的貝類四倍體培育和細(xì)胞融合技術(shù)仍是一個(gè)難題。因此，尋找一種高效、無毒、安全且低成本的貝類三倍體育種方法是今后貝類育種的主要研究方向。

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