劉 金 鳳， 蔡 嘉 銘， 張 坤， 肖 珊， 王 晗， 王 際 輝

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 生物學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

餌料中添加富硒酵母對(duì)刺參性能的影響

劉 金 鳳1， 蔡 嘉 銘2， 張 坤1， 肖 珊2， 王 晗2， 王 際 輝2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 生物學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

以幼刺參為研究對(duì)象，在刺參基礎(chǔ)餌料中添加富硒酵母以研究其對(duì)刺參生長(zhǎng)、消化、免疫及抗病力的影響。結(jié)果表明，餌料中添加富硒酵母能顯著提高刺參的生長(zhǎng)性能，其中，添加量為107和108CFU/g 的處理組效果最佳。腸道消化酶活性研究發(fā)現(xiàn)，富硒酵母添加組淀粉酶活性顯著提高，但對(duì)脂肪酶沒(méi)有顯著地影響。富硒酵母添加量為107CFU/g，蛋白酶、纖維素酶的活性顯著提高；添加量為108CFU/g，蛋白酶、褐藻酸酶的活性顯著提高。與對(duì)照組相比，添加107和108CFU/g富硒酵母組刺參的超氧化物歧化酶、酚氧化酶活性、溶菌酶的活性均顯著提高；餌料中添加108CFU/g富硒酵母對(duì)刺參的總一氧化氮合酶和堿性磷酸酶活性也有顯著影響。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加富硒酵母能顯著減少刺參的累積死亡率。綜上，餌料中添加富硒酵母可以提高刺參的特定生長(zhǎng)率、消化酶活性、免疫力與抗病力，其中，107和108CFU/g效果較好。

刺參；富硒酵母；生長(zhǎng)性能；消化酶；免疫；抗病力

0 引 言

硒是水產(chǎn)動(dòng)物必需的微量元素之一，可以協(xié)調(diào)水產(chǎn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)生理功能，提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能，促進(jìn)代謝，增強(qiáng)免疫力[1]。水產(chǎn)動(dòng)物飼料的硒添加劑分為無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒兩種，與無(wú)機(jī)硒相比，有機(jī)硒吸收率高、毒性低、污染少。富硒酵母作為一種有機(jī)硒添加劑，具有安全無(wú)毒的特點(diǎn)，作為機(jī)體補(bǔ)硒來(lái)源被廣泛應(yīng)用于食品與飼料中[2-3]。富硒酵母中的硒蛋白具有良好的抗氧化效果，作為天然抗氧化劑有很好的開(kāi)發(fā)前景[4]。常仁亮等[5]用富硒酵母替代部分魚粉養(yǎng)殖中國(guó)對(duì)蝦，發(fā)現(xiàn)富硒酵母有助于中國(guó)對(duì)蝦的增重；王亭亭等[6]在飼料中添加富硒酵母與花粉投喂中華鱉能促進(jìn)生長(zhǎng)，增強(qiáng)鱉的非特異性免疫功能；謝敏等[7]在餌料中添加富硒酵母能顯著促進(jìn)鱤幼魚的生長(zhǎng)，降低餌料系數(shù)。在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖方面，富硒酵母作為餌料添加劑在魚類和蝦類等養(yǎng)殖中的應(yīng)用較多，而在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究尚少。

本實(shí)驗(yàn)以幼刺參為研究對(duì)象，通過(guò)在餌料中添加不同濃度的富硒酵母，探討其對(duì)刺參的生長(zhǎng)性能、消化酶活性、免疫力以及抗病力的影響，以期為刺參的健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)用幼刺參由大連寶發(fā)海珍品有限公司提供，規(guī)格一致，體質(zhì)量為(0.46±0.035) g?；A(chǔ)餌料主要成分為大葉菜81.9%，海虹干8.2%，蠣殼粉8.2%，酵母粉1.7%，餌料與海泥質(zhì)量比1∶1.5。

酵母為篩自海泥的海洋紅酵母，由實(shí)驗(yàn)室保種，將酵母接種于富有亞硒酸鈉的YPD發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定前期，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/mL。

1.2 方 法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與日常管理

實(shí)驗(yàn)在大連寶發(fā)海珍品有限公司的育苗室進(jìn)行，在基礎(chǔ)餌料中添加的富硒酵母，設(shè)3個(gè)處理組，分別為高、中、低劑量組，濃度分別為106、107和108CFU/g，同時(shí)設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組。將幼參馴養(yǎng)2星期后正式開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。每組設(shè)3個(gè)平行，養(yǎng)殖60 d。每個(gè)養(yǎng)殖池裝入50 m3的砂濾海水，并隨機(jī)投放15 kg的健康稚參，每日投餌2次。實(shí)驗(yàn)期間，每15 d倒池一次，鹽度2.8%～3.0%，溫度14～16 ℃，室內(nèi)溫度15～22 ℃，增氧泵間隔充氧，充氧20 min，停氧15 min。

1.2.2 樣品采集

取樣前24 h停止投喂餌料，并清理殘餌，使腸道內(nèi)容物排空。在60 d養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)養(yǎng)殖池隨機(jī)選取15頭刺參進(jìn)行解剖。收集的體腔液與等量抗凝劑充分混合后得抗凝體腔液，置于液氮中冷凍保存。取出的腸道用4 ℃的去離子水沖洗，用吸水紙吸干。

1.2.3 消化酶活性測(cè)定

將儲(chǔ)存于液氮中的腸道取出，稱取1.00 g的刺參腸道于離心管中，加入10倍的4 ℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)，在冰浴條件下勻漿10 min后，置于高速冷凍離心機(jī)中，在4 ℃、10 000g離心20 min，移取上清液至干凈離心管中，4 ℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

采用福林-酚試劑法測(cè)定蛋白酶活性[8]；采用碘-淀粉顯色法測(cè)定淀粉酶活性[9]；采用橄欖油乳化液法測(cè)定脂肪酶活性[10]；采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定纖維素酶與褐藻酸酶活性[11]。

1.2.4 免疫酶活性測(cè)定

超氧化物歧化酶(SOD)、總一氧化氮合酶(T-NOS)、酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)活性的測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所的檢測(cè)試劑盒。

溶菌酶(LSZ)活性采用溶菌酶裂解溶壁微球菌原理，利用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定[12]。酚氧化酶(PO)活性測(cè)定采用Smith等[13]的方法，略加修改，用酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.2.5 攻毒實(shí)驗(yàn)

60 d 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)取20 頭刺參，采用燦爛弧菌對(duì)刺參進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。燦爛弧菌的注射劑量為0.1 mL/頭，繼續(xù)投喂基礎(chǔ)飼料，連續(xù)觀察7 d，統(tǒng)計(jì)累積死亡率。

累積死亡率=Dt/D0×100%

式中：D0和Dt分別為攻毒過(guò)程中海參初始頭數(shù)和累積死亡頭數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0進(jìn)行AVONA單因素方差分析，不同處理組之間采用Ducan’ s多重比較，以P<0.05表示有顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 生長(zhǎng)性能

由表1可知，隨著餌料中富硒酵母濃度的增加，刺參的終末體重與特定生長(zhǎng)率均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著性差異。其中，餌料中添加富硒酵母濃度為107和108CFU/g時(shí)效果最佳。

研究表明，餌料中添加富硒酵母能顯著地提高刺參的特定生長(zhǎng)率，這可能是由于海洋紅酵母本身含有蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)元素，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)功能，除此之外，硒能提高抗氧化能力，增強(qiáng)免疫功能，降低死亡率，從而滿足刺參的生長(zhǎng)需求。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與華雪銘等[14]的研究相一致，在飼料中添加0.3%、0.6%、1.2%的富硒酵母都能使異育銀鯽生長(zhǎng)加快；魏文志等[15]在異育銀鯽餌料中添加0.2 mg/kg 的富硒酵母也顯著地提高了增重率。

表1 餌料中添加富硒酵母對(duì)刺參生長(zhǎng)性能的影響

2.2 消化酶活性

從表2可以看出，與對(duì)照組相比，餌料中添加富硒酵母顯著提高了淀粉酶活性；餌料中添加富硒酵母對(duì)脂肪酶的活性無(wú)顯著影響。與對(duì)照組相比，餌料中添加富硒酵母濃度為107和108CFU/g時(shí)都顯著提高了蛋白酶的活性；中劑量組和高劑量組都顯著提高了纖維素酶和褐藻酸酶的活性，且二者之間無(wú)顯著性差異。

表2 餌料中添加富硒酵母對(duì)刺參消化酶活性的影響

許友卿等[16]研究表明，投喂添加酵母硒的飼料可顯著增加鳡魚腸淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性，提高飼料轉(zhuǎn)化率。而關(guān)于富硒酵母對(duì)刺參消化酶活性的影響方面的研究較少，本實(shí)驗(yàn)在餌料中添加107和108CFU/g富硒酵母顯著地提高了刺參的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和褐藻酸酶的活性，表明在餌料中添加富硒酵母有利于刺參對(duì)蛋白、淀粉、纖維素和褐藻酸的消化吸收。而脂肪酶活性變化不顯著，可能是由于刺參對(duì)脂肪的營(yíng)養(yǎng)需求較少，導(dǎo)致脂肪酶活性變化不大。

2.3 免疫酶活性

餌料中添加不同濃度的富硒酵母對(duì)刺參免疫酶活性的影響如圖1所示。圖1(a)表明，與對(duì)照組相比，中劑量組和高劑量組顯著提高了SOD活性，且二者之間無(wú)顯著性差異；圖1(b)表明，高劑量組顯著高于對(duì)照組，而低劑量組和中劑量組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異；圖1(c)表明，餌料中添加富硒酵母對(duì)ACP活性沒(méi)有顯著影響。在圖1(d)中，與對(duì)照組相比，高劑量組顯著提高了AKP活性，而低劑量組和中劑量組與對(duì)照組無(wú)顯著差異。圖1(e)和圖的結(jié)果表明，富硒酵母添加組刺參的LSZ活性和PO活性顯著高于對(duì)照組，且二者之間無(wú)顯著性差異。

(a) SOD

(b) T-NOS

(c) ACP

(d) AKP

(e) LSZ

(f) PO

對(duì)照，不添加富硒酵母組；1，106CFU/g處理組；2，107CFU/g處理組；3，108CFU/g處理組；數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，同一行數(shù)據(jù)標(biāo)有不同字母代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同字母代表差異不顯著(P>0.05)

圖1 餌料中添加富硒酵母對(duì)刺參免疫酶活性的影響

Fig.1 Effects of dietary addition of Se-enriched yeast on immune enzyme activity ofApostichopusjaponicus

超氧化物歧化酶(SOD)廣泛分布于生物界，它能催化生物體內(nèi)自由基的歧化反應(yīng)，從而消除自由基對(duì)生物的毒性[17]。王宏偉等[8]，研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加微量元素硒對(duì)中華米蝦體內(nèi)SOD的激活作用顯著，能增強(qiáng)蝦體的抗病力和免疫功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加適量的富硒酵母能夠提高刺參的SOD活性，增強(qiáng)抗氧化能力。

一氧化氮合酶(T-NOS)在無(wú)脊椎動(dòng)物的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[19]。本研究中，餌料中添加108CFU/g富硒酵母顯著提高了T-NOS的活性，表明餌料中添加一定量的富硒酵母能增加T-NOS 的活性，進(jìn)而提高刺參的免疫力。

免疫酶中的酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)是參與免疫活動(dòng)的重要水解酶[20]。本實(shí)驗(yàn)中，餌料中添加富硒酵母對(duì)ACP的活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異，說(shuō)明攝食106～108CFU/g的富硒酵母不能通過(guò)影響ACP的活性來(lái)提高刺參的免疫力。與對(duì)照組相比，高劑量組顯著提高了刺參的AKP活性，表明攝食108CFU/g富硒酵母能提高AKP活性，從而提高刺參的免疫力。

溶菌酶(LSZ)在抵御外來(lái)致病微生物中起重要作用[21]。餌料中添加107和108CFU/g的富硒酵母能顯著提高LSZ的活性，表明攝食高濃度的富硒酵母可增強(qiáng)LSZ的活性，通過(guò)防御病害而增強(qiáng)免疫力。

酚氧化酶(PO)是海洋無(wú)脊椎動(dòng)物抵御外來(lái)病原感染的酚氧化酶原激活系統(tǒng)中的主要組成部分，在非特異性免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵性作用[22]。與對(duì)照組相比，餌料中添加107和108CFU/g的富硒酵母顯著提高了PO的活性。中劑量組的PO活性最高，說(shuō)明富硒酵母的添加濃度并不是越高越好，富硒酵母添加過(guò)量，PO活性可能會(huì)下降。

2.4 攻毒實(shí)驗(yàn)

對(duì)照組、106、107和108CFU/g處理組的累積死亡率分別為53.33%、6.67%、5.00%和3.33%。與對(duì)照組相比，各添加組累積死亡率均顯著降低。其中，餌料中添加富硒酵母濃度為107和108CFU/g的實(shí)驗(yàn)組，刺參的抗病力最強(qiáng)。

燦爛弧菌是導(dǎo)致刺參患腐皮綜合征的致病菌的一種，嚴(yán)重危害刺參的健康養(yǎng)殖。餌料中添加富硒酵母均降低了刺參的累積死亡率，提高刺參的抗病能力。說(shuō)明攝食富硒酵母影響了刺參免疫因子的活性，增強(qiáng)了其抗病的能力。

3 結(jié) 論

餌料中添加不同濃度的富硒酵母可以提高刺參的生長(zhǎng)性能，餌料中添加107和108CFU/g的富硒酵母可以在一定程度上提高刺參的消化酶和免疫酶的活性，增強(qiáng)抗病力。

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Effects of dietary addition of Se-enriched yeast on the performance ofApostichopusjaponicus

LIU Jinfeng1, CAI Jiaming2, ZHANG Kun1, XIAO Shan2, WANG Han2, WANG Jihui2

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

The effects of dietary addition of Se-enriched yeast on the growth, digestive enzyme activity immunity and disease resistance ofApostichopusjaponicuswere studied. The results showed that Se-enriched yeast could significantly improve the specific growth rates ofA.japonicus, among which of 107and 108CFU/g showed better effects. The amylase activities were significantly improved, whereas adding Se-enriched yeast had no significant effects on lipase activities. The protease activities and cellulase activities were increased significantly in the group of 107CFU/g, and the protease activities and alginase activities were increased significantly in the group of 108CFU/g. The superoxide dismutase, phenoloxidase and lysozyme activities ofA.japonicusincreased significantly in groups of 107and 108CFU/g, while the total nitric oxide synthase and alkaline phosphatase activities were increased significantly in the group of 108CFU/g. It was shown that adding Se-enriched could significantly decrease the cumulative mortality ofA.japonicus. The results indicated that dietary addition of Se-enriched yeast could improve the growth performance, digestive enzyme activity, immunity and disease resistance ofA.japonicus, of which better levels were 107and 108CFU/g.

Apostichopusjaponicus; Se-enriched yeast; growth performance; digestive enzyme; immunity; disease resistance

2015-05-10.

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2015GA651002)；國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201405003)；遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(2016J016)；大連市高層次人才創(chuàng)新支持計(jì)劃項(xiàng)目(2016RQ060).

劉金鳳(1990-)，女，碩士研究生；通信作者：王際輝(1970-)，男，教授.

TS254.9

A

1674-1404(2017)02-0084-05

劉金鳳,蔡嘉銘,張坤,肖珊,王晗,王際輝.餌料中添加富硒酵母對(duì)刺參性能的影響[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(2):84-88.

LIU Jinfeng, CAI Jiaming, ZHANG Kun, XIAO Shan, WANG Han, WANG Jihui. Effects of dietary addition of Se-enriched yeast on the performance of \%Apostichopus japonicus\%[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(2): 84-88.