陸騰飛, 鄔楊楠, 裴文華, 馬月輝, 關偉軍

中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 北京 100193

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內皮祖細胞的生物學特性及其應用

陸騰飛, 鄔楊楠, 裴文華, 馬月輝*, 關偉軍*

中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 北京 100193

內皮祖細胞是血管內皮細胞的前體細胞，隨著對其培養(yǎng)、鑒定、歸巢和分化等研究的進行，內皮祖細胞被越來越多的引入到醫(yī)學、細胞生物學等相關血管疾病的研究之中，內皮祖細胞可促進創(chuàng)傷愈合和血管功能恢復，是構建心血管組織工程的新力量。就內皮祖細胞的生物學特性及其在動物肢體缺血模型和臨床實驗中的應用進行了概述，并分析了內皮祖細胞應用所面臨的挑戰(zhàn)，最后對未來的研究方向進行了展望。

內皮祖細胞；體外擴增；生物學特性；血管發(fā)生；臨床應用

1997年，日本學者Asahara等[1]首次從人外周血中分離出血管內皮生長因子受體2(vasucular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2)和CD34均為陽性的單核細胞，而且能夠表達內皮細胞的特異性抗原，故命名為內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，也稱為成血管細胞(angioblast)，在生理或病理等因素的刺激下，可從骨髓動員到外周血參與損傷血管的修復，通過遷移、歸巢到靶組織并進入新生血管，定向增殖分化為成熟的血管內皮細胞，內皮細胞對維持血管內膜的穩(wěn)定性起著重要作用[2,3]；此外，研究發(fā)現(xiàn)EPCs既參與血管生成，也參與機體和器官損傷后的血管修復與新生，在心腦血管疾病、外周血管疾病、腫瘤血管形成及創(chuàng)傷愈合等方面均發(fā)揮重要作用，并為缺血性疾病的治療提供了新思路，具有廣闊的應用前景[4～6]。然而，EPCs治療仍面臨諸多困難，從高齡病人分離的EPCs數(shù)量低、質量差，達不到理想的治療效果[7]。本文就內皮祖細胞生物學特征及臨床應用等研究概況作簡要概述,以期為內皮祖細胞的應用研究提供參考。

1 EPCs的生物學特性

1.1 EPCs的鑒定

內皮祖細胞在體外有兩種，分早期和晚期。早期EPCs呈現(xiàn)紡錘形，晚期EPCs形成鋪路石樣的橢圓形結構。單從形態(tài)學特征上無法辨認出早期EPCs，由于血液與血管的發(fā)生聯(lián)系緊密，其細胞也共享許多細胞表面標記。研究發(fā)現(xiàn)，HSCs和EPCs都起源于血管干細胞，因此他們具有相同的表面標記(CD34、CD133)[8]。人類EPCs的表面標記物有CD34、CD133、FLK-1/KDR、CXCR4和CD105等，而在小鼠中其表面標志物則為C-kit+/Sca-1+/Lin-(KSL)[1, 9～11]，這些細胞群在缺血條件下參與血管形成，表明它們具有血管再生能力?，F(xiàn)在最常用的鑒定EPCs的表面分子抗原組合有VEGFR-2、CD133和CD34，多數(shù)學者認為同時具有 CD34+、CD133+及VEGFR-2等表面抗原的稱為EPCs[12]，但單獨一個表面分子抗原是不具有特異性的。例如，CD34+在骨髓來源的內皮細胞和造血干細胞(hematopoietic stem cells, HSCs)上都有所表達[13]。VEGFR-2是胚胎血管發(fā)育時的關鍵受體，是血液血管干細胞的表面標記，在出生后也表達于早期造血干細胞和成熟血管內皮細胞上[14]。CD133選擇性地表達于早期造血細胞和胚胎肝、骨髓以及外周血的祖細胞，在成熟內皮細胞不表達[15]。由此可見，EPCs在不同發(fā)育階段可能表達不同的表面標記。最近有研究顯示，起源于臍血單核細胞的CD34+/CD14-或CD34-/CD14+的細胞也可分化為EPCs[16]，此外，還能通過多種方法鑒定EPCs，內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)也是它的特征之一[17]。通過電鏡可觀察到內皮細胞特有的細胞器Weibel-palade小體[18]，它是一種分泌性桿狀的細胞器，含有多種生物活性分子，如血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)，受到刺激后可以非常迅速的釋放這些內容物，參與止血、炎癥和血管生成等生理功能。內皮細胞吞噬低密度脂蛋白是其重要的生物學功能之一，EPCs在分化過程中能表達內皮細胞免疫表型，且具有吞噬乙?；兔芏戎鞍缀徒Y合荊豆凝集素的能力[19]，可以利用這種能力對EPCs進行檢測，通過Dil標記乙?；兔芏戎鞍缀虵ITC標記的荊豆凝集素雙染實驗來鑒定EPCs表型。

非造血系EPCs的來源不是HSCs，它可能來自組織或器官，非造血系EPCs通過連續(xù)培養(yǎng)獲得，它們具有分化為內皮細胞的能力，這種細胞又被稱為EOCs[20]，它們在體外培養(yǎng)條件下呈內皮細胞樣特征，培養(yǎng)7 d后，匯合形成鵝卵石樣單層多角形細胞。這種EPCs亞型表達CD31、CD34、CD105、CD146、VE-cadherin和VEGFR-2，而不表達造血系表面標志物CD133[21]。這類EPCs能形成毛細血管和產(chǎn)生NO，從而增強后肢血管的新生能力[22]。盡管這類具有血管生成潛能的EPCs能應用于細胞治療，但在培養(yǎng)的過程中，它們的增殖活性減弱和逐步衰老的現(xiàn)象使之用于治療受到限制[23]，若同時考慮到分離技術和培養(yǎng)方法，這些非造血系EPCs是不適用于臨床的。

1.2 EPCs的歸巢和分化

EPCs的歸巢是在血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基質細胞衍生因子1(stromal cell derived factor，SDF-1)的參與下，使外周血中的EPCs遷移到組織缺血或內皮損傷部位，黏附并結合到受損血管的過程。有學者發(fā)現(xiàn)將含有VEGF的填充物移植到缺血部位，可引起移植部位EPCs的聚集，促進血管新生，表明VEGF有促進EPCs歸巢的作用[24]。另外，還有研究人員發(fā)現(xiàn)，小窩蛋白(caveolin)通過VEGF /NO通路來調控SDF-1介導的EPCs歸巢，從而直接影響血管的新生[25]。SDF-1是動員EPCs向缺血部位聚集的關鍵細胞因子之一，能誘導CD34+細胞遷移和EPCs的形成。

EPCs向缺血損傷部位歸巢，形成集群后修復損傷組織[26]。因此EPCs的克隆形成能力及其檢測方法對于研究血管的生成是很重要的。有研究人員從外周血或臍血中分離出單個核細胞，并培養(yǎng)出了內皮細胞克隆團(colony-forming unit-endothelial cells, CFU-ECs)[27]。新的EPCs克隆形成(EPCs colony forming assay, EPCs-CFA)方法可以估計祖細胞的數(shù)量，也能評估克隆團的質量[28]。利用EPCs-CFA方法可以把兩種細胞群體區(qū)分開來，即原始的(小)EPCs群體和成熟的(大)EPCs群體。這兩類細胞群體各有特點，原始的(小)EPCs具有高度的增殖能力，而成熟的(大)EPCs具有分化和促進血管修復的能力[29]。

有學者認為CD133/CD14表達的喪失，同時伴隨vWF及其他成熟內皮特異性標志物和特征的形成就表明內皮細胞分化成熟[30]。目前的研究認為EPCs除了分化為成熟內皮細胞以外，還可以分化為骨骼肌細胞、平滑肌細胞和心肌樣細胞[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，PPAR7受體激動劑通過上調eNOS的表達使EPCs向成熟內皮細胞分化，而抑制其向平滑肌細胞分化[32]。而用C-反應蛋白處理EPCs，可通過抑制eNOS mRNA的表達，顯著抑制EPCs 的分化，并加速其凋亡[33]。有研究發(fā)現(xiàn)，層流切應力促進EPCs向動脈ECs分化，而抑制其向靜脈ECs分化。剪切力在促進EPCs向ECs分化的同時，抑制了干細胞標志物CD133、CD34的表達[34]。也有研究表明纖維連接蛋白促進EPCs分化[35]。

2 EPCs的應用

2.1 EPCs在動物肢體缺血模型中的應用

目前，EPCs治療肢體缺血疾病被廣泛研究。當肢體缺血患者因為沒有藥物治療，不適合手術而只能選擇截肢時，EPCs治療給他們帶來了希望。利用EPCs治療動物損傷模型的治療方法有所差異，有的學者利用新分離的細胞，也有學者利用多種細胞因子/生長因子組合培養(yǎng)擴增的細胞。研究人員利用鼠類和兔進行了大量的研究，外源性EPCs能夠修復后肢缺血模型中受損的血管[36,37]。這些實驗表明，EPCs在缺血損傷時參與毛細血管生成和改善組織灌注。

由于造血干細胞和內皮祖細胞具有共同的表面標記，利用當前的技術無法將它們區(qū)分。最近，有研究表明通過CD34陽性分選可以得到一部分EPCs，對肢體缺血的糖尿病小鼠局部注射CD34+細胞，結果表明CD34+細胞具有促進創(chuàng)傷愈合和促進血管生長的功能[38]。Li等[39]發(fā)現(xiàn)分離自骨髓的CD34+在移植后具有更高的募集能力。Elsharawy等[40]將人CD34+細胞移植到后肢缺血的糖尿病裸鼠體內，發(fā)現(xiàn)明顯恢復了血流。

2.2 EPCs在臨床試驗上的應用

治療性血管生成的主要目的是強化合適的血管形成和改善組織灌注。一些理想的動物研究結果促進了早期臨床試驗的開展。促進肢體缺血患者的側支血管生成和血管新生是減少組織損傷與嚴重缺血的主要治療策略。

根據(jù)細胞來源，治療方式可分為非選擇性EPCs治療和選擇性EPCs治療，非選擇性EPCs治療利用骨髓來源的單個核細胞(mononuclear cells, MNCs)，它包括EPCs部分和非EPCs部分；選擇性EPCs治療利用的是外周血(peripheral blood,PB)或BM-MNCs中分離和純化的EPCs[40,41]。純化的CD34+細胞能參與血管新生和內皮修復，BM-MNCs在收到促進動員、歸巢和分化的信號后，能形成成熟的內皮細胞。生理條件下循環(huán)血中的EPCs數(shù)量很少，粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)可以促進EPCs從骨髓中動員到外周血中，因此，促進BM-MNCs動員和歸巢會增強EPCs介導的血管新生[42,43]。

有學者利用BM-MNCs治療外周動脈疾病(peripheral arterial disease, PAD)，他們使用的就是細胞移植治療血管生成方法。隨機對照試驗表明，肌肉注射自體BM-MNCs能顯著改善腿部疼痛范圍、潰瘍大小和疼痛自由行走距離，這種良性結果能夠維持至少2年[44]。Kawamoto等[45]報道了一個自體移植的I/II期臨床試驗，通過G-CSF動員下肢嚴重缺血患者的BM-EPCs，G-CSF能有效地動員BM-EPCs進入血液，分離所得到的CD34+細胞即為EPCs。所有患者在細胞治療12周后，病情得到明顯改善，CD34+細胞移植后各項病理指標得到明顯改善。

研究顯示，將自體動員的CD34+細胞移植到頑固性糖尿病足患者體內，I/II期臨床試驗結果顯示，5例患者中3例未發(fā)生小截肢、復發(fā)、死亡及其他嚴重不良事件。另外，當以高劑量EPC-CFU和CD34+/KDR+細胞進行治療時，傷口愈合效果明顯改善，無復發(fā)或異位潰瘍[44]。這些結果表明，EPCs的數(shù)量和血管生成潛力直接影響細胞療法的療效。因此，較高劑量的EPC-CFU和CD34+/KDR+細胞是EPCs進行有效治療的關鍵。細胞治療對于下肢嚴重缺血患者基本沒有限制，具有一定的安全性和可行性。

3 EPCs的應用挑戰(zhàn)

要成功地將EPCs介導的血管修復和血管生成應用于臨床，還需要更好地理解EPCs的生物學特性。目前，EPCs治療應用主要受到數(shù)量和質量的限制。由于外周血中的EPCs較少，細胞分離過程中細胞質量會降低，不得不進行多次動員和分離EPCs從而加重了病人的負擔。研究發(fā)現(xiàn)PB CD34+細胞移植治療功能性血管再生具有劑量依賴效應[46]。

在一些特殊情況下，如高齡、糖尿病、心血管疾病和其他風險因素等都能損害EPCs的功能，使其遷移和歸巢到靶組織的能力受到影響[47,48]。年齡的升高會減弱內皮祖細胞的功能，產(chǎn)生保護性細胞因子，并造成生長因子的量減少，且活性減弱，導致患心血管疾病的風險增加[49]。老齡化也與血管壁內源性的改變有關，主要是內皮細胞的流失導致了內皮功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性冠心病(coronary artery disease,CAD)患者術前的循環(huán)EPCs隨著年齡的增加而減少，隨著VEGF水平下降而減少。而同齡人中，含較少EPCs的人更易患心血管疾病。多因素分析表明，EPCs的減少預測了心血管疾病不良的預后[50]，通過減少風險因素能夠恢復循環(huán)中EPCs的正常水平[51]。

由于糖尿病和EPCs功能損傷有關，糖尿病通常伴隨著很多血管并發(fā)癥，缺乏血管內皮再生和血管再生受損是糖尿病血管并發(fā)癥的根本原因。糖尿病患者的內環(huán)境含有大量的活性氧簇，它們由活性NADPH氧化酶產(chǎn)生，NADPH氧化酶能降低NO的生物學利用度，從而導致糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生和加重，抑制NADPH氧化酶的活性能恢復CD34+細胞的遷移和歸巢到靶組織的能力[52]。

由于病人內源性EPCs的數(shù)量少、質量差，與健康人相比自體EPCs移植治療效果不好。在治療糖尿病足患者時，PB CD34+細胞修復組比對照組的治療效果差，老年患者EPCs動員數(shù)量降低，缺血性損傷可由正常人的CD34+細胞修復，但糖尿病患者的CD34+細胞治療效果很差[50]。為了克服這一問題，可使用細胞和分子生物學技術增強EPCs的存活率和細胞增殖。此外，收集和分離細胞的漫長過程也會影響患者的康復。如前體祖細胞的增殖或前處理等步驟會造成移植時間的推遲?？傊?，盡管臨床試驗表明自體EPCs治療具有安全性和有效性，但仍然需要克服一些缺陷，如：分離技術和過程、細胞功能障礙和細胞數(shù)量。

4 展望

內皮祖細胞以其獨特的生物學特性成為再生醫(yī)學領域中重要的治療工具，在機體缺血、組織損傷、細胞因子或藥物刺激下，EPCs可從骨髓向靶部位動員、增殖、分化，形成新生血管，在多種缺血性疾病和血管損傷方面有著廣闊的應用前景。利用轉基因技術將必要的基因轉給EPCs，從而增強其增殖或新生血管的能力，擴大在臨床上的應用范圍。此外，EPCs在組織工程和腫瘤治療方面也有很大的臨床應用價值。但是，我們必須要先理解EPCs的生物學特性，并繼續(xù)研究了解EPCs在健康和疾病中的身份和角色。這些努力將提供有價值的數(shù)據(jù)來指導研究者對細胞治療進行合理的設計。

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Biological Characteristics and Applications of Endothelial Progenitor Cells

LU Tengfei, WU Yangnan, PEI Wenhua, MA Yuehui*, GUAN Weijun*

InstituteofAnimalSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China

Endothelial progenitor cells (EPCs) are the precursor cells of the vascular endothelial cells. EPCs is now being more and more introduced into the basic research in medicine, cell biology and other fields about vascular disease with the study of its culture, identification, homing and differentiation. Studies have shown that endothelial progenitor cells can promote wound healing and the recovery of vascular function, becoming a new method to construct cardiovascular tissue engineering. This paper reviewed the biological characteristics of EPCs and its application in animal ischemia models and clinical trial. The paper also analyzed the challenge of EPCs application. Finally, we prospected the research direction of EPCs in the future.

endothelial progenitor cell; exvivo expansion; biological properties; vasculogenesis; clinical application

2017-02-22; 接受日期：2017-05-18

國家自然科學基金項目(31672404)；中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目(cxgc-ias-01)資助。

陸騰飛，碩士研究生，研究方向為動物遺傳育種與繁殖。E-mail:tengkongfeilu@163.com。*通信作者：關偉軍，教授，博士，研究方向為細胞與分子生物學。E-mail:wjguan86@iascaas.net.cn；馬月輝，研究員，博士，研究方向為細胞與分子生物學。E-mail:yuehui.Ma@263.net

10.19586/j.2095-2341.2017.0009