郝禮森， 宋小杰， 章廣玲， 王 靜， 劉 博， 張朋壘， 張明婷， 靳麗敏

(華北理工大學 1附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 2基礎醫(yī)學院，河北 唐山 063000)

腺病毒介導的shRNA下調(diào)PTEN表達對活化肝星狀細胞骨架蛋白F-actin的影響*

郝禮森1△， 宋小杰1， 章廣玲2， 王 靜1， 劉 博1， 張朋壘1， 張明婷1， 靳麗敏1

(華北理工大學1附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，2基礎醫(yī)學院，河北 唐山 063000)

目的： 探討腺病毒介導的shRNA下調(diào)第 10 號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)基因表達對體外培養(yǎng)的活化肝星狀細胞(HSC)纖絲狀肌動蛋白(F-actin)的影響。方法: 體外培養(yǎng)大鼠活化HSC(HSC-T6)，將攜帶靶向PTEN的RNA干擾序列[短發(fā)夾RNA(shRNA)]并表達綠色熒光蛋白(GFP)的重組腺病毒Ad-shRNA/PTEN及僅表達GFP的對照空病毒Ad-GFP轉(zhuǎn)染HSC，實時熒光定量PCR及Western blotting實驗檢測HSC的PTEN mRNA及蛋白表達；利用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測HSC的形態(tài)、F-actin的分布及熒光強度、偽足以及應力纖維的變化，并采用鈣熒光探針Rhod-2/AM負載檢測HSC內(nèi)Ca2+濃度的變化。實驗分為對照(control)組(在腺病毒轉(zhuǎn)染步驟以DMEM代替腺病毒液)、Ad-GFP組(轉(zhuǎn)染表達GFP的空病毒Ad-GFP)和Ad-shRNA/PTEN組(轉(zhuǎn)染重組腺病毒Ad-shRNA/PTEN)。結(jié)果: 靶向PTEN的shRNA成功轉(zhuǎn)染體外活化HSC，顯著下調(diào)HSC的PTEN mRNA及蛋白表達(P<0.05)；PTEN表達下調(diào)使活化HSC呈星形向四周伸展，F(xiàn)-actin排列緊密規(guī)則，數(shù)量增多，偽足充分向外伸展，應力纖維絲增長增粗；Ad-shRNA/PTEN組F-actin的熒光強度較control組及Ad-GFP組顯著增強(P<0.05)，而control組與Ad-GFP組間差異無統(tǒng)計學顯著性；Ad-shRNA/PTEN組HSC內(nèi)Ca2+濃度較control組及Ad-GFP組明顯升高(P<0.05)，而control組與Ad-GFP組間差異無統(tǒng)計學顯著性。結(jié)論: PTEN表達下調(diào)使體外活化肝星狀細胞骨架蛋白F-actin的形成及細胞骨架的重構(gòu)增強，并增加了HSC內(nèi)的Ca2濃度。

PTEN； RNA干擾； 肝星狀細胞； 細胞骨架； 纖絲狀肌動蛋白

肝纖維化是肝臟對各種損傷產(chǎn)生修復反應的病理過程，其特征是以膠原為主的細胞外間質(zhì)在肝臟中的過度沉積，而肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)是參與此過程的主要細胞。HSC活化時伸展為星芒狀的肌成纖維樣細胞，并在損傷部位黏附、遷移，進而表達各種細胞信號分子，產(chǎn)生大量細胞外間質(zhì)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)細胞遷移與細胞骨架重構(gòu)有關(guān)[3-4]。而肌動蛋白(actin)則是構(gòu)成細胞骨架的重要骨架蛋白，其功能除了參與維持細胞的正常形態(tài)外，還參與調(diào)控細胞的應力纖維形成、黏附、遷移、凋亡、物質(zhì)運輸、跨膜信息傳遞以及受體聚集等[5]。Actin以可溶性的單體球形肌動蛋白(globular actin, G-actin)和聚合體纖絲狀肌動蛋白(filamentous actin, F-actin)2種形式存在，且只有F-actin具有生物學活性作用[6]。而第 10 號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homology detected on chromosome 10,PTEN)基因是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個具有脂質(zhì)磷酸酶活性及蛋白磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，其低表達或缺失可影響腫瘤細胞的細胞骨架重構(gòu)[7-8]。近年來對PTEN的研究已從腫瘤領域逐漸延伸到非腫瘤領域，有研究發(fā)現(xiàn)大鼠纖維化肝組織及在體肝星狀細胞中的PTEN表達均下調(diào)[9-10]。但PTEN表達下調(diào)對肝星狀細胞骨架蛋白F-actin的影響仍不清楚。為此，本研究利用RNA干擾技術(shù)，將靶向PTEN的RNA干擾序列——短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的活化HSC，構(gòu)建HSC的PTEN低表達模型，以觀察下調(diào)PTEN表達對活化肝星狀細胞骨架蛋白F-actin的影響。

材 料 和 方 法

1 細胞與試劑

表型活化的大鼠肝星狀細胞系HSC-T6及293A細胞購于中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院；將冷凍保存的肝星狀細胞復蘇后接種于含10%胎牛血清(Biological Industries)DMEM(Gibco)完全培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并傳代；攜帶靶向PTEN的shRNA并表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的重組腺病毒Ad-shRNA/PTEN由武漢浙瑪生物技術(shù)公司協(xié)助構(gòu)建，僅表達GFP的空病毒由第三軍醫(yī)大學祝善俊教授惠贈，通過反復感染293A細胞的方法進行擴增，并測定其滴度；熒光素四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC)標記的鬼筆環(huán)肽購于上海翊圣生物有限公司；DAPI及Triton X-100購于Sigma；熒光防淬滅封片劑購于Bioworld；鈣熒光探針Rhod-2/AM購于Invitrogen；小鼠抗PTEN單克隆抗體購于Abcam；兔抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)單克隆抗體購于Affinity；Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG和逆轉(zhuǎn)錄反應體系均購于上海英俊生物技術(shù)有限公司；HRP標記的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG購于KRL。

2 方法

2.1 腺病毒轉(zhuǎn)染體外活化的HSC 以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HSC，當細胞生長至80%融合時，以感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為100進行腺病毒轉(zhuǎn)染。確定所需病毒顆粒量(細胞數(shù)×MOI)，用不含血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)液稀釋后加入細胞培養(yǎng)瓶，使其均勻分布于培養(yǎng)瓶底部，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，每隔20 min輕輕搖晃培養(yǎng)瓶以促進感染。2 h后補充適量完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)至實驗所需時間。分別于腺病毒轉(zhuǎn)染HSC 12、24、48和72 h在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光表達，并計算轉(zhuǎn)染效率，48 h時轉(zhuǎn)染效率>80%，48 h與72 h GFP陽性表達的HSC數(shù)量無明顯差別，但感染72 h時細胞脫落現(xiàn)象更廣泛，表明腺病毒轉(zhuǎn)染HSC 48 h時轉(zhuǎn)染效率已達到最高，后續(xù)實驗將采用腺病毒轉(zhuǎn)染48 h的HSC。于倒置熒光顯微鏡下觀察HSC的熒光表達率達80%以上。實驗分為對照(control)組(在腺病毒轉(zhuǎn)染步驟以DMEM代替病毒液)、 Ad-GFP組(轉(zhuǎn)染表達GFP的空病毒)和 Ad-shRNA/PTEN組(轉(zhuǎn)染攜帶靶向PTEN的shRNA并表達GFP的重組腺病毒Ad-shRNA/PTEN)。

2.2 Western blotting實驗檢測HSC的PTEN蛋白表達 按上述實驗分組及腺病毒轉(zhuǎn)染方法將腺病毒轉(zhuǎn)染體外活化HSC，腺病毒感染HSC 48 h，消化、收集上述各組細胞，提取細胞蛋白后應用BCA蛋白定量法測定蛋白含量；SDS-PAGE分離蛋白，于冰上濕轉(zhuǎn)，含5% BSA的TBST中封閉2 h，加入小鼠抗PTEN單克隆抗體(1∶100)和兔抗GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜后，TBST振搖洗膜 10 min×4次，以封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜 10 min×4次。加入ECL顯色液避光1 min后放入生物分子成像儀進行免疫顯色，所得圖像用ImageJ 1.47H軟件定量分析，結(jié)果以目的蛋白與GAPDH的積分吸光度值的比值表示。

2.3 實時熒光定量PCR技術(shù)檢測HSC的PTEN mRNA表達 腺病毒感染HSC 48 h，消化并收集各組HSC，采用TRizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PTEN及內(nèi)參照GAPDH的引物均由上海生工生物公司協(xié)助設計合成。引物序列：PTEN的上游引物為5’-TCCTGCAGAAAGACTTGAAGGT-3’，下游引物為5’-GCTGTGGTGGGTTATGGTCT-3’，擴增產(chǎn)物大小為182 bp；GAPDH的上游引物為5’-GGCTCATGACCACAGTCCAT-3’，下游引物為5’-ACATTGGGGGTAGGAACACG-3’，擴增產(chǎn)物大小為202 bp。在Mastercycler ep RealPlex4實時熒光定量PCR儀上進行實時定量擴增。SYBR反應體系20 μL。PCR 的反應條件：為 95 ℃ 3 min； 95 ℃ 12 s， 58 ℃ 40 s， 72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。各反應體系擴增后，定量PCR儀顯示S形擴增曲線平滑完整，上升迅速陡峭并很快到達平臺期，熔解曲線單峰，提示擴增產(chǎn)物單一，無非特異性擴增。采用相對定量2-ΔΔCt法比較各組HSC的PTEN mRNA表達[11]。

2.4 HSC的形態(tài)、應力纖維、偽足及F-actin的觀察 腺病毒感染HSC 48 h，吸去上述各組細胞培養(yǎng)液，加入PBS清洗細胞5 min；吸去PBS，加入4%多聚甲醛溶液進行細胞固定，室溫固定30 min；吸去多聚甲醛，室溫下PBS清洗細胞3次，每次5 min；室溫條件下，加入0.1% Triton X-100溶液透化處理5 min；室溫條件下，用PBS清洗細胞3次，每次5 min；吸去PBS，用濾紙輕輕吸去玻片上的液體，滴加200 μL 2% BSA封閉液，室溫下封閉15 min；吸去封閉液，PBS洗滌3次，每次5 min；吸去PBS，滴加1∶125稀釋的TRITC標記鬼筆環(huán)肽工作液200 μL，覆蓋住培養(yǎng)皿中央圓孔處的細胞，室溫避光孵育2 h；PBS清洗3次，每次5 min；用濃度為5 mg/L的 DAPI溶液復染細胞核5 min；用PBS清洗片刻后，在培養(yǎng)皿底部滴加熒光防淬滅封片劑使其完全覆蓋住中央圓孔處，置于激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope, LSCM)下，隨機選取6個視野進行觀察并分析熒光圖像。

2.5 肝星狀細胞內(nèi)Ca2+濃度測定 腺病毒感染HSC 48 h，取出各組細胞，除去培養(yǎng)基，以 HBSS溶液沖洗細胞3次；加入配制的濃度為5 μmol/L的Rhod-2/AM工作液，充分覆蓋培養(yǎng)皿底部中央圓孔處的細胞；置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱避光孵育30 min，除去Rhod-2/AM工作液；以HBSS溶液沖洗細胞3次，置于LSCM下，隨機選取6個視野進行觀察，激發(fā)波長557 nm，發(fā)射波長581 nm，以熒光強度表示細胞內(nèi)Ca2+水平，Ca2+濃度越大，熒光強度越強。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件處理，實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，3組樣本均數(shù)間差異比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 靶向PTEN的shRNA下調(diào)體外活化HSC的PTEN表達

腺病毒感染HSC 48 h，實時熒光定量PCR檢測各組HSC的PTEN mRNA表達，以control組PTEN的mRNA表達量為1，則Ad-GFP組及Ad-shRNA/PTEN組的PTEN mRNA表達量分別為control組的92%和64%，Ad-shRNA/PTEN組PTEN mRNA表達量明顯低于control組及Ad-GFP組(P<0.05)；而control組與Ad-GFP組之間差異無統(tǒng)計學顯著性。Western blotting實驗檢測各組HSC的PTEN蛋白表達，Ad-shRNA/PTEN組(1.088±0.036)明顯低于control組(1.438±0.038)及Ad-GFP組(1.413±0.058)(P<0.05)，而control組與Ad-GFP組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性。上述結(jié)果顯示靶向PTEN的shRNA成功轉(zhuǎn)染體外活化HSC，敲減了HSC的PTEN表達，成功構(gòu)建了HSC的PTEN低表達模型，見圖1、2。

2 PTEN低表達對HSC形態(tài)、應力纖維、偽足及F-actin的影響

HSC經(jīng)TRITC標記的鬼筆環(huán)肽染色后，于LSCM下觀察，可見細胞內(nèi)F-actin被激發(fā)出紅色熒光。Control組與Ad-GFP組HSC內(nèi)可見應力纖維，纖維絲短而稀疏，排列不規(guī)則，很少偽足形成；轉(zhuǎn)染攜帶靶向PTEN的shRNA的重組腺病毒48 h，可觀察到HSC內(nèi)F-actin排列緊密規(guī)則，纖維絲明顯增粗增長，偽足向外充分延伸。Ad-shRNA/PTEN組F-actin的熒光強度較control組及Ad-GFP組顯著增強(P<0.05)，而control組與Ad-GFP組間差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3、表1。

Figure 1.PTEN mRNA expression of HSC in each group at 48 h after adenovirus infection. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs Ad-shRNA/PTEN group.

Figure 2.PTEN protein expression of HSC was detected by Western blotting at 48 h after adenovirus infection. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs Ad-shRNA/PTEN group.

3 PTEN低表達對HSC內(nèi)Ca2+濃度的影響

HSC經(jīng)Rhod-2/AM鈣熒光探針處理后，于LSCM下觀察，可見胞漿內(nèi)呈現(xiàn)紅色熒光。Ad-shRNA/PTEN組HSC內(nèi)Ca2+濃度較control組及Ad-GFP組明顯增強(P<0.05)，而control組與Ad-GFP組間差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖4、表1。

*P<0.05vsAd-shRNA/PTEN group.

討 論

細胞骨架是指細胞中的蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包括微管、中間纖維和微絲三部分。Actin是微絲的主要組成成分,也是構(gòu)成細胞骨架的重要骨架蛋白，F(xiàn)-actin則是其具有生物學活性作用的形式。F-actin不僅參與細胞形態(tài)和空間結(jié)構(gòu)的維持，而且在細胞附著、遷移、凋亡、物質(zhì)運輸、跨膜信息傳遞以及受體的聚集等許多細胞生命活動中發(fā)揮重要作用[12-14]。當受到外界刺激時，細胞通過多種信號轉(zhuǎn)導途徑介導F-actin發(fā)生重構(gòu)，形成應力纖維、偽足，細胞形態(tài)也隨之改變。而PTEN是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，編碼的蛋白產(chǎn)物是具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的雙重特異性磷酸酶。已有研究發(fā)現(xiàn)，PTEN突變可影響膠質(zhì)母細胞瘤細胞骨架蛋白F-actin的重構(gòu)，表現(xiàn)為優(yōu)先形成絲狀及層狀偽足[15]。但PTEN低表達對在肝纖維化病理過程中發(fā)揮重要作用的肝星狀細胞骨架蛋白F-actin的影響尚不清楚。為此，本實驗利用RNA干擾技術(shù)，以腺病毒為載體，將靶向PTEN的 shRNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的活化HSC，在證實靶向PTEN的 shRNA成功轉(zhuǎn)染于HSC并下調(diào)PTEN表達后，應用TRITC標記的鬼筆環(huán)肽和LSCM成像技術(shù)，觀察了HSC的形態(tài)、F-actin分布、應力纖維、偽足及F-actin熒光強度變化。結(jié)果顯示，下調(diào)PTEN表達后HSC內(nèi)F-actin數(shù)量增多，熒光強度增強，應力纖維絲增長增粗，偽足充分向外延伸。這提示PTEN表達下調(diào)使體外活化肝星狀細胞骨架蛋白F-actin的形成及細胞骨架的重構(gòu)增強。而我們前期的研究已發(fā)現(xiàn)大鼠纖維化肝組織及在體肝星狀細胞的PTEN表達均下調(diào)[9]，或許PTEN低表達使活化肝星狀細胞骨架蛋白F-actin的形成及細胞骨架的重構(gòu)增強是PTEN參與肝纖維化病理過程的機制之一。

Actin以可溶性的單體G-actin和聚合體的F-actin存在，2種形式的actin可以根據(jù)細胞功能狀態(tài)相互轉(zhuǎn)化，維持動態(tài)平衡，而細胞內(nèi) Ca2+濃度可調(diào)節(jié)這一平衡[6]。并且，Ca2+作為重要的細胞內(nèi)第二信使，在細胞興奮、增殖、收縮等一系列細胞功能中也發(fā)揮重要作用[16]。為明確PTEN低表達對肝星狀細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響，本研究在證實靶向PTEN的 shRNA下調(diào)HSC的PTEN表達后，也檢測了肝星狀細胞內(nèi)Ca2+濃度。結(jié)果顯示， PTEN低表達可顯著升高肝星狀細胞內(nèi)Ca2+濃度，這提示PTEN低表達增強肝星狀細胞F-actin的形成與其細胞內(nèi)Ca2+濃度升高有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)PTEN表達可引起體外活化肝星狀細胞骨架蛋白F-actin的形成及細胞骨架的重構(gòu)增強，并導致活化HSC內(nèi)Ca2+濃度升高，但發(fā)生上述變化的具體機制及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導還有待于進一步研究。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of adenovirus-mediated shRNA targetingPTENon cytoskeletal protein F-actin in activated hepatic stellate cells

HAO Li-sen1, SONG Xiao-jie1, ZHANG Guang-ling2, WANG Jing1, LIU Bo1, ZHANG Peng-lei1, ZHANG Ming-ting1, JIN Li-min1

(1DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedHospital,2SchoolofBasicMedicalSciences,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China.E-mail:haolisen125@163.com)

AIM: To investigate the effects of down-regulation of phosphatase and tensin homology detected on chromosome 10 (PTEN) gene by adenovirus-mediated short hairpin RNA (shRNA) on cytoskeletal protein filamentous actin (F-actin) in activated hepatic stellate cells (HSC)invitro. METHODS: The activated HSC (HSC-T6 cells) were culturedinvitroand transfected with recombinant adenovirus carrying shRNA targeting PTEN and expressing green fluorescent protein (GFP), Ad-shRNA/PTEN， and the control adenovirus expressing GFP only， Ad-GFP. The expression of PTEN in the HSC was measured by Western blotting and real-time fluorescent quantitative PCR (RT-qPCR). Under the laser scanning confocal microscope, the cellular morphology, distribution and fluorescence intensity of F-actin, stress fibers and pseudopodia in activated HSC were examined by phalloidin marked with tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC). The concentration of intracellular Ca2+in the HSC was detected by calcium fluorescent probe Rhod-2/AM. The HSC were divided into control group (using DMEM instead of adenovirus for transfection), Ad-GFP group (the HSC were transfected with the empty adenovirus expressing GFP alone) and Ad-shRNA/PTEN group (the HSC were transfected with recombinant adenovirus Ad-shRNA/PTEN). RESULTS: The shRNA targetingPTENwas successfully transfected into activated HSCinvitro, and significantly down-regulated the expressions of PTEN at protein and mRNA levels in the HSC (P<0.05). The HSC withPTENknockdown showed starlike and stretched to the surrounding. The F-actin of the cells was closely arranged in order and had the increasing number. The pseudopodia fully extended outward, and stress fibers got larger and thicker. The fluorescence intensity of F-actin in Ad-shRNA/PTEN group significantly enhanced (P<0.05) compared with control group and Ad-GFP group, while no significant difference between control group and Ad-GFP group was observed. Intracellular Ca2+concentration of the HSC in Ad-shRNA/PTEN group was statistically higher (P<0.05) than that in control group and Ad-GFP group, and no significant difference between control group and Ad-GFP group was found. CONCLUSION: Down-regulation of PTEN expression promotes the formation of F-actin and reorganization of cytoskeleton in activated HSC, and increases the intracellular Ca2+concentration in activated HSCinvitro.

PTEN; RNA interference; Hepatic stellate cells; Cytoskeleton; Filamentous actin

1000- 4718(2017)03- 0557- 06

2016- 08- 01

2016- 12- 01

河北省自然科學基金資助項目(No. H2013209327); 中國肝炎防治基金會天晴肝病研究基金資助項目(No. CFHPC20132078)

△通訊作者 Tel: 0315-2308012; E-mail: haolisen125@163.com

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.030