張廣宇，賈世峰，張曉煒，曹旭華，焦保華

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 石家莊 050000；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，河北 唐山 063000)

ClC-3的表達峰度與膠質(zhì)瘤細胞增殖的關(guān)系

張廣宇1，賈世峰2，張曉煒1，曹旭華1，焦保華1

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 石家莊 050000；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，河北 唐山 063000)

目的 研究氯離子通道-3(ClC-3)的表達峰度與膠質(zhì)瘤細胞增殖的關(guān)系。方法選取2015年5月至2016年5月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科收治的20例膠質(zhì)瘤患者作為觀察組，另選同期20例行顱內(nèi)減壓術(shù)治療的腦創(chuàng)傷患者作為對照組，比較兩組患者不同ClC-3表達峰度下膠質(zhì)瘤細胞增殖差異。結(jié)果觀察組患者的CIC-3mRNA、細胞周期素D1(Cyclin D1)、細胞周期素E(Cyclin E)、Ki-67、增殖細胞核抗原(PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達水平分別為(0.78±0.14)%、(81.85±21.45)%、(85.48±21.32)%、(81.25±21.34)%、(73.46±22.24)%、(0.77±0.21)%、(1.21±0.15)%，與對照組的(0.25±0.15)%、(62.31±11.55)%、(48.33± 11.10)%、(48.10±11.10)%、(23.12±11.28)%、(0.45±0.17)%、(0.77±0.18)%相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；觀察組內(nèi)ClC-3中低表達峰度患者CIC-3 mRNA、Cyclin D1、Cyclin E、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9表達水平為(0.59±0.20)%、(64.33±1.57)%、(59.74±2.71)%、(62.33±1.25)%、(54.64±2.21)%、(0.62±0.18)%、(0.87±0.12)%，與高表達峰度患者的(0.91±0.12)%、(96.32±1.15)%、(96.48±1.20)%、(94.28±1.37)%、(85.66±2.34)%、(0.89±0.24)%、(1.33± 0.20)%相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論ClC-3的表達峰度與膠質(zhì)瘤細胞增殖關(guān)系密切，ClC-3的表達峰度越高，膠質(zhì)瘤細胞增殖越顯著，可將其作為防治膠質(zhì)瘤的新靶點。

氯離子通道-3；表達；峰度；膠質(zhì)瘤；細胞增殖

膠質(zhì)瘤為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的簡稱，是指發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤，為目前臨床較為常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，不僅嚴重威脅患者生命安全，同時給臨床診療工作造成一定阻礙，已經(jīng)引起了臨床的高度關(guān)注[1]。近些年來隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷深入開展，膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響因素研究取得了階段性的成果，其中氯離子通道-3(Chloride channel-3，ClC-3)表達峰度與膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展存在密切的關(guān)聯(lián)性，日益引起臨床的重視[2]。本研究進一步圍繞ClC-3的表達峰度與膠質(zhì)瘤細胞增殖的關(guān)系展開深入研究，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年5月至2016年5月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科收治的20例膠質(zhì)瘤患者作為觀察組，其中男性14例、女性6例；年齡25～62歲，平均(43.25±1.38)歲；病程6個月～1.5年，平均(1.00±0.15)年；Kernohan分級：Ⅱ級4例、Ⅲ級10例、Ⅳ級6例；臨床表現(xiàn)：頭痛5例、視力減退7例、精神癥狀8例；ClC-3表達峰度：低表達峰度9例、中表達峰度5例、高表達峰度6例。納入標準：①經(jīng)臨床綜合診斷確診為膠質(zhì)瘤者；②無其他全身嚴重器質(zhì)性疾病者；③臨床依從性好者；④無免疫系統(tǒng)疾病或缺陷者。排除標準：①血液系統(tǒng)疾病或凝血功能障礙者；②妊娠期、哺乳期患者。另選同期20例行顱內(nèi)減壓術(shù)治療的腦創(chuàng)傷患者作為對照組，其中男性12例，女性8例；年齡28～60歲，平均(43.18±1.45)歲；致病原因：交通事故15例、高空墜落5例；臨床表現(xiàn)：頭痛6例、單側(cè)或雙側(cè)瞳孔散大7例、精神癥狀7例。兩組患者的性別、年齡、臨床表現(xiàn)等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準 所有膠質(zhì)瘤診斷符合美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)編撰的《膠質(zhì)瘤臨床指引(2006)》中的以下內(nèi)容：①腦脊液穿刺檢查提示腦脊液蛋白量顯著增加，白細胞計數(shù)同樣增加；②腦電圖檢查提示腫瘤部位腦電波頻率計波幅較周圍正常組織顯著改變，如：局限性δ波、棘波或尖波等；③放射性同位素掃描顯示血腦屏障通透性提高、同位素吸收率高；④頭顱平片掃描提示顱內(nèi)壓增高征，腫瘤鈣化及松果體鈣化移位等[3]。

1.3 研究方法

1.3.1 膠質(zhì)瘤增殖試驗方法 將入組膠質(zhì)瘤患者膠質(zhì)瘤細胞以2×105/mL密度接種于96孔板，按照操作說明，加入10 uL(購自于美國Santa Cruz公司) CLC-3抗體，置于5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，將其置入美國BioTek公司生產(chǎn)的ELx800酶聯(lián)免疫檢測儀中于波長450 nm處測定光密度值[4]。

1.3.2 免疫組化 將兩組患者腦組織樣本實施石蠟固定并置于烘箱之中以67℃烘片2.5 h，促使石蠟切片脫蠟至水，隨后采用pH7.4的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)反復(fù)洗片3次。另取定量pH6.0檸檬酸鹽緩沖液加熱至沸騰后將切片置于其中，放入微波盒中微波處理15 min后自然冷卻[5]。利用無菌蒸餾水反復(fù)沖洗3次，每次持續(xù)時間3 min，室溫下孵育15 min，去除磷酸緩沖鹽溶液后加入聚合物增強劑，孵育25 min，磷酸緩沖鹽溶液反復(fù)沖洗3次，每次5 min，再次去除該溶液并加入酶標抗鼠/兔聚合物，孵育0.5 h，繼續(xù)經(jīng)上述步驟處理，加入配置的二氨基聯(lián)苯胺溶液(diaminobenzidine，DAB)，蘇木素復(fù)染，藍化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥后于顯微鏡下觀察[6]。

1.3.3 ClC-3表達峰度結(jié)果判定 將間質(zhì)瘤細胞胞膜或者是胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色定義為陽性細胞，連續(xù)取20個視野計算平均值，并以陽性細胞數(shù)＜10%作為低表達、陽性細胞數(shù)10%～30%為中表達、陽性細胞數(shù)＞30%為高表達[7]。

1.4 觀察指標 觀察不同組別CIC-3mRNA、細胞周期素D1(Cyclin D1)、細胞周期素E(Cyclin E)、Ki-67、增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)表達水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的膠質(zhì)瘤細胞增殖指標比較 對照組CIC-3蛋白陰性表達及觀察組的陽性表達見圖1、圖2；觀察組患者的CIC-3mRNA、Cyclin D1、Cyclin E、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9表達水平與對照組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

圖1 CIC-3蛋白在對照組的陰性表達(×400)

圖2 CIC-3蛋白在觀察組的陽性表達(×400)

表1 兩組患者的膠質(zhì)瘤細胞增殖指標比較(±s，%)

表1 兩組患者的膠質(zhì)瘤細胞增殖指標比較(±s，%)

組別對照組觀察組t值P值例數(shù)20 20 CIC-3mRNA 0.25±0.15 0.78±0.14 11.552＜0.05 Cyclin D1 62.31±11.55 81.85±21.45 6.764＜0.05 Cyclin E 48.33±11.10 85.48±21.32 8.298＜0.05 Ki-67 48.10±11.10 81.25±21.34 7.986＜0.05 PCNA 23.12±11.28 73.46±22.24 9.029＜0.05 MMP-2 0.45±0.17 0.77±0.21 4.892＜0.05 MMP-9 0.77±0.18 1.21±0.15 7.637＜0.05

2.2 觀察組內(nèi)不同ClC-3表達峰度患者膠質(zhì)瘤細胞增殖指標比較 觀察組內(nèi)中低表達峰度患者與高表達峰度患者膠質(zhì)瘤細胞增殖指標表達水平相比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 觀察組內(nèi)膠質(zhì)瘤細胞增殖指標比較(±s，%)

表2 觀察組內(nèi)膠質(zhì)瘤細胞增殖指標比較(±s，%)

組別中低峰度高峰度t值P值例數(shù)14 6 CIC-3mRNA 0.59±0.20 0.91±0.12 3.616＜0.05 Cyclin D1 64.33±11.57 96.32±21.15 4.411＜0.05 Cyclin E 59.74±12.71 96.48±21.20 5.732＜0.05 Ki-67 62.33±11.25 94.28±21.37 5.343＜0.05 PCNA 54.64±12.21 85.66±22.34 5.449＜0.05 MMP-2 0.62±0.18 0.89±0.24 2.788＜0.05 MMP-9 0.87±0.12 1.33±0.20 6.428＜0.05

3 討論

近年來，大量臨床研究證實膠質(zhì)瘤具有較高的特異性，侵襲能力顯著，并且對于放化療的抵抗能力較強，所以該腫瘤已經(jīng)成為了中樞神經(jīng)系統(tǒng)致死率最高的惡性腫瘤之一[8]。目前該病治療的難點集中于膠質(zhì)瘤細胞增殖以及組織浸潤廣泛，所以尋求能夠阻斷膠質(zhì)瘤細胞惡性增殖與浸潤的分子靶點成為醫(yī)學(xué)界研究的熱門議題。

隨著臨床研究的不斷深入開展，細胞內(nèi)離子通道在調(diào)控腫瘤細胞生長周期方面發(fā)揮了重要的作用，尤其是腫瘤細胞在攝取到充足的營養(yǎng)物質(zhì)后內(nèi)部滲透壓隨之升高，促使細胞外的水分子進入到細胞內(nèi)，使得細胞容積大幅增加，激活氯離子(Cl-)通道，導(dǎo)致自身的氯離子外流[9]。容積調(diào)節(jié)性氯通道(volume regulated chloride channel，VRCC)全程參與到了腫瘤細胞的增殖過程，對其展開研究將有助于探尋更加有效的診療方案[10]。本次研究證實，觀察組CIC-3mRNA、Cyclin D1、Cyclin E、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9表達水平均顯著高于正常對照組，而觀察組內(nèi)中低表達峰度的膠質(zhì)瘤患者CIC-3mRNA、Cyclin D1、Cyclin E、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9表達水平低于高表達峰度患者。由此結(jié)果可知，ClC-3的表達峰度與膠質(zhì)瘤細胞增殖呈現(xiàn)出密切相關(guān)，而此種關(guān)聯(lián)性對于阻斷膠質(zhì)瘤細胞的增殖具有重要意義。

綜上所述，ClC-3的表達峰度與膠質(zhì)瘤細胞增殖密切相關(guān)，ClC-3的表達峰度越高，膠質(zhì)瘤細胞增殖越顯著，可將其作為防治膠質(zhì)瘤的新靶點。

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Relationship between ClC-3 expression kurtosis and glioma cell proliferation.

ZHANG Guang-yu1,JIA Shi-feng2, ZHANG Xiao-wei1,CAO Xu-hua1,JIAO Bao-hua1.1.Department of Neurosurgery,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,Hebei,CHINA;2.Department of Oncology,the Affiliated Hospital of North China University of Science&technology,Tangshan 063000,Hebei,CHINA

ObjectiveTo study the relationship of chloride channel-3(ClC-3)expression with glioma cell proliferation.MethodsFrom May 2015 to May 2016,20 patients with glioma in the Second Hospital of Hebei Medical University were enrolled as the observation group,and 20 patients with traumatic brain injury undergoing intracranial decompression were selected as the control group.Glioma cell proliferation under different ClC-3 expression kurtosis was compared between the two groups.ResultsCIC-3 mRNA,Cyclin D1,Cyclin E,Ki-67,proliferating cell nuclear antigen(PCNA),MMP-2 and MMP-9 expression levels in the observation group were(0.78±0.14)%,(81.85±21.45)%, (85.48±21.32)%,(81.25±21.34)%,(73.46±22.24)%,(0.77±0.21)%,(1.21±0.15)%,as compared with(0.25±0.15)%, (62.31±11.55)%,(48.33±11.10)%,(48.10±11.10)%,(23.12±11.28)%,(0.45±0.17)%,(0.77±0.18)%in the control group (P＜0.05).In the observation group,CIC-3 mRNA,Cyclin D1,Cyclin E,Ki-67,PCNA,MMP-2,MMP-9 in patients with low expression kurtosis were(0.59±0.20)%,(64.33±11.57)%,(59.74±12.71)%,(62.33±11.25)%,(54.64±12.21)%, (0.62±0.18)%,(0.87±0.12)%,as compared with(0.91±0.12)%,(96.32±21.15)%,(96.48±21.20)%,(94.28±21.37)%, (85.66±22.34)%,(0.89±0.24)%,(1.33±0.20)%in patients with high expression kurtosis,(P＜0.05).ConclusionClC-3 expression kurtosis is positively correlated with glioma cell proliferation,which may be used as a new target for the prevention and treatment of glioma.

Chloride channel-3(ClC-3);Expression;Kurtosis;Glioma;Cell proliferation

R730.264

A

1003—6350（2017）06—0877—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.06.005

2016-09-30)

焦保華。E-mail：13932193056@163.com