程建如++周明芹

摘要：以對節(jié)白蠟（Fraxinus hupehensis Chiú，Shang et Su）基因組DNA為材料，采用正交試驗(yàn)和單因子試驗(yàn)對其ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了構(gòu)建與優(yōu)化。結(jié)果表明，在15 μL反應(yīng)體系中含DNA模版40 ng、引物終濃度0.7 μmol/L、7.5 μL 2×Taq PCR Plus Master Mix的擴(kuò)增效果最好。該反應(yīng)體系篩選出了14條穩(wěn)定性強(qiáng)、多態(tài)性高、擴(kuò)增效果較好的ISSR引物，并通過梯度PCR試驗(yàn)比較引物在不同退火溫度下的擴(kuò)增效果，從而確定引物最佳退火溫度。

關(guān)鍵詞：對節(jié)白蠟（Fraxinus hupehensis Chiú，Shang et Su）；ISSR-PCR；反應(yīng)體系；單因子試驗(yàn)；正交設(shè)計

中圖分類號：Q78；Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）22-5962-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.058

Establishment and Optimization of Fraxinus hupehensis ISSR-PCR Reaction System

CHENG Jian-ru， ZHOU Ming-qin

（College of Horticulture and Landscape Architechture，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）

Abstract：The single factor test and orthogonal design were used to establish and optimize the ISSR-PCR reaction system of Fraxinus hupehensis Chiú，Shang et Su. The results showed that the appropriate PCR reaction system consisted of 40 ng template DNA，0.7 μmol/L primer，and 7.5 μL 2×Taq PCR Plus Master Mix.14 high-efficient polymorphic primers were screened out based on the optimal ISSR reaction system.Furthermore，the ideal annealing temperature of the every selected primer was decided according to the amplified results with different temperatures.

Key words：Fraxinus hupehensis； ISSR-PCR； reaction system； single factor test； orthogonal design

對節(jié)白蠟（Fraxinus hupehensis Chiú，Shang et Su）為木犀科白蠟屬的落葉喬木，又名湖北白蠟、對節(jié)樹、湖北梣，特產(chǎn)于湖北省，1990年被正式定為國家二級珍稀瀕危保護(hù)植物[1]。該種僅分布于湖北省鐘祥與京山接壤地區(qū)，多生長在海拔100～600 m的土層深厚的山坡、溝谷、水積平臺及村邊路旁，在群落中多沿山坡向溝谷逐漸加大，甚至形成小片純林[2]。該物種生長緩慢，具有很高觀賞價值；材質(zhì)優(yōu)良，既是珍貴的用材樹種，又是優(yōu)美的園林綠化樹種，還是極佳的盆景、根雕素材，被譽(yù)為“活化石”或“盆景之王”，此外還具有很高的藥用價值。近年來，由于重利用輕保護(hù)，亂砍濫伐，尤其是為制作樹樁盆景，節(jié)白蠟野生資源遭到過度采挖，破壞嚴(yán)重。因此，了解對節(jié)白蠟野生資源的現(xiàn)狀，加強(qiáng)基礎(chǔ)研究，探討其瀕危機(jī)制，制定資源保護(hù)與合理利用之對策已屬當(dāng)務(wù)之急。

目前，有關(guān)對節(jié)白蠟的研究較少，主要集中在資源調(diào)查[3]、育苗技術(shù)[4]、植物組織培養(yǎng)[5]、化學(xué)成分和藥理作用[6]等幾個方面。但有關(guān)對節(jié)白蠟分子遺傳標(biāo)記的研究國內(nèi)外尚未見報道。ISSR（Inter-simple sequence repeat），又稱為Inter-SSR，即簡單重復(fù)序列區(qū)間，屬于第二代DNA分子標(biāo)記，是Zietkiewicz等[7]于1994年在SSR標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。ISSR技術(shù)是利用在植物基因組中常出現(xiàn)的SSR本身設(shè)計引物，使位于反向排列、間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于SSR在真核生物中分布廣泛，且串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目具有高度多態(tài)性[8]，因而ISSR-PCR可以檢測基因組中豐富的遺傳變異。此外，ISSR技術(shù)操作簡單快速，引物來源簡單，試驗(yàn)成本較低[9]。因此已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、進(jìn)化及遺傳多樣性等方面的研究[10-13]。本研究以對節(jié)白蠟基因組DNA為模板，對其ISSR反應(yīng)體系進(jìn)行構(gòu)建與優(yōu)化，為后期對節(jié)白蠟種質(zhì)資源在分子水平的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料分別采自鐘祥市雞鳴寺林場雷沖分場、雁門口鎮(zhèn)和楊集鎮(zhèn)，3份材料樣本編號分別為17、145、234。樣本為當(dāng)年生嫩葉，葉片上的灰塵用自來水洗干凈，后用吸水紙將殘留的水分吸干，然后去除葉柄，將葉片迅速放入自封袋，加變色硅膠后封口保存。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取與檢測 對節(jié)白蠟基因組DNA提取采用改良CTAB法[8]，用Thermo Scientific Nano Drop 2000C分光光度計儀檢測其純度和濃度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。

1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)設(shè)計 PCR反應(yīng)體系采用2×Taq PCR Plus Master Mix（包括Taq DNA Polymerase、2×Taq PCR Buffer、Mg2+、dNTP Mix），故本研究涉及的ISSR-PCR反應(yīng)體系影響因子只有2個：模板DNA用量和引物用量。本研究首先采用正交試驗(yàn)設(shè)計初步的反應(yīng)體系（表1）。反應(yīng)的總體積為15 μL，除含兩個變化因素外，還含有7.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，其余用RNase-Free Water補(bǔ)足至15 μL。引物選用UBC873，該引物序列為：GACAGACAGACAGACA。

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含有GelRed核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠于1×TAE緩沖液中電泳，電壓設(shè)定為120 V，電泳時間30 min，待電泳結(jié)束取出凝膠，在凝膠成像系統(tǒng)觀察并成像分析。

1.2.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系單因子試驗(yàn) 以正交試驗(yàn)中擴(kuò)增效果反應(yīng)效果較好的體系為基礎(chǔ)，再設(shè)計單因子試驗(yàn)，進(jìn)一步篩選反應(yīng)體系中引物和模版DNA的濃度。DNA模板（50 ng/μL）的候選用量：0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 μL；10 μmol/L引物的候選用量：0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05、1.20、1.35 μL。

1.2.4 ISSR-PCR擴(kuò)增程序的優(yōu)化 利用正交試驗(yàn)和單因子試驗(yàn)確定的優(yōu)化ISSR-PCR反應(yīng)體系，篩選PCR的循環(huán)次數(shù)和引物最佳退火溫度。PCR循環(huán)數(shù)從33～40共8個處理；根據(jù)引物堿基序列計算理論退火溫度，設(shè)定退火溫度梯度范圍（在引物理論退火溫度上下5 ℃內(nèi)篩選最佳值），根據(jù)凝膠成像結(jié)果確定引物最佳退火溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度與純度檢測結(jié)果

提取的對節(jié)白蠟基因組DNA呈白色絮狀沉淀，電泳凝膠結(jié)果顯示，DNA為一條亮帶，提取的DNA質(zhì)量較好。DNA的OD260 nm/OD280 nm多數(shù)在1.70～1.90之間，純度較高，符合ISSR-PCR對DNA的要求（圖1）。

2.2 ISSR-PCR正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計的16個反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物由脂糖凝膠電泳檢測并拍照（圖2）。以特異性帶多、主帶清晰、副帶較為明顯為佳，觀察比較電泳圖譜，確定體系13的擴(kuò)增效果較好。

2.3 DNA模版用量的優(yōu)化

ISSR擴(kuò)增反應(yīng)由于不同物種所需要的最佳模板DNA濃度不同，因此，確定合適的模板DNA濃度是進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng)的必要試驗(yàn)。從圖3中可以看出，模板DNA為20～90 ng時條帶亮度和多態(tài)性差異不大，都能擴(kuò)增出較為清晰的條帶。因此，模版DNA的濃度對對節(jié)白蠟ISSR-PCR反應(yīng)影響不是很敏感，在后續(xù)的15 μL PCR反應(yīng)中選用40 ng模板DNA。

2.4 引物濃度的優(yōu)化

從圖4可以看出，引物濃度對對節(jié)白蠟ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響較為大。在設(shè)置的8個不同濃度梯度中，引物濃度為0.2～0.3 μmol/L時，擴(kuò)增出條帶較模糊，且條帶也少；當(dāng)引物濃度到0.8～0.9 μmol/L時，引物特異性降低，片段模糊不清；當(dāng)引物濃度在0.4～0.7 μmol/L時，擴(kuò)增出條帶較清晰，片段大小基本一致，而引物濃度在0.7 μmol/L時擴(kuò)增效果最好，因此，ISSR-PCR反應(yīng)的適宜引物濃度為0.7 μmol/L。

2.5 循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化

ISSR-PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)對產(chǎn)物有較明顯的影響，反應(yīng)循環(huán)次數(shù)少，產(chǎn)物累積不夠，檢測不出目的條帶，但循環(huán)次數(shù)多，產(chǎn)物累積多，易出現(xiàn)非特異產(chǎn)物。圖5顯示8個不同的PCR循環(huán)次數(shù)對ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響。從圖5可以看出，循環(huán)次數(shù)為33～35時，擴(kuò)增出的條帶模糊不清；當(dāng)循環(huán)次數(shù)為36～39時，所擴(kuò)增的條帶基本一致且清晰，其中循環(huán)為38時，擴(kuò)增出的條帶最為清晰；當(dāng)循環(huán)次數(shù)為40時，擴(kuò)增條帶較粗，不利于后期讀帶分析。因此，ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序的最佳循環(huán)次數(shù)為38。

2.6 引物退火溫度的優(yōu)化

利用優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系，從50個ISSR引物中篩選出了14個引物，并根據(jù)引物的Tm值設(shè)定了不同的退火溫度，經(jīng)電泳檢測（圖6），最后確定了各引物的最佳退火溫度（表2）。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)首先采用正交試驗(yàn)確定模板DNA用量和引物濃度之間的關(guān)系，確定較好反應(yīng)體系，再采用單因子試驗(yàn)對各因素進(jìn)行優(yōu)化，然后利用優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)一步對PCR循環(huán)次數(shù)和引物的退火溫度進(jìn)行篩選，最終得到一個最優(yōu)的ISSR-PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系：15 μL反應(yīng)體系中含有7.5 μL 2×Taq PCR Plus Master Mix，DNA模版40 ng、引物終濃度0.7 μmol/L、最后用RNase-Free Water補(bǔ)足剩余部分。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，最佳退火溫度退火30 s，72 ℃延伸90 s，38個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

ISSR-PCR反應(yīng)包含多種因素，各個因素的變化都會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響[14]。采用正交試驗(yàn)可以分析不同因素間的相互作用，但各個因子水平梯度設(shè)置有限，不利于找到該因素的最佳用量；而單因子試驗(yàn)設(shè)置較精確的梯度確定各因素的用量，但對各個因素間影響無法確定，因此本研究采用正交試驗(yàn)和單因子試驗(yàn)相結(jié)合的方法來構(gòu)建ISSR-PCR的反應(yīng)體系。本試驗(yàn)得到的DNA模板用量和引物濃度與王書珍等[15]報道的杜鵑花ISSR-PCR反應(yīng)體系相吻合。在一些研究報道中，用到ISSR引物退火溫度大多在52～56 ℃之間[16]，而本試驗(yàn)結(jié)果表明，有些引物的退火溫度最高達(dá)到59.9 ℃，最低只有46.3 ℃。因此，在進(jìn)行ISSR試驗(yàn)前，根據(jù)ISSR引物序列的堿基構(gòu)成進(jìn)行相應(yīng)的退火溫度設(shè)計和優(yōu)化是十分必要的。

本研究建立了優(yōu)化的對節(jié)白蠟ISSR-PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系，并利用該反應(yīng)體系篩選出了14條多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的引物，而且確定了各引物的退火溫度，該結(jié)果為后期進(jìn)一步開展對節(jié)白蠟在分子生物學(xué)方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 彭輔松.湖北省第二批國家珍稀瀕危保護(hù)植物[J].武漢植物學(xué)研究，1990，8（4）：383-385.

[2] 蘇丕林，明 軍，廖卉榮.對節(jié)白蠟種質(zhì)資源的分布規(guī)律[J].湖北林業(yè)科技，1994（1）：35-36.

[3] 蘇丕林，明 軍，胡功強(qiáng)，等.對節(jié)白蠟（Fraxinus hupehensis Chiú.Shang et Su.sp.nov.）適生環(huán)境及其群落的調(diào)查研究[J].湖北林業(yè)科技，1995（2）：6-12.

[4] 王文才，劉 蓉，易明兵.對節(jié)白蠟種子育苗技術(shù)[J].湖北林業(yè)科技，2013，12（6）：87-88.

[5] 王彩云，趙明方，姚英娟，等.對節(jié)白蠟扦插技術(shù)研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，23（5）：18-20.

[6] 馬 力，嚴(yán)慧娟，曲佳佳，等.對節(jié)白蠟葉中總香豆素提取工藝研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，29（7）：925-928.

[7] ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics，1994，20（2）：176-183.

[8] 鄒喻蘋，葛 頌，王曉東.系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)中的分子標(biāo)記[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[9] REDDY M P，SARLA N，SIDDIQ E A. Inter simple sequence repeat（ISSR） olymorphism and its application in plant breeding[J].Euphytica，2002，128：9-17.

[10] WANG C Y， ZHAO J C. Optimization of ISSR-PCR reaction system and preliminary construction of ISSR fingerprinting of some species in Bryaceae[J]. Agricultural Science & Technology，2011，12（11）：1561-1568.

[11] HAO G，LEE D H，LEE J S，et al. A study of taxonomical relationships among species of Korean Allium sect. Sacculiferum（Alliaceae）and related species using inter-simple sequence repeat（ISSR） markers[J]. Botanical Bulletin of A Cademia Sinica，2002，43：63-68.

[12] PISSARD A，ROJAS-BELTRAN J A，F(xiàn)AUX A，et al. Evidence of inter-varietal genetic variability in the vegetatively propagared crop oca（Oxalix tuberosa Mol.） in the Andean traditional farming system[J]. Plant Systematics and Evolution，2008， 270（2）：59-74.

[13] 郭郁頻，任永霞，張穎超，等.早熟禾種質(zhì)資源ISSR遺傳多樣性分析[J].中國草地學(xué)報，2014，36（3）：28-34，46.

[14] JONSSON B O， JONSDOT TIR I S， CRONBERG N. Clonal diversity and allozyme variation in population of the arctic Carex bigelowii[J]. Ecology，1996，84：449-459.

[15] 王書珍，查三省，程 呈，等.杜鵑花ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化[J].北方園藝，2015（14）：111-114.

[16]李傳代，陳 飛，王天地，等.女貞ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].熱帶生物學(xué)報，2010，1（2）：100-104.