吳 斌

(福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站/福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002)

“新吉富”羅非魚免疫球蛋白單克隆抗體的制備及其在免疫效果評(píng)價(jià)上的應(yīng)用

吳 斌

(福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站/福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002)

制備了“新吉富”羅非魚血清免疫球蛋白IgM單克隆抗體(McAb)并進(jìn)行了特性分析，以血清IgM McAb為基礎(chǔ)，建立了IgM捕獲ELISA檢測(cè)方法.采用親和層析法純化健康“新吉富”羅非魚IgM，純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，重鏈、輕鏈的相對(duì)分子質(zhì)量分別為75～78、23～25 ku；以純化的IgM為抗原制備IgM McAb，制備McAb雜交瘤細(xì)胞株系3株，分別命名為2H5、2D4、2B11，抗體亞型均為IgM，小鼠腹水效價(jià)分別為1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-5，對(duì)IgM敏感度測(cè)定表明，2H5、2D4、2B11檢測(cè)靈敏度分別為31.25、125.00、62.50 ng.以抗羅非魚IgM McAb包被酶標(biāo)板，建立IgM捕獲ELISA檢測(cè)方法.以無乳鏈球菌滅活疫苗免疫羅非魚，受免血清按建立的IgM捕獲ELISA方法檢測(cè)特異性抗體，結(jié)果表明，建立的IgM捕獲ELISA檢測(cè)方法可應(yīng)用于免疫應(yīng)答抗體水平分析.

“新吉富”羅非魚; 免疫球蛋白IgM; 單克隆抗體; ELISA檢測(cè)方法

羅非魚作為我國(guó)主要的淡水魚養(yǎng)殖品種之一，2006年以來，鏈球菌病給羅非魚產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重危機(jī)，免疫防治將成為控制該疾病的主要方向.在魚類的體液免疫應(yīng)答過程中，免疫球蛋白是重要的免疫效應(yīng)分子.目前從硬骨魚類中已經(jīng)分離到的免疫球蛋白包括IgM、IgD、IgZ、IgT、IgG等[1].IgM是一類存在于所有有頜類脊椎動(dòng)物中的抗體[2]，其單體由兩條輕鏈(L鏈)、兩條重鏈(H鏈)組成，通過連接鏈將5個(gè)單體連接成一個(gè)五聚體，相對(duì)分子質(zhì)量為700～850 ku.

為了研究羅非魚的免疫機(jī)制，吳鐵軍等[3]克隆獲得了羅非魚IgM重鏈的cDNA，其序列全長(zhǎng)1 885 bp，有一個(gè)長(zhǎng)1 770 bp的完整閱讀框，編碼588個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為41 453.94 u，為羅非魚IgM重鏈基因功能的鑒定工作提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù).黃婷等[4]采用rProtein A Sepharose親和層析一步法純化羅非魚IgM，并制備其兔抗血清，結(jié)果表明，血清IgM重鏈、輕鏈的相對(duì)分子質(zhì)量分別為88.0、21.0 ku，由血清IgM制備的兔多抗效價(jià)為1∶32 000.由于羅非魚IgM兔多抗成分復(fù)雜，IgM多克隆抗體應(yīng)用于免疫血清特異性抗體檢測(cè)存在靈敏度不足、特異性差的問題.因此，制備特異性強(qiáng)的羅非魚免疫球蛋白IgM單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb)顯得尤為重要.目前，尚未見以羅非魚免疫球蛋白IgM McAb為制劑，建立IgM捕獲ELISA檢測(cè)方法的報(bào)道.本試驗(yàn)通過制備羅非魚IgM McAb，建立血清特異性IgM抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法，為羅非魚疫苗免疫效果評(píng)價(jià)、免疫應(yīng)答水平監(jiān)測(cè)以及IgM的結(jié)構(gòu)與功能分析、免疫應(yīng)答模式研究等建立物質(zhì)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 “新吉富”羅非魚由福建省淡水水產(chǎn)研究所榕橋中試基地提供；Balb/c雌性小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司.

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 RPMI-1640培養(yǎng)液、HAT培養(yǎng)液、8-氮雜鳥嘌呤、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、Ig亞類鑒定試劑盒購(gòu)自廈門泰京生物技術(shù)有限公司；Hitrap IgM Purification抗體純化試劑盒購(gòu)自Pierce公司；TMB顯色液、牛血清白蛋白購(gòu)自Sigma公司；PEG(MW4000)購(gòu)自Merck公司；BHI、LB等細(xì)菌培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋公司.

1.1.3 菌株、抗體與細(xì)胞株 無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)070717LL、SIP-pET32a重組原核表達(dá)工程菌及SIP重組表達(dá)蛋白、SIP抗兔多克隆抗體、羅非魚IgM兔多克隆抗體均由福建省淡水水產(chǎn)研究所水產(chǎn)動(dòng)物病害防治研究室制備與保存；骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由第四軍醫(yī)大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室提供.

1.2 羅非魚IgM的分離與純化

1.2.1 血清的制備 羅非魚心臟采血，血清置冰箱(4 ℃)過夜，于5 000 r·min-1離心10 min，取上清備用.

1.2.2 IgM的分離純化 血清經(jīng)20% PEG6000沉淀后，用HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR凝膠過濾層析，收集第一個(gè)峰的組分，用Hitrap IgM Purification精細(xì)純化，SDS-PAGE電泳分析純化樣品.

1.3 羅非魚IgM免疫小鼠

取8周齡的Balb/c雌性小鼠5只，將純化的羅非魚IgM與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，以0.2 mL·只-1腹腔注射免疫小鼠[5]，一免后于第14、28、35天分別用羅非魚IgM與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后加強(qiáng)免疫,4免后尾部采血，應(yīng)用間接ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)鼠血清效價(jià).

1.4 羅非魚IgM雜交瘤細(xì)胞株的建立與McAb的制備

當(dāng)免疫Balb/c小鼠血清的效價(jià)達(dá)到1.0×10-5后，按照文獻(xiàn)[5]的方法，應(yīng)用McAb制備技術(shù)，取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，采用間接ELISA檢測(cè)方法篩選陽性細(xì)胞孔，有限稀釋法進(jìn)行單細(xì)胞克隆，建立、保存McAb雜交瘤細(xì)胞株，并制備McAb細(xì)胞株小鼠腹水.

1.5 羅非魚IgM McAb小鼠腹水效價(jià)的測(cè)定

McAb小鼠腹水的效價(jià)采用間接ELISA檢測(cè)方法測(cè)定.酶標(biāo)板包被羅非魚IgM(20 μg·mL-1)；5% BSA封閉；加入以10倍梯度稀釋的IgM McAb小鼠腹水，分別設(shè)置陽性對(duì)照(受免的Balb/c小鼠多抗血清)、陰性對(duì)照(未免疫的Balb/c小鼠血清)，于37 ℃溫育1 h；加HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，于37 ℃溫育1 h；加TMB顯色液，室溫避光顯色10～20 min；加終止液，靜置10 min；將空白對(duì)照調(diào)零，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450、630 nm雙波長(zhǎng)的光密度(D)；若待測(cè)孔的D大于或等于陰性對(duì)照孔的2.1倍時(shí)為陽性.

1.6 羅非魚IgM McAb細(xì)胞株亞類的鑒定

羅非魚IgM McAb細(xì)胞株Ig亞類鑒定按Ig亞類鑒定試劑盒步驟進(jìn)行.

1.7 羅非魚IgM McAb靈敏度的測(cè)定

將羅非魚IgM兔多克隆抗體包被酶標(biāo)板，IgM按一定倍數(shù)梯度稀釋，以1 000 ng至1 ng的系列質(zhì)量作抗原，IgM McAb(15 μg·mL-1)作抗體，采用雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法測(cè)定McAb對(duì)IgM的靈敏度.

1.8 受免羅非魚血清特異性IgM抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法的建立

用抗原SIP蛋白免疫羅非魚，收集血清用于建立特異性IgM抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法.具體步驟如下：將羅非魚IgM McAb 2H5純化，以20 μg·mL-1的含量包被酶標(biāo)板；用5%牛血清白蛋白封閉；加入待測(cè)的受免羅非魚血清(按一定倍數(shù)梯度稀釋)100 μL,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(按一定倍數(shù)梯度稀釋的正常羅非魚血清)、空白對(duì)照(PBS液)，于37 ℃溫育；洗滌后加入SIP蛋白(10 μg·mL-1)，于37 ℃溫育；洗滌后加入抗SIP蛋白的兔多克隆抗體(按1∶100稀釋)，于37 ℃溫育；洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗；最后用TMB顯色；終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測(cè)定450、630 nm雙波長(zhǎng)的D；測(cè)定待測(cè)樣品的D(P)、同倍稀釋的陰性對(duì)照樣品的D(N)，當(dāng)P/N≥2.1時(shí)判為陽性.

1.9 IgM捕獲ELISA檢測(cè)方法應(yīng)用于抗體效價(jià)的檢測(cè)

1.9.1 無乳鏈球菌滅活疫苗的制備 無乳鏈球菌菌株070717LL在BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集菌體，調(diào)整菌液濃度至1×108CFU·mL-1，用0.5%甲醛滅活24 h，于5 000 r·min-1離心10 min，重復(fù)3次，用超聲波破碎菌體，備用.

1.9.2 無乳鏈球菌滅活疫苗免疫羅非魚 取質(zhì)量約80 g的健康“新吉富”羅非魚，暫養(yǎng)1周后，分為3組，每組50只.第1組為陰性對(duì)照組，腹腔注射0.5 mL生理鹽水；第2組腹腔注射全菌滅活疫苗，免疫0.5 mL·只-1(菌濃度1.0×108CFU·mL-1)，一免后第21天用全菌滅活疫苗浸泡加強(qiáng)免疫(浸泡菌濃度1.0×107CFU·mL-1)；第3組腹腔注射全菌滅活疫苗，免疫0.5 mL·只-1(菌濃度1.0×108CFU·mL-1).

1.9.3 受免羅非魚血清特異性抗體效價(jià)的檢測(cè) 一免后，于第7、14、21、28、35、42天各組均隨機(jī)取5尾“新吉富”羅非魚，分離血清，按“1.8”建立的IgM捕獲ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，分析羅非魚血清中特異性抗體的效價(jià).

2 結(jié)果與分析

1:蛋白Marker;2:20% PEG6000;3:HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR洗脫液;4:Hitrap IgM Purification洗脫液.

表1 3株羅非魚McAb的亞型及其效價(jià)

2.1 羅非魚血清IgM的分離純化

羅非魚血清用20% PEG6000沉淀去除了大量雜蛋白，凝膠過濾層析得到進(jìn)一步純化，親和層析得到較純的IgM，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，可見75～78、23～25 ku的條帶(圖1).

2.2 羅非魚IgM McAb雜交瘤細(xì)胞株系的建立

在羅非魚IgM McAb雜交瘤細(xì)胞株系的建立過程中共進(jìn)行5次細(xì)胞融合，融合率均達(dá)55.8%以上.檢測(cè)到陽性雜交瘤細(xì)胞孔后，對(duì)細(xì)胞孔中的細(xì)胞進(jìn)行3次以上的單克隆化，獲得3株能穩(wěn)定分泌McAb的陽性細(xì)胞株，分別命名為2H5、2D4、2B11.

2.3 羅非魚IgM McAb的特性

3株羅非魚McAb的效價(jià)測(cè)定、Ig亞類鑒定結(jié)果(表1)顯示，3株McAb效價(jià)均較高.

2.4 羅非魚IgM McAb的敏感度

根據(jù)雙抗夾心ELISA方法，應(yīng)用3株羅非魚IgM McAb檢測(cè)IgM，結(jié)果(表2)顯示，2H5、2D4、2B11檢測(cè)IgM的靈敏度分別為31.25、125.00、62.50 ng.

2.5 無乳鏈球菌滅活疫苗免疫的羅非魚血清特異性抗體效價(jià)

應(yīng)用羅非魚IgM捕獲ELISA檢測(cè)方法分別檢測(cè)3組羅非魚血清的特異性抗體效價(jià)，結(jié)果(圖2)顯示：第1組(陰性對(duì)照組)血清的效價(jià)均小于1∶50；第2組血清首免后第7天的效價(jià)為1∶200，第21、28天的效價(jià)最高(1∶800)，第42天的效價(jià)為1∶200；第3組血清首免后第7天的效價(jià)為1∶200，第21天的效價(jià)最高(1∶800)，從第28天到第42天，血清效價(jià)從1∶400降低到1∶100.

表2 應(yīng)用3株羅非魚IgM McAb ELISA檢測(cè)IgM的靈敏度1)

1)+表示陽性；-表示陰性.

圖2 全菌滅活疫苗免疫的羅非魚血清特異性抗體效價(jià)

3 討論

當(dāng)前，針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類已建立了斑點(diǎn)叉尾鮰、草魚、歐洲鰻、牙鲆、銀鯽、大黃魚、黃鰭棘鯛、黃鱔、鱸血、美洲黑石斑魚、烏鱧IgM的分離與純化方法[4,6-16]，通過蛋白電泳、蛋白質(zhì)印跡、液相色譜分析等方法明確了這些魚種IgM重鏈的相對(duì)分子質(zhì)量為52～79 ku，輕鏈的相對(duì)分子質(zhì)量為25～29 ku.本試驗(yàn)采用PEG6000沉淀粗提、凝膠過濾層析、親和層析等步驟獲得較高純度的“新吉富”羅非魚IgM，重鏈的相對(duì)分子質(zhì)量為75～78 ku，輕鏈的相對(duì)分子質(zhì)量為23～25 ku.張小萍等[17]研究表明，尼羅羅非魚IgM重鏈、輕鏈的相對(duì)分子質(zhì)量分別為77、27 ku，與本試驗(yàn)的結(jié)果基本相符.

目前，羅非魚和斑點(diǎn)叉尾鮰[4]，以及草魚、大黃魚、黃鰭棘鯛、黃鱔、鱸血、美洲黑石斑魚、烏鱧IgM的多克隆抗體已經(jīng)制備[7,11-16]，并應(yīng)用于魚類IgM的結(jié)構(gòu)分析.但由于魚類Ig分子中的糖基具有強(qiáng)免疫原性，能刺激受免疫動(dòng)物產(chǎn)生大量抗糖基抗體，導(dǎo)致多克隆抗體產(chǎn)生非特異反應(yīng)；另外制備高度純化的免疫原技術(shù)難度大，殘留的雜質(zhì)也將影響二抗的特異性[8].而魚類IgM McAb具有抗原決定簇單一、對(duì)抗原純度要求不高、抗原與抗體結(jié)合力強(qiáng)、可體外大量制備的優(yōu)點(diǎn).因此，制備魚類IgM McAb并應(yīng)用于魚類免疫細(xì)胞的鑒定、抗體結(jié)構(gòu)分析、血清流行病學(xué)調(diào)查、免疫應(yīng)答水平監(jiān)測(cè)、免疫效果評(píng)價(jià)等方面，為魚類免疫學(xué)、血清學(xué)研究提供了重要工具.目前，草魚[6]、歐洲鰻[8]、牙鲆[9]、銀鯽[10]、尼羅羅非魚[17]、紫紅笛鯛[18]、奧尼羅非魚[19]等魚體的IgM McAb已被制備，并廣泛應(yīng)用于魚類免疫學(xué)研究.本試驗(yàn)制備出“新吉富”羅非魚IgM McAb，并初步應(yīng)用于羅非魚免疫血清的特異性抗體檢測(cè)與疫苗免疫效果分析，在后期的工作中，有必要應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡、B細(xì)胞定位等方法，明確所制備的McAb針對(duì)的羅非魚IgM抗原決定簇和表位結(jié)構(gòu)，以進(jìn)一步應(yīng)用于羅非魚IgM結(jié)構(gòu)和功能的分析，以及羅非魚病原診斷、免疫機(jī)理研究.

應(yīng)用本試驗(yàn)制備的羅非魚IgM McAb檢測(cè)IgM的靈敏度，可以用IgM直接包被酶標(biāo)板的間接ELISA方法檢測(cè)，也可以用IgM多克隆抗體捕獲IgM，再進(jìn)行間接ELISA檢測(cè).本試驗(yàn)使用的方法可以避免在IgM直接包被的過程中，抗原包被不完全而造成檢測(cè)數(shù)據(jù)誤差的狀況；同時(shí)在羅非魚血清樣品的特異性抗體檢測(cè)中，由于待測(cè)血清未經(jīng)過純化，成分中除了IgM，還有其他復(fù)雜的細(xì)胞因子成分，使用捕獲ELISA檢測(cè)方法可有效地排除血清中的非特異性成分對(duì)檢測(cè)過程的干擾.

為了尋找合適的免疫途徑，本試驗(yàn)應(yīng)用捕獲ELISA檢測(cè)方法對(duì)用不同方式免疫的受免疫羅非魚的抗體水平進(jìn)行了評(píng)估.結(jié)果表明，采用注射、浸泡2種免疫方式的羅非魚在浸泡加強(qiáng)免疫后，血清特異性抗體的效價(jià)不僅在高水平上維持的時(shí)間長(zhǎng)，且第28～42天的特異性抗體表達(dá)水平均比單獨(dú)采用注射免疫的高，能讓受免羅非魚魚體保持更持久的抗體水平，有利于延長(zhǎng)疫苗免疫的保護(hù)期并提高保護(hù)率.

致謝：感謝福建省淡水水產(chǎn)研究所張新艷高級(jí)工程師、鄭磊工程師在本研究中給予的幫助和支持.

[1] HANSEN J D, LANDIS E D, PHILLIPS R B. Discovery of a uniqueIg heavy-chain isotype (IgT) in rainbow trout: Implicationsfor a distinctive B cell developmental pathway in teleost [J]. Proc Nail Acad Sci USA, 2005,102:6 919-6 924.

[2] WILSON M R, WART G W. Fish immunoglobulin and the genesthat encode them [J]. Ann Rev Fish Dis, 1992,2:201-221.

[3] 吳鐵軍,梁萬文.羅非魚免疫球蛋白(IgM)重鏈基因全長(zhǎng)cDNA序列分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,40(8):1 084-1 087.

[4] 黃婷,張彬,陳明,等. 羅非魚和斑點(diǎn)叉尾鮰血清IgM的純化及兔抗血清的制備[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,41(12):1 339-1 442.

[5] 徐志凱.實(shí)用單克隆抗體技術(shù)[M].西安:陜西科學(xué)技術(shù)出版社,1992:27-102.

[6] 郝貴杰,沈錦玉,徐洋,等.草魚免疫球蛋白單克隆抗體的制備及其特性鑒定[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2009,25(9):808-810.

[7] 丁煒東,曹麗萍,曹哲明.草魚血清IgM蛋白的純化及抗血清的制備[J].水生生物學(xué)報(bào),2010,34(1):164-169.

[8] 林天龍,陳強(qiáng),龔暉,等.歐洲鰻免疫球蛋白單克隆抗體的制備與特性[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2001,25(6):532-537.

[9] 李強(qiáng).牙鲆免疫球蛋白單克隆抗體的研制及其在牙鲆淋巴囊腫病研究中的應(yīng)用[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué),2007.

[10] 沈錦玉,THOMPSON K D, ADAMS A,等.銀鯽IgM的純化及其單克隆抗體的制備[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2006,30(3):421-424.

[11] 鄢慶枇,韓一凡,高天翔,等.大黃魚血清IgM純化及其兔抗血清的制備[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2006,13(3):475-479.

[12] 劉振興,張殿昌,蘇天鳳,等.黃鰭棘鯛血清IgM的純化及兔抗血清的制備[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2008,15(1):129-135.

[13] 張靜,安利國(guó),張福淼,等.黃鱔血清、腸黏液免疫球蛋白的分離純化及部分特性分析[J].水產(chǎn)科學(xué),2007,26(3):130-133.

[14] 張福淼,楊桂文,李國(guó)田,等.鱸血清免疫球蛋白分離純化及部分特性分析[J].動(dòng)物學(xué)雜志,2004,39(5):9-12.

[15] 鄭磊,馬振寧,吳斌,等.美洲黑石斑魚血清IgM純化及其兔抗血清部分特性[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2011,20(4):421-424.

[16] 林樹柱,李萬波,劉先菊.烏鱧血清免疫球蛋白IgM的分離純化及其兔抗血清的制備[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(11):648-651.

[17] 張小萍,梁筱燕,張慶璜,等.尼羅羅非魚血清免疫球蛋白單克隆抗體制備及鑒定[J].免疫學(xué)雜志,2013,29(8):663-667.

[18] 馮娟,胡超群.抗紫紅笛鯛血清免疫球蛋白單克隆抗體的制備[J].熱帶海洋學(xué)報(bào),2002,21(4):14-21.

[19] 郝貴杰,潘曉藝,徐洋,等.奧尼羅非魚免疫球蛋白單克隆抗體的制備及其初步應(yīng)用[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2013,28(1):9-11.

(責(zé)任編輯:施曉棠)

Preparation of McAbs against immunoglobulinin fromOreochromisniloticusand its application in immune effect analysis

WU Bin

(Fujian Provincial Fishery Technical Extention Center/Freshwater Fisheries Research Institute of Fujian, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To prepare effective monoclonal antibody (McAb) against serum immunoglobulin (Ig) of tilapia, antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was conducted, and Ig of healthyOreochromisniloticuswas purified by protein A affinity chromatography to characterize its immunological feature. Then purified IgM was used as antigen to immunize Balb/c mice. SDS-PAGE analysis showed that molecular weight of tilapia Ig heavy chain and light chain was 75-78 and 23-25 ku, respectively. Three hybridomas strains secreting monoclonal antibodies (McAb) were obtained and named 2H5, 2D4, and 2B11, with the common isotype being IgM. And titers in the ascites of Balb/c mice were 1.0×10-5, 1.0×10-4, 1.0×10-5, respectively. Sensitivities of McAb against tilapia IgM was high, with detection limits being 31.25, 125.00, and 62.50 ng, respectively. Furthermore, MAC-ELISA showed that specific antibody was detected within tilapia immuned byStreptococcusagalaciateinactivated vaccine.

Oreochromisniloticus; immunoglobulin; monoclonal antibody; ELISA

2016-06-22

2017-01-16

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-49)；福建省公益類科研院所專項(xiàng)(2014R1002-3)；福建省海洋與漁業(yè)廳重點(diǎn)項(xiàng)目(閩海漁合同[2010]2-12號(hào)).

吳斌(1978-)，男，高級(jí)工程師，碩士.研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物病害分子免疫學(xué).Email：wubinfire@126.com.

S948

A

1671-5470(2017)02-0187-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.02.011