楊沛霖，呂 灝，趙冬冬，林樹梅

(沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽 110866)

胰腺胚胎發(fā)育調控機制及胰腺干細胞誘導分化方法研究進展

楊沛霖，呂 灝，趙冬冬，林樹梅*

(沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽 110866)

近年來糖尿病發(fā)病率逐年增加，研究如何控制和預防糖尿病成為世界性課題。傳統(tǒng)的治療方法不僅不能從根本上解決高血糖也不能有效地控制糖尿病并發(fā)癥。胰島移植技術的出現為臨床治療糖尿病提供了新的途徑，但是胰島數量的不足和胰島移植出現的免疫排斥反應制約了胰島移植技術的發(fā)展。因此，通過自體胰腺干細胞分化修復胰腺組織從而達到平穩(wěn)血糖和控制糖尿病并發(fā)癥成為一種新的技術手段。論文綜述胰腺胚胎發(fā)育調控機制、胰腺干細胞的定位及體外誘導分化方法等方面的研究進展。

糖尿病；胰島；胰腺干細胞；體外誘導

隨著生活水平的不斷提高，營養(yǎng)代謝類疾病的發(fā)病率逐年升高，特別是糖尿病的發(fā)病率持續(xù)升高且愈發(fā)年輕化，這種情況同樣發(fā)生在寵物身上。因此，預防糖尿病和平穩(wěn)血糖的研究對人類和寵物都有重要的意義。

糖尿病有兩種類型，一種為胰島素依賴型糖尿病，即Ⅰ型糖尿病，另一種為非依賴型糖尿病，即Ⅱ型糖尿病[1]。Ⅰ型糖尿病發(fā)病的原因在于分泌胰島素的胰島β細胞由于自身免疫造成選擇性的不可逆的損傷。Ⅱ型糖尿病發(fā)病的主要原因在于高脂高糖飲食及缺乏運動等形成的胰島素敏感性降低(胰島素抵抗)，由此造成了胰島β細胞應激，繼而引發(fā)β細胞凋亡及胰島β細胞分泌胰島素功能下降[2]。Ⅰ型糖尿病患者體內β細胞幾乎全部被破壞，Ⅱ型糖尿病β細胞的破壞率大約40%～60%[3]。傳統(tǒng)糖尿病的治療方法主要有兩種，一種是注射胰島素，另一種是通過口服藥物刺激胰島β細胞加大胰島素的分泌量。雖然兩種方法能在一定程度上降低血糖，但是都不能從根本上治療糖尿病和抑制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，反而有可能會加大對殘存胰島β細胞的損傷，使病情加重。胰島移植被認為是治療糖尿病的有效途徑[4]，通過胰島移植可以取代已經受損的胰島β細胞，從而有效地降低血糖。因此，體外移植胰島細胞將成為一種臨床治愈糖尿病的新途徑。根據世界糖尿病聯合會統(tǒng)計顯示，使用胰島干細胞移植的方法治療糖尿病可能在全球范圍內影響到3億人[5]。

雖然胰島移植為根治糖尿病提供了希望，但是外源性胰島細胞的不足和免疫排斥等問題限制了這項技術的發(fā)展。但是，誘導多能干細胞(iPS)具有自我更新能力和分化潛能，其功能與胚胎干細胞(ES)類似，因此無需制造胚胎，理論上從任何組織的成體細胞都可制造出具有干細胞功能的細胞，在科研工作中避免了胚胎研究所面臨的倫理學問題[6]。因此，干細胞分化成具有分泌胰島素功能的細胞，用于代替已損傷的胰島β細胞治療糖尿病具有很大的發(fā)展前景。使用干細胞的方法治療糖尿病具有吸引力，因為這兩種類型糖尿病的發(fā)展都是基于胰島β細胞所分泌胰島素的缺乏，使用自體干細胞誘導分化的胰島β細胞代替療法可以有望從根本上逆轉糖尿病。本文將從胰腺胚胎發(fā)育調控機制和胰腺干細胞誘導分化方法，對相關研究技術的進展進行介紹。

1 胰腺干細胞

干細胞具有自我復制的能力，以及具有多向分化潛力的一種早期未分化的細胞[7]。干細胞在特定條件之下，可分化為各種不同的功能性細胞，繼而分化成多種不同的細胞與組織器官。干細胞按照分化階段的不同，大致可以分為2種，即胚胎干細胞與成體干細胞。胚胎干細胞可以分化成體內的任何一種細胞，包括3個胚層的所有細胞[8]。成體干細胞與胚胎干細胞相比具有較低的增殖、分化和組織再生能力。胰腺干細胞一般是指未達終末分化狀態(tài),能產生胰島組織或起源于胰島,具有自我更新復制能力的未定型細胞。

2 胰腺干細胞的存在位置

許多研究表明β細胞前體細胞主要存在于胰腺導管。導管細胞分化成的胰島緩慢替代更新胰島細胞。研究表明，Ⅰ型糖尿病和部分切除胰腺的嚙齒類動物，胰島樣聚合體產生于導管組織豐富的人的胰腺組織和小鼠胰腺導管，這些胰島樣聚合物在葡萄糖刺激后產生釋放胰島素和表達胰島標志蛋白[9]。據報道，異位基因Ngn3的表達是人體胰腺內分泌發(fā)育的關鍵信號，將Ngn3定向破壞之后，將出現所有胰腺內分泌細胞的缺乏，且有試驗通過檢測Ngn-3的表達結果證明胰腺導管上皮細胞和胰島細胞可以轉變?yōu)橐葝u素表達細胞[10]。另外，通過體外試驗結果表明表皮細胞生長因子和胃泌素結合可以誘導胰腺導管內的導管細胞和腺泡細胞分化成胰島β細胞，使功能性胰島β細胞數量大量增加[11]。由此可知，胰腺干細胞存在于胰腺的導管、腺泡細胞和成熟的胰島中。

3 胰腺的胚胎發(fā)育及調控

胰腺在發(fā)生上起源于內胚層，是由內分泌腺和外分泌腺組成的器官，其中外分泌腺80%由導管和腺泡細胞組成。外分泌腺腺泡細胞分泌各種消化酶進入消化道，參與營養(yǎng)物質的消化吸收,而內分泌細胞分泌各種激素進入血液循環(huán)，調節(jié)體內血糖和營養(yǎng)物質的代謝平衡。胰島細胞有5種類型，即alpha、beta、delta、epsilon和PP細胞，它們分別合成分泌胰高血糖素、胰島素、生長抑制素、胃饑餓素和胰多肽[12]。

胰腺最初在前腸和中腸交界處由原始內胚層以出芽的方式開始發(fā)育。胰腺組織發(fā)育可以分為兩個階段，即其一是確定和構成內胚層，其二是胰腺上皮細胞和內分泌/外分泌細胞的定向分化[13]。胰腺所有的細胞類型都起源于前腸的十二指腸上部區(qū)域的內胚層細胞[14]。胰腺由腺泡細胞、導管上皮細胞和胰島細胞等胰腺前體細胞從定型內胚層開始發(fā)育[13]。定型內胚層在原腸胚形成期間出現，這個過程開始時外胚層細胞受到Wnt和Nodal信號介導，經歷上皮細胞向間質細胞的轉變從而形成原條。隨后，為了驅使定型內胚層形成，原條最前端的區(qū)域暴露在高濃度的Nodal信號因子中，與此同時，原腸形成。在原腸管中形成內胚層褶皺，并分為3個區(qū)域，即前腸、中腸和后腸，這些區(qū)域都是通過附近的組織分泌的生長因子誘導形成的。前腸末端腹側近肝憩室尾緣的內胚層上皮增生向外突出形成腹胰芽，同時其對側上皮也發(fā)生增生形成背胰芽[15]。這種模式使不同組織肉芽沿原始腸管發(fā)育。2個胰腺組織肉芽中的同源盒表達基因PDX-1在前腸發(fā)育后期表達。PDX-1基因表達的細胞的分化使腸管背側和腹側外翻形成2個上皮組織的分支[16]。轉錄因子胰十二指腸同源異形盒基因 (pancreas duodenal homeobox-1，PDX-1)和胰腺特異性轉錄因子(pancreas specific transcription factor，Ptfla)誘導胰腺生成[17]。PDX-1是一種包含同源結構域的轉錄因子，在人類胚胎發(fā)育的第5周和小鼠胰腺前體細胞發(fā)育的第8.5周出現[18]。導致胰腺發(fā)育不全的試驗證明，胰腺在發(fā)育過程中PDX-1是最重要的轉錄因子之一[19]。研究顯示PDX-1不僅是胰腺前體細胞發(fā)育初期的有效標記物，而且對胰腺干細胞分化為分泌胰島素的β細胞也是至關重要的；Ptf1a失活的胰腺前體細胞可以轉化成小腸上皮前體細胞；轉錄基因表達產物PDX-1作為Ptf1a的啟動子在小鼠PDX-1抑制試驗中顯示其能恢復胰腺組織發(fā)育[20]。由此可以看出，PDX-1和Ptf1a對胰腺的發(fā)育至關重要。

在胰腺胚胎發(fā)育階段，一些信號分子起到了關鍵的調控作用，其中背動脈和脊索分泌信號分子維甲酸影響背芽發(fā)育，心臟間質和側板中胚層分泌信號分子骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bmp)影響腹芽發(fā)育。一些胰腺發(fā)育功能缺失的動物模型顯示維甲酸信號對胰腺形成是必不可少的[21]。此外，小鼠胚胎試驗證明在腹芽上的Bmp可以抑制PDX-1的表達從而抑制胰腺的發(fā)育，在雞胚試驗中表明脊索音猬因子(Shh)的抑制作用對胰腺的發(fā)育非常重要[22]。最終腸管扭轉將腹芽和背芽融合在一起形成胰腺原基，并且擴散到周圍間質中。腹胰芽和背胰芽不斷地增生和分支，分別形成獨立的內外分泌腺組織，腹胰和背胰相互融合形成胰腺。胰腺間質通過分泌FGF10等因子為胰腺上皮細胞的增殖和分化提供一個寬松環(huán)境，并且保持Notch的活性。隨后，大量的成體干細胞因子PDX-1、Nkx6-1和Ptf1a的表達證明形成了內分泌和外分泌細胞。PDX-1和Nkx6-1二者在外分泌腺導管的祖細胞中表達，Ptf1a為腺泡細胞表達標志物[23]。在胚胎期，導管細胞、外分泌腺泡細胞和內分泌胰島細胞的分化是從原始導管樣細胞開始的。在發(fā)育過程中，胰芽反復分支，形成各級導管及其末端的腺泡，一些小導管的管壁上皮細胞游離進入間充質，分化為胰島。胰島細胞來源于胰腺導管上皮的干細胞，而這些干細胞能夠分化成為胰島內分泌細胞。胚胎期胰腺再生來自于未分化的祖細胞或者干細胞，在出生后階段，胰島內分泌細胞團的每一次擴增都必須通過已存在胰島細胞有限的增生，但是腺泡和導管細胞仍然保有顯著的增生活性，保證細胞的更新和生長，在特定條件下，也能轉化為分泌胰島素的β細胞。

4 胰腺干細胞的體外誘導分化

早期胰腺干細胞體外誘導分化的方法主要由Lumelsy N等提出：①將胚胎干細胞誘導形成胚狀體(embryoid bodies，EBs)；②將EBs置于添加了ITSFn(胰島素、轉鐵蛋白、硒鹽、纖維連接蛋白)的無血清培養(yǎng)基中生成巢蛋白陽性(nestin+)細胞；③將這些nestin+細胞置于添加了分裂素、B27和bFGF的N2無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)；④撤去分裂素終止細胞分裂，加入尼克酰胺促進細胞分化；⑤最終得到的細胞表達胰島素及其他一些胰腺內分泌激素，并且形成與正常胰島類似的三維細胞團結構等五個階段誘導小鼠胚胎細胞分化為具有分泌胰島素功能的細胞[27]。但是有研究證實Lumelsy N的五階段誘導方法并不成熟，這種方法培養(yǎng)出的細胞產量不高只有10%～30%的細胞為胰島素陽性。Bose B等[25]將Lumelsky的五步法最后一步加以改良，誘導出的細胞有65%分泌胰島素，而且移植后可以改善糖尿病鼠長達3個月的血糖水平。

目前，誘導胰腺干細胞分化成功能性的胰島素分泌細胞的方法有化學誘導法和轉基因誘導法?；瘜W誘導法通常是通過添加堿性成纖維細胞生長因子、激活素A、β細胞素、尼克酰胺及胰高血糖素樣肽1等生長因子誘導胰腺干細胞分化成功能性胰島素分泌細胞。近年出現的三維立體的培養(yǎng)方法對細胞的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，大幅度提高了胰腺干細胞的誘導率[26]。Shih H P等[27]將含有基質膠(matrigel)形成的立體培養(yǎng)基中加入小鼠未成熟的胚胎胰腺芽，培養(yǎng)3 d后發(fā)現胰芽明顯膨脹并且發(fā)育出分支，為形成誘導性多能干細胞提供了新的方法和思路。Khorsandi L等[28]利用3D的培養(yǎng)方式對大鼠骨髓間充質干細胞進行誘導，3D培養(yǎng)方式誘導所得的胰島素分泌細胞與2D的培養(yǎng)方式相比高3倍～5倍，并且對葡萄糖刺激產生反應。

基因誘導方法是利用基因工程技術將與β細胞發(fā)育和功能相關的基因導入干細胞，使其定向誘導分化的方法。有人嘗試通過體外超表達PDX-1、NGN3和MafA誘導所得到的細胞團，與β細胞形態(tài)相似且表達β細胞的分子標記，也可以逆轉糖尿病小鼠的高血糖狀況[26]。

綜上所述，胰腺干細胞是一種能分化成胰腺組織的成體干細胞，它主要存在于胰腺的導管上皮細胞、腺泡細胞和成熟的胰島中，其標志物主要有PDX-1、Ptf1a、Nkx6-1和nestin等。胰腺干細胞具有分化成功能性胰腺組織的能力，移植由胰腺干細胞誘導分化的胰島細胞，有望修復受損胰腺組織，恢復胰島細胞的功能。

雖然誘導胰腺干細胞修復胰腺和胰島具有很大的潛力，但在對胰腺干細胞研究的過程中也出現了很多問題，例如，現有研究表明成熟的胰腺組織中胰島β細胞是通過自身復制增殖而不是來自于胰腺干細胞的分化。因此，對胰腺干細胞的分化還需進行深入研究，如在胰島β細胞功能降低的情況下，如何誘導胰腺干細胞分化為成熟的胰島β細胞將是未來需要解決的關鍵問題，以及明確胰腺干細胞的分化及分化后可能帶來的不良反應，以確保干細胞技術的安全性。

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Progress on Regulation Mechanism of Pancreatic Embryonic Development and Differentiation of Stem Cells

YANG Pei-lin,Lü Hao，ZHAO Dong-dong，LIN Shu-mei

(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang,Liaoning,110866,China)

At present,the incidence of diabetes has increased year by year,how to control and prevent diabetes is becoming a worldwide subject.The traditional treatment method can not only solve the problem of hyperglycaemia,but also can not control the diabetic complications effectively.Although the technologies of islet transplantation provide a new way,the deficiency of the islets and the immune rejection in islet transplantation have restricted the development of islet transplantation.Therefore,it has become a new technique to repair the pancreatic tissue by the differentiation of pancreatic stem cells(PSCs) and achieve stable blood glucose and control the diabetic complications.In this paper,the development regulation mechanism of pancreatic embryos,the localization of pancreatic stem cells and the methods of inducing differentitationinvitrowere reviewed.

Diabetes; hyperglycemia; pancreatic stem cell; inductioninvitro

2016-08-22

國家自然科學基金項目(31572481)

楊沛霖(1990-)，男，遼寧鐵嶺人，碩士研究生，主要從事基礎獸醫(yī)學研究。*通訊作者

R587.1；S852.1

A

1007-5038(2017)02-0098-04