侯 旭, 張國慶, 胡 曉, 閆立春, 劉悅萍

北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院, 北京 102206

果樹內(nèi)生生防菌研究進(jìn)展

侯 旭, 張國慶, 胡 曉, 閆立春, 劉悅萍*

北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院, 北京 102206

果樹內(nèi)生菌(endophyte)是指全生活史或生活史中的某一階段寄生于果樹組織中，并對果樹本身不造成明顯可見病害及功能改變的微生物，由于果樹內(nèi)生菌生態(tài)位的特殊性，其相關(guān)研究較少。概述了常見果樹內(nèi)生菌分離純化的方法、有生防作用內(nèi)生菌的篩選和分類鑒定，以及常見的有生防作用的果樹內(nèi)生菌的應(yīng)用及作用機(jī)理。最后通過與一般生防菌進(jìn)行比較，分析了使用果樹內(nèi)生菌作為生防菌進(jìn)行生物防治的諸項(xiàng)優(yōu)勢以及存在的問題，并對其生物防治方面的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

果樹；內(nèi)生菌；生物防治；發(fā)展現(xiàn)狀

果樹內(nèi)生菌(endophyte)是指全生活史或生活史中的某一階段寄生于果樹組織中，并對果樹本身不造成明顯可見病害及功能改變的微生物[1～3]。果樹內(nèi)生菌主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌，其中有些內(nèi)生菌能夠?yàn)樗拗髦参锾峁┍Ｗo(hù)，產(chǎn)生諸如生物堿、水解酶、抗生素類物質(zhì)或其他的代謝產(chǎn)物[3]，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性、直接殺滅病原菌或與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)，以此直接或間接地達(dá)到提高果樹免疫能力，起到生物防治效果。

現(xiàn)已有許多生防菌的殺菌劑被應(yīng)用于果樹病害防治中，并取得了顯著的效果[4]。除此之外，果樹內(nèi)生菌還能夠通過其胞內(nèi)或胞外釋放的一些酶或特定化學(xué)物質(zhì)將果樹的次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為其他活性物質(zhì)為己所用[5,6]，而果樹也可以利用這種作用提高本身的次生代謝產(chǎn)物含量或補(bǔ)充自身缺少的營養(yǎng)，促進(jìn)生長[7～9]，這樣二者就能各取所需，互惠共生。本文介紹了常見果樹內(nèi)生生防菌的研究方法，以及果樹內(nèi)生生防菌的多樣性，同時綜述了果樹內(nèi)生生防菌在果樹病害防治中的應(yīng)用及其優(yōu)勢和存在的問題，以期為果樹內(nèi)生生防菌的應(yīng)用研究提供參考。

1 果樹內(nèi)生生防菌的研究方法

1.1 果樹內(nèi)生生防菌的分離與純化

通過表面滅菌排除來自周圍環(huán)境的雜菌的影響，滅菌徹底與否將會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的分離結(jié)果[10]。目前常見的3種表面滅菌的方法分別是：二氧化氯法、次氯酸鈉法以及升汞法[11,12]。姜國銀等[13]試驗(yàn)證明，通過二氧化氯消毒法獲得的內(nèi)生細(xì)菌種類最多，次氯酸鈉消毒法處理后內(nèi)生真菌的出菌率較高，但得到的真菌種類少，而升汞消毒法所得的內(nèi)生菌豐度最低。此外，分離的時間、部位以及果樹的種類等，都對分離的內(nèi)生菌種類和數(shù)量有影響[14]。

表面滅菌后，一般通過切取樣品器官組織或榨取樣品組織汁液稀釋的方法分離內(nèi)生菌，使用平板劃線等方法純化內(nèi)生菌，之后接種在試管斜面培養(yǎng)基上等待進(jìn)一步的篩選[15]。

1.2 果樹內(nèi)生生防菌的篩選

常用的在人工環(huán)境下篩選有生物防治作用的果樹內(nèi)生菌的方法有抑菌圈法和平板對峙法，但在實(shí)驗(yàn)室條件下得到的果樹生防內(nèi)生菌是在排除了許多外環(huán)境因素影響下培養(yǎng)的，所以生防菌在實(shí)驗(yàn)中對病原菌的抑制能力與其在宿主中控制由該病原菌引發(fā)病害的能力并不一定呈正相關(guān)趨勢[16]。因此對于一種理想的生防內(nèi)生菌而言，以既要做到在宿主體內(nèi)有良好的定殖能力，又要能有效的抑制病原菌生長為最佳。郭堅(jiān)華等[17]采用抑菌圈-定殖力雙重測定，篩選出了1株既能在植物根部很好的定殖，又有良好抑制青枯病效果的內(nèi)生細(xì)菌。Ho等[18]使用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)檢測了內(nèi)生細(xì)菌在香蕉中的定殖能力，結(jié)合抑菌圈法得到的結(jié)果，篩選出了能夠定殖在香蕉中防治香蕉萎蔫病的內(nèi)生生防細(xì)菌。

1.3 果樹內(nèi)生生防菌的分類鑒定

微生物的分類鑒定方法多樣，甚至已經(jīng)有了能夠進(jìn)行菌種鑒定的專業(yè)儀器。隨著科技的進(jìn)步，大量微生物的基因序列已被測定并保存于國際基因數(shù)據(jù)庫，保守序列測定法成為現(xiàn)在最為常見的微生物初步鑒定方法，通過對未知細(xì)菌、放線菌的16S rDNA序列以及未知真菌的ITS序列進(jìn)行測定和比較分析可以快速有效地分類鑒定到屬。如需要精確鑒定到種，則需要進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)。除此之外還可以使用BIOLOG或GENⅢ精確鑒定。為解決分離豐度低，無法反應(yīng)真實(shí)環(huán)境微生物分布情況等問題，除了碳源生化反應(yīng)測試這種快速鑒定法，還可以采用PLFA譜圖分析法、FISH技術(shù)[19～21]以及基因芯片技術(shù)[22]等。

此外，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)能夠通過培養(yǎng)得到的微生物，其種類只占環(huán)境所有微生物的0.1%～10%，所以還需非培養(yǎng)法來檢測鑒定無法培養(yǎng)的微生物。通過這些分子生物學(xué)以及生理生化的方法鑒定內(nèi)生菌種類，研究其分布，既可定性又可定量，便捷精準(zhǔn)而且可靠[23]。

2 果樹內(nèi)生生防菌的多樣性

由于植物內(nèi)生菌生態(tài)位的特殊性，目前關(guān)于內(nèi)生菌的研究相對較少。近十幾年隨著科技的進(jìn)步，這種潛在的優(yōu)秀生物資源引起學(xué)者們的重視，研究表明內(nèi)生菌廣泛的存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等組織器官中。曹理想等[24]發(fā)現(xiàn)植物組織內(nèi)生菌數(shù)量呈現(xiàn)根>莖>葉的規(guī)律，這主要是由于內(nèi)生菌一般通過植物根部進(jìn)入宿主體內(nèi)[25]。

果樹內(nèi)生菌的特點(diǎn)是分布廣、種類多。而其種類、分布和定殖情況均因果樹的種類不同而表現(xiàn)出顯著的差異[26]。在這之中，果樹內(nèi)生細(xì)菌多以芽胞桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、腸桿菌屬(Eterobacter)以及土壤桿菌屬(Agrobacterium) 等土壤微生物種類為最常見的屬[27]；內(nèi)生真菌則多屬于核菌綱(Pyrenomyetes)、盤菌綱(Discomyetes)和腔菌綱(Lculoascomyetes)等子囊菌類(Ascomycetes)以及菌根真菌(Mycorrhiza)等，其中分布最廣泛的幾個屬是：半殼霉屬(Leptostroma)、擬隱孢霉屬(Cryptosporipsis)、擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)以及葉點(diǎn)霉屬(Phyllosticta)[28,29]；而大多數(shù)內(nèi)生放線菌均屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)。

值得注意的是，使用同一種植物作為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用不同的表面消毒方法，或選擇該植物不同的組織部位進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)時會獲得不同種屬的菌株，這也說明了果樹內(nèi)生菌的種類繁多[13,30]，分離條件以及方法還有待研究者不斷改進(jìn)，最終進(jìn)一步發(fā)掘其潛在的利用價值。

3 果樹內(nèi)生生防菌的應(yīng)用

應(yīng)用果樹內(nèi)部有生防作用的菌來防治果樹自身的病害，有效果顯著、有效作用時間長等優(yōu)勢，下面介紹幾種主要的內(nèi)生生防菌及其防治植物病害機(jī)理、效果的相關(guān)研究。

芽孢桿菌(Bacillus)是幾種常見的有生防作用的內(nèi)生細(xì)菌之一[31]，其主要生防機(jī)理是競爭作用、抗生作用和蛋白酶作用，其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)主要有幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、脂肽以及吡咯菌素等[32]。劉旭等[33]研究表明，從葡萄葉片中分離得到一株內(nèi)生細(xì)菌，該菌對葡萄霜霉病抑制率高達(dá)96.23%，有較高的抑制效果，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，其在代謝過程中可產(chǎn)生諸如抗菌蛋白類的抑菌活性物質(zhì)，這種抑菌方式主要是通過介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來抑制病害發(fā)生的[34]。另一種具有較廣泛生防作用的內(nèi)生細(xì)菌是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。馬艷等[35]研究表明，自西瓜中分離得到的內(nèi)生枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其對西瓜枯萎病菌等多種病原菌都具有強(qiáng)烈的拮抗作用，而且防治效果、定殖效果穩(wěn)定。劉起麗等[36]自柑橘表皮中分離純化得到5株內(nèi)生細(xì)菌，其中H-3對柑橘青霉病的病原菌有很強(qiáng)的拮抗作用，抑菌圈的直徑達(dá)15.3 mm，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。崔娜等[37]從山西婆婆棗葉片中分離得到了1株枯草芽孢桿菌，對棗縮果病病原菌——細(xì)交鏈孢菌(Alternaria)和莖點(diǎn)霉菌(Allantophmoidescarotae)均有抑制作用。卜春亞等[38]自草莓的根中分離篩選到一株對草莓根腐病菌有較好拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

木霉屬(Trichoderma)是常見的有生防作用的真菌，研究發(fā)現(xiàn)木霉能夠生長于存在化學(xué)農(nóng)藥或其他生物有毒代謝產(chǎn)物的環(huán)境里，且能夠通過類似于菌根真菌的生長方式定殖于植物體中，其主要的生防機(jī)理是競爭作用、抗生作用、溶菌作用、重寄生作用以及不同防治作用方式的協(xié)同拮抗。此外Harman等[39]發(fā)現(xiàn)，木霉菌可以產(chǎn)生能夠促進(jìn)植物生長以及誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)，提高其免疫能力的代謝產(chǎn)物。孫勇等[40]自健康植物組織中分離得到6株生防內(nèi)生真菌，其中多孢木霉對蘋果輪紋菌孢子萌發(fā)的抑制率為62.89%。燕金宜等[41]自獼猴桃葉片及莖段中分離得到22株內(nèi)生真菌，其中對獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病病原菌表現(xiàn)為高敏的內(nèi)生真菌為海洋黑孢屬(Mgmspora)菌株J-2，其抑菌圈達(dá)15 mm。

鏈霉菌屬(Streptomyces)是植物內(nèi)生中最常見的有生物防治作用的放線菌，也是抗生素的重要產(chǎn)生菌，其主要生防機(jī)理有競爭作用以及重寄生作用等。此外，因?yàn)閹锥≠|(zhì)廣泛存在于植物病原真菌的細(xì)胞壁中，能夠高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的放線菌，對許多植物病原真菌均有很強(qiáng)的抑制作用[42]。胡一鳳等[43]采用組織勻漿法，自香蕉果實(shí)中分離得到1株鏈霉菌(Streptomycesphaeoluteichromatogennes)對尖孢鐮刀菌菌絲生長抑制作用很強(qiáng)，抑制率可達(dá)83.21%，其發(fā)酵液對香蕉枯萎病的防效可達(dá)82.46%，且這種果樹內(nèi)生鏈霉菌在香蕉中的定殖能力強(qiáng)于之前發(fā)現(xiàn)的生防菌。王夢疑等[44]亦在香蕉中分離得到1株鏈霉菌(041)，其發(fā)酵濾液對香蕉枯萎病的抑菌寬度最大為28.7 mm，抑菌率最高為98%。

4 果樹內(nèi)生生防菌治理果樹病害的優(yōu)勢

通過一般渠道(如自土壤中分離篩選得到的菌種、已知的具有生防作用的菌種或從不同植物中找到的內(nèi)生菌等)得到的生防菌，應(yīng)用其防治某種特定的果樹病害時，往往存在著防治效果不穩(wěn)定的問題，這是由于來自果樹之外的生防菌因?yàn)榄h(huán)境的變化或果樹自身免疫而削弱了生防能力[45]。而相對于一般生防菌來說，從果樹自身尋找得到的有生防作用的果樹內(nèi)生菌優(yōu)勢就在于不但具有抗菌活性，同時更易被果樹本身的內(nèi)環(huán)境系統(tǒng)所接受[46]，通過克服定殖障礙，使得生物防治能夠持久的保持效果。其原因主要是分離得到的有生防作用的果樹內(nèi)生菌原本就來自果樹組織內(nèi)部，且通過長久的協(xié)同進(jìn)化過程與果樹建立了穩(wěn)定、復(fù)雜的生態(tài)關(guān)系[47]，果樹中的許多物質(zhì)都會參與其生長以及發(fā)揮拮抗作用，所以外來的生防菌或來自其他植物的內(nèi)生菌，在被應(yīng)用到果樹上時往往不被果樹內(nèi)環(huán)境所接受，出現(xiàn)許多制約因素。

此外，針對由果樹內(nèi)生生防菌衍生出的生防產(chǎn)品在應(yīng)用于果樹后，是否存在使果實(shí)含有對人和動物有潛在毒性物質(zhì)的問題，有研究表明，從植物源獲得的大多數(shù)多肽抗生素對動植物細(xì)胞均無毒性[48]。生物的內(nèi)環(huán)境維持穩(wěn)態(tài)，內(nèi)生菌在果樹組織中生存的同時，隨著果樹繼代傳承[49]，歷經(jīng)了長久的協(xié)同進(jìn)化后，所產(chǎn)生的抗生素必然已經(jīng)降低了毒性，否則宿主就會受其毒害最終被自然所淘汰。因此植物內(nèi)環(huán)境為那些內(nèi)生菌產(chǎn)生的，對高等生物具有毒性的代謝產(chǎn)物減少毒性充當(dāng)了選擇系統(tǒng)。應(yīng)用果樹內(nèi)生菌防治果樹病害對其他有益生物以及非防治對象不會產(chǎn)生傷害[4]，這既有利于我們保護(hù)生物多樣性，又具備效果好、花費(fèi)少和有效作用時間長的優(yōu)點(diǎn)，果樹內(nèi)生菌作為生物防治資源優(yōu)勢明顯，潛力巨大[50，51]。

5 果樹內(nèi)生菌進(jìn)行生物防治存在的問題及對策

5.1 存在的問題

雖然果樹內(nèi)生生防菌相對于一般生防菌來說具有很大的天然優(yōu)勢，不存在自然條件下定殖能力弱的問題，但也都是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室的穩(wěn)定環(huán)境篩選培養(yǎng)出的，所以出現(xiàn)在一般生防菌上的問題也可能出現(xiàn)在有生防作用的果樹內(nèi)生菌上，例如防效穩(wěn)定性的問題[52]。目前生防菌在應(yīng)用時多采用活菌制劑的形式，這樣就必然受到溫度、濕度和土壤pH等外界因素變化的影響，環(huán)境的變動對生防菌的防治效果影響很大；另外也存在菌株抗藥能力問題，在實(shí)驗(yàn)室的條件下，有些內(nèi)生菌的拮抗效果不錯，而應(yīng)用在田間時，卻由于果樹中殘留的農(nóng)藥或農(nóng)民施用的農(nóng)藥，使得其在果樹中種群的數(shù)量迅速下降導(dǎo)致無法形成足量的生物群體，達(dá)不到預(yù)期的生防效果[53]。

5.2 對策

為解決果樹內(nèi)生生防菌在防治果樹病害中可能存在的問題，目前的主要對策有：在果樹內(nèi)環(huán)境中加入能夠促進(jìn)內(nèi)生生防菌種群數(shù)量增加的物質(zhì)，以此來幫助生防菌在果樹內(nèi)環(huán)境中建立優(yōu)勢；在果樹內(nèi)環(huán)境中加入能誘導(dǎo)內(nèi)生生防菌產(chǎn)生抗菌素的物質(zhì)，在不破壞植物內(nèi)環(huán)境菌種豐度的前提下抑制病原菌的生長；利用誘變育種、原生質(zhì)體融合及轉(zhuǎn)化等技術(shù)，對有生防作用的果樹內(nèi)生菌種進(jìn)行改良，使其更加高效，耐藥性更強(qiáng)；利用基因工程，將果樹內(nèi)生生防菌的抗性基因轉(zhuǎn)入到果樹中，再經(jīng)過多代的選擇，獲得穩(wěn)定遺傳的抗病果樹[53]。

6 展望

盡管人們在果樹內(nèi)生有益菌的種類、代謝產(chǎn)物、生態(tài)分布以及同宿主的互作關(guān)系等方面已經(jīng)做了一些工作，但研究還并不深入[1,54]。針對有耐藥性的病原菌的出現(xiàn)，獲得更多新型、防效顯著的抗菌物質(zhì)的篩選源十分必要。Strobel等[30]發(fā)現(xiàn)，分離得到的植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的51%的生物活性物質(zhì)是未知的，而來源于土壤微生物的僅有38%，即由內(nèi)生菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物往往是新穎未知的，這使得植物內(nèi)生菌的研究既具有理論研究的價值，又有多方面的應(yīng)用潛力[55]。以果樹內(nèi)生有益菌作為生防菌來防治果樹自身的病害，無疑將推動生物防治技術(shù)向前邁出有意義的一步，憑借著防治過程綠色安全、針對性強(qiáng)、高效率和無污染的優(yōu)勢，有生防作用的果樹內(nèi)生菌必將成為潛力巨大的生物防治新資源。

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Progress on Biocontrol Endophytes in Fruit Trees

HOU Xu, ZHANG Guoqing, HU Xiao, YAN Lichun, LIU Yueping*

CollegeofBiologicalScienceandEngineering,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China

Endophyte in fruit trees is a kind of microorganism which parasitizes in organization during the whole life or some stages, and no disease or functional changes to fruit itself. The research on endophytes of fruit trees was less because its special ecological niche. The paper mainly focused on the isolation, screening, identification and classification of endophytic in fruit trees. The application and functional mechanism of endophytes were also introduced. Through comparing antagonistic microorganism with antagonistic endophytes in fruit trees, the advantage and problem of endophytes application in biological control were discussed and the future development was prospected.

fruit trees; endophytes; biological control; research advances

2016-11-17; 接受日期：2016-12-09

北京市屬高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)與教師職業(yè)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(CIT&TCD201404100)資助。

侯旭，碩士研究生，研究方向?yàn)楣麡鋬?nèi)生菌生物防治。E-mail：13716541606m0@sina.cn。*通信作者：劉悅萍，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楣麑?shí)發(fā)育生理與分子生物學(xué)。E-mail：cauping@sina.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2017.02.12