白雪芹，楊瑞瑞，曾幼玲

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

不同引物對和退火溫度對鹽生植物鹽穗木內(nèi)參基因β-actin擴增效率的影響

白雪芹，楊瑞瑞，曾幼玲

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

【目的】以鹽生植物鹽穗木為材料，研究不同引物對和不同退火溫度對鹽穗木內(nèi)參基因β-actin擴增效率的影響?！痉椒ā吭O(shè)計擴增β-actin基因的兩對引物，標記為β-actin1和β-actin2，分別建立這兩對引物擴增鹽穗木β-actin基因和特異性引物擴增該物種的過氧化物酶基因POD(鹽響應(yīng)的代表性基因)，在不同退火溫度下的標準曲線和擴增曲線?！窘Y(jié)果】不論55還是58℃退火溫度，引物對β-actin1比引物對β-actin2有更好的擴增效率；在55℃退火溫度下，引物對β-actin1有更高的擴增效率。在這兩個退火溫度下，分別以β-actin1和β-actin2引物對擴增β-actin基因作為內(nèi)參，鹽穗木POD基因的相對表達水平具有一定的差異性?！窘Y(jié)論】引物和退火溫度會影響熒光定量PCR的擴增效率，進而會影響靶基因的相對表達水平。

鹽穗木；不同引物對；退火溫度；β-actin；擴增效率

0 引 言

【研究意義】鹽穗木 (Halostachyscaspica) 為藜科(Chenopodiaceae )多年生鹽生植物。廣泛生長于新疆極端鹽堿環(huán)境中。為了適應(yīng)高度的鹽漬化，其植株葉片高度肉質(zhì)化，是鹽土荒漠主要植物之一[1]。目前主要研究了鹽穗木耐鹽的生理指標和鹽相關(guān)基因的克隆及功能鑒定[2-5]。為準確反映受鹽脅迫的鹽穗木組織中各基因的表達模式，通過實時熒光定量PCR技術(shù)，利用常用的看家基因β-actin作為內(nèi)參基因，以不同的引物對和退火溫度探討鹽穗木β-actin擴增效率的影響，進而分析對靶基因相對表達水平的影響?！厩叭搜芯窟M展】傳統(tǒng)的核酸序列定量分析方法包括Southern雜交、斑點印跡、RNA酶保護分析、原位雜交等技術(shù)[6-7]，實時定量PCR技術(shù)檢測基因轉(zhuǎn)錄水平的表達狀況也是當前科學(xué)研究的重要手段，是近些年發(fā)展起來的研究基因表達水平差異的重要方法。它是1996年由美國Applied Biosystems公司發(fā)明[8]，該項技術(shù)的應(yīng)用使得PCR技術(shù)由定性到定量的飛躍。它具有靈敏性高，特異性強、快速準確等特點，但通常它也會受到一系列因素的影響，比如內(nèi)參基因的選擇，引物的擴增效率等。實時定量PCR技術(shù)檢測基因的表達分為絕對定量和相對定量兩種方法。目前常用相對定量2-ΔΔCt法，需要引入看家基因作為參照[9]?！颈狙芯壳腥朦c】β-actin是構(gòu)成細胞骨架的主要成分肌動蛋白的一種，幾乎在所有的真核細胞中表達[10]，具有基因序列高度保守和mRNA表達數(shù)量高且穩(wěn)定的特點，所以在很多動植物組織中開展檢測基因表達的相關(guān)實驗中常以β-actin作為內(nèi)參基因[11]。在進行各基因的表達檢測前，一般都需要先建立各基因的標準質(zhì)粒和標準曲線，以便檢測基因的擴增效率及對模板進行精確定量分析[12]。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究不同引物對和退火溫度對鹽穗木內(nèi)參基因β-actin擴增效率的影響，為鹽穗木實時定量PCR中內(nèi)參基因β-actin的引物設(shè)計和退火溫度的選擇具有一定的借鑒意義，為不同實驗處理的鹽穗木候選靶基因的表達檢測提供真實而準確的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 鹽穗木種子

鹽穗木種子采自五家渠106團鹽堿地。將種子播于花土∶蛭石∶珍珠巖(2∶1∶1)基質(zhì)的花盆中，置于自然光照下，白天(25～30)℃，夜間(21±2)℃，日照時間≥15 h，在此期間用自來水進行澆灌，當幼苗長至約7～8 cm左右時提取鹽穗木同化枝總RNA。

1.1.2 引物

根據(jù)已發(fā)表的植物β-actin基因的mRNA序列，利用DNAMAN軟件設(shè)計，由上海生工有限公司合成2對特異性引物，擴增片段長度為分別為230與180 bp，列出引物序列。表1

表1 引物列表
Table 1 Primers sequences

引物名稱Primername引物序列(5＇ 3＇)Primersequences5＇to3＇β-actin1-P1AAGATCTGGCACCACACCTTCβ-actin1-P2CACACCATCACCAGAATCGAβ-actin2-P1CCAAAGGCCAACAGAGAGAAGAβ-actin2-P2TGAGACACACCATCACCAGAPOD-P1CAGGTGCTCATACAATCGGPOD-P2AGTTGCTGGACAAATAGAC

注：POD為鹽響應(yīng)的鹽穗木過氧化物酶基因

Note:PODis the peroxidase gene responding to salinity

1.2 方 法

1.2.1 鹽穗木總RNA的提取

使用天根植物總RNA提取試劑盒提取鹽穗木同化枝總RNA，以其為模板，按照TaKaRa公司M-mLV第一鏈cDNA合成試劑盒操作說明進行cDNA第一鏈的合成。

1.2.2 標準質(zhì)粒的構(gòu)建

對已發(fā)表的植物β-actin基因的mRNA序列進行比對，設(shè)計兩對引物β-actin1-P1、β-actin1-P2與β-actin2-P1、β-actin2-P2用于擴增鹽穗木β-actin基因片段。預(yù)測β-actin1引物對擴增的片段長度為230 bp，β-actin2引物對擴增的片段長度為180 bp，同時也利用POD-P1和POD-P2這一對引物分別構(gòu)建了鹽穗木β-actin和POD基因的標準曲線。

以第一鏈cDNA為模板，分別用設(shè)計好的引物進行擴增，PCR擴增反應(yīng)體系：20 μL體系，其中10 ×PCR Buffer 2 μL，dNTP 3.2 μL，P1和P2各0.5 μL，ExTaq酶 0.2 μL，cDNA 2 μL，最后加ddH2O 11.6 μL；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

將擴增出的正確條帶進行切膠回收(上海生工膠回收試劑盒)，回收產(chǎn)物與pMD18-T在16℃下進行過夜連接(大約12～16 h)，其連接體系為：solution I 5 μL，回收產(chǎn)物4.6 μL，pMD18-T(Takara公司) 0.4 μL。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，用含有1‰氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng)12～16 h，挑取單克隆，在LB培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)6～8 h之后，進行菌液PCR鑒定，對于陽性克隆提取質(zhì)粒后進行酶切，鑒定正確后測序。將鑒定正確的質(zhì)粒進行梯度稀釋(101、100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6)，制作標準曲線時，先將樣品質(zhì)粒稀釋到10 ng/μL，依次按10倍體積稀釋。Ct值通過ABI7500熒光定量儀產(chǎn)生，將數(shù)據(jù)輸入Excel進行計算分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

計算鹽穗木POD基因以及不同退火溫度下β-actin基因(β-actin1和β-actin2引物對)的擴增效率，基因擴增效率的計算公式：E=10-1/a-1(E為擴增曲線，a為質(zhì)粒標準曲線的斜率)，利用2-ΔΔCt法計算POD基因在不同β-actin引物對擴增產(chǎn)物做內(nèi)參基因時的相對表達量。利用Excel和GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準質(zhì)粒的構(gòu)建

從鹽穗木中提取總RNA，其260/280比值為1.8～2.0，瓊脂糖凝膠電泳顯示28s rRNA條帶是18s rRNA的2倍，表明總RNA質(zhì)量較好(圖1)。通過反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，以cDNA為模板，分別用β-actin1和β-actin2引物對擴增β-actin基因，其擴增產(chǎn)物大小分別為230 bp左右，和180 bp左右(圖2)。分別將這2種擴增產(chǎn)物連接到克隆載體pMD18-T上，經(jīng)測序獲得正確的序列后，將鑒定正確的菌液二次活化，提取的質(zhì)粒濃度分別為185.3 ng/μL(β-actin1的引物擴增)和237.7 ng/μL (β-actin2的引物擴增)，其260/280分別為1.82以及1.86，而260/230分別為2.05及2.08，都在正常范圍之內(nèi)，可以后續(xù)下面實驗。圖1，圖2

2.2 標準曲線的建立

對以上質(zhì)粒進行梯度稀釋。將質(zhì)粒稀釋到10 ng/μL的濃度，然后熒光定量PCR進行標準曲線的構(gòu)建，總結(jié)不同稀釋濃度下55和58℃質(zhì)粒的平均Ct值，根據(jù)表2分別建立標準曲線(圖3)。首先可以看到在55℃下β-actin1和β-actin2的標準曲線的R2值分別為0.997 5與0.999 4，而在58℃下兩者標準曲線的R2值分別為0.995 4與0.998 6，說明標準曲線的線性相關(guān)性良好。為了提高PCR的可靠性和準確性，必須知道PCR產(chǎn)物特異性和PCR的動力學(xué)特性[12]，擴增曲線指數(shù)擴增期和平臺期均十分明顯，線性范圍廣，從6～31個循環(huán)都能檢測到，并且不論是β-actin1還是β-actin2引物對在55與58℃條件下都很平滑，說明擴增的整個PCR過程是較好的，是較為理想的擴增曲線(圖4)；第三，引物對β-actin1在55與58℃下的熔解溫度分別為82.50、82.54℃，引物對β-actin2在55與58℃下的熔解溫度同為81.74和81.34℃，在這兩種溫度的變化下兩種引物對β-actin1與β-actin2在熔解溫度上基本沒有太大變化，并且沒有雜峰產(chǎn)生，說明兩對引物在兩種溫度條件下的擴增特異，沒有引物二聚體產(chǎn)生(圖5)?？傮w來說，標準曲線的線性關(guān)系良好，不存在非特異性擴增，構(gòu)建的β-actin基因的標準曲線是真實可靠的。表2，圖3～5

圖1 鹽穗木總RNA提取
Fig.1 Total RNA fromHalostachyscaspica

M.DL2000；1.β-actin1引物對擴增的β-actin；2.β-actin2引物對擴增的β-actin

M.DL2000; 1.Amplificationofβ-actinwithapairofprimersactin1; 2.Ampificationofβ-actinwithapairofprimersβ-actin2

圖2 鹽穗木β-actin基因擴增結(jié)果
Fig.2 PCR amplification ofHalostachyscaspicaβ-actingene

表2 不同引物對和退火溫度下，以質(zhì)粒為模板擴增β-actin基因的平均Ct值
Table 2 The averageCtvalues ofβ-actingene from plasmid templates amplified with the

質(zhì)粒濃度Concentration(ng/μL)溫度Temperature(℃)10110010-110-210-310-410-510-6引物對β-actin1apairofβ-actin15569292212741653193423352709299358848114314771842208225452925引物對β-actin2apairofβ-actin25569586111891560193523062695581002122915421968234227713150

A. 55℃ β-actin1引物對擴增的β-actin基因的標準曲線； B. 58℃ β-actin1引物對擴增的β-actin基因的標準曲線； C. 55℃ β-actin2引物對擴增的β-actin的標準曲線；D. 58℃ β-actin2引物對擴增的β-actin2標準曲線

A. Standard curve ofβ-actinwith a pair of primers β-actin1 at the annealing temperature of 55 ℃; B. Standard curve ofβ-actinwith a pair of primers β-actin1 at the annealing temperature of 58 ℃; C. Standard curve ofβ-actinwith a pair of primers β-actin2 at the annealing temperature of 55 ℃; D. Standard curve ofβ-actinwith a pair of primers β-actin2 at the annealing temperature of 58 ℃

圖3 在55和58℃退火溫度下，兩對引物β-actin1和β-actin2擴增β-actin的標準曲線
Fig.3 Standard curves ofβ-actinwith two pairs of primers β-actin1 and β-actin2 at the annealing temperature 55℃ and 58℃

A. 55℃ β-actin1擴增β-actin的擴增曲線；B. 58℃下β-actin1擴增β-actin的擴增曲線；C. 55℃下β-actin2擴增β-actin的擴增曲線；D. 58℃ β-actin2擴增β-actin的擴增曲線

A. The amplification curve ofβ-actinwith a pair of primers β-actin1 at the annealing temperature of 55℃; B. The amplification curve ofβ-actinwith a pair of primers β-actin1 at the annealing temperature of 58℃; C. The amplification curve ofβ-actinwith a pair of primer β-actin2 at the annealing temperature of 55℃; D. The amplification curve ofβ-actinwith a pair of primers β-actin2 at the annealing temperature of 58℃

圖4 在55和58℃退火溫度下，2對引物β-actin1和β-actin2擴增β-actin的擴增曲線
Fig.4 The amplification curve ofβ-actinwith two pairs of primers β-actin1 and β-actin2

at the annealing temperature of 55 ℃ and 58℃

A. 55℃ β-actin1引物對擴增β-actin的熔解曲線；B. 58℃下β-actin1引物對擴增β-actin的熔解曲線；C. 55℃下β-actin2引物對擴增β-actin的熔解曲線；D. 58℃ β-actin2引物對擴增β-actin的熔解曲線

1.At 55℃, the melting curve ofβ-actinwith a pair of primers β-actin1; B. At 58℃, the melting curve ofβ-actinwith a pair of primers β-actin1; C. At 55℃, the melting curve ofβ-actinwith a pair of primers β-actin2; D. At 58℃, the melting curve ofβ-actinwith a pair of primers actin2

圖5 在55和58℃退火溫度下，兩對引物β-actin1和β-actin2擴增β-actin的熔解曲線
Fig.5 The melting curves ofβ-actinwith two pairs of primers β-actin1 and β-actin2 under the annealing temperatures of 55℃ or 58℃

2.3 標準曲線的制作以及引物差異性比較

在同一退火溫度下，β-actin1引物對在55℃的擴增效率為E=10-1/-3.392 6-1=0.972 3，58℃時為E=10-1/-3.443 2-1=0.951 7，而β-actin2 引物對在55℃的擴增效率為E=10-1/-3.685 3-1=0.867 877，58℃時為E=10-1/-3.903 4-1=0.803 794。以上的結(jié)果可以總結(jié)為兩點：首先在相同的退火溫度下，引物對β-actin1擴增β-actin基因的擴增效率高于引物對β-actin2的擴增；第二，同一引物對，在55℃退火溫度下的擴增效率要高于58℃?？傮w來講，引物對β-actin1在55℃的退火溫度下對β-actin基因的擴增效率較好。表3

表3β-actin基因在不同引物對及不同退火溫度條件下擴增的標準曲線公式
Table 3 Standard curves formula ofβ-actingene at different pair of primers and annealing temperatures

引物名稱Primername溫度Temperature(℃)公式FormulaR2擴增效率E(amplificationefficiency)引物對β-actin1apairofβ-actin155Y=-33926x+33409099750972358Y=-34432x+321490995409517引物對β-actin2apairofβ-actin255Y=-36853x+30481099940867958Y=-39034x+353370998608038

在以鹽穗木為材料，實時定量PCR過程中，引物對β-actin1擴增的Ct值大概在23左右，而引物對β-actin2的Ct值往往要很高，一般在28左右，這也說明β-actin1基因擴增效率上確實要大于β-actin2的擴增效率。

同時分別以這2對引物擴增β-actin作為內(nèi)參基因，檢測了一個鹽穗木鹽響應(yīng)的基因 (POD)的相對表達量，結(jié)果為是目的基因的表達呈現(xiàn)一定的差異。退火溫度為55℃時(圖6A)，根據(jù)Ct值繪制的鹽穗木POD基因片段的標準曲線，R2=0.986 1，表明該基因標準曲線的線性化較好，并且基因的熔解曲線單一，無雜峰，說明設(shè)計的引物是特異的，沒有引物二聚體和非特異擴增。該引物的擴增效率為0.986，在接受范圍之內(nèi)，該引物是可用的。

400 mM NaCl處理不同時間的鹽穗木同化枝過氧化物酶基因(POD)的表達情況(圖6B和6C)，結(jié)果為利用β-actin1引物對擴增的β-actin作為內(nèi)參基因，鹽處理24 h時POD基因的最大表達倍數(shù)是對照的4倍，而利用β-actin2引物對擴增的β-actin作為內(nèi)參基因，相應(yīng)地，雖然POD基因在24 h表現(xiàn)為上調(diào)趨勢，但相對表達量僅是1.5倍，與對照相比，基因的表達沒有顯著差異。說明不同的引物對于基因的擴增效率是不同的。不論是內(nèi)參基因還是目的基因，設(shè)計優(yōu)化的引物對于獲得準確、可靠的實時定量PCR的結(jié)果是非常重要的。圖6

注：小字母表示處理間顯著差異P< 0.05

Note: The letters represent significant differences among treatment,P< 0.05

圖6 鹽穗木POD基因的標準曲線(A)和分別以不同引物β-actin1(B)和β-actin2(C)擴增的β-actin作為內(nèi)參基因檢測鹽脅迫處理的鹽穗木同化枝POD的表達水平(小字母表示處理間顯著差異P< 0.05)
Fig.6 The standard curve ofHalostachyscaspicaPODgene(A) and its relative expression from this species' assimilating branches under the treatment of 400 mM NaCl withβ-actingene as a reference gene amplified with different primers β-actin1(B) and β-actin2(C)(The letters presented significant differences among different treatments,P< 0.05)

3 討 論

實時定量PCR是在mRNA水平對基因的表達進行監(jiān)控，可以對待測樣品的起始模板濃度進行絕對和相對定量，實時檢測目的基因mRNA水平的表達變化，是分子診斷學(xué)、生命科學(xué)、農(nóng)學(xué)以及醫(yī)學(xué)中非常重要的技術(shù)[13-14]。

同時在實時定量PCR過程中很多參數(shù)都會影響實驗結(jié)果的準確性，如樣品初始量，RNA完整性，cDNA合成的效率，引物的設(shè)計，退火溫度等等[14]。擴增效率可以衡量實時定量PCR的過程，一般90%～107%的擴增效率屬于正常范圍，其中擴增效率對于引物是高度依賴的[15-16]。除了引物對擴增效率有影響，低的擴增效率(<90%)還有可能是由于Taq酶的活性低，抑制劑的污染，退火溫度未優(yōu)化，引物設(shè)計不合理或擴增產(chǎn)物含二級結(jié)構(gòu)等造成的；過高擴增效率(>107%)的原因一般是由于引物二聚體或非特異性擴增引起的，不過因人為操作不當，移液器不準，離心不當?shù)榷绊憯U增效率的高低也是經(jīng)常發(fā)生的[13]。實驗中盡量保持上述條件的一致，來研究引物和退火溫度對擴增效率的影響。

研究構(gòu)建了不同引物對擴增的鹽穗木β-actin基因和特異性引物擴增的POD基因的標準質(zhì)粒，采用SYBR Green I染料法進行qRT-PCR，通過熔解曲線分析擴增產(chǎn)物，排除非特異擴增，不論是內(nèi)參基因還是目的基因的標準曲線的線性化良好(R2>0.986)，實驗也明確引物和退火溫度的不同，對于實時定量PCR的擴增效率存在很大影響，分別在55和58℃建立了β-actin基因的標準曲線，發(fā)現(xiàn)二者的擴增效率確實存在差異，高溫條件的擴增效率要低于低溫的擴增效率，并且雖然引物對β-actin1較高退火溫度的擴增效率低于較低的溫度，但是也在可接受范圍之內(nèi)，為以后，實時定量PCR實驗中，β-actin基因引物退火溫度的選擇方面擴大了范圍。

4 結(jié) 論

影響實時定量PCR的因素有很多，研究了引物和退火溫度對基因擴增效率的影響，以鹽穗木的一個內(nèi)參基因β-actin為例，在設(shè)計的兩對引物中，β-actin1引物對在55℃退火溫度下其標準曲線的擴增效率較高。并且在相同退火溫度下，分別以引物對β-actin1和β-actin2擴增作為內(nèi)參基因的β-actin，檢測到的鹽穗木鹽響應(yīng)的POD基因的相對表達量具有差異性。在實時熒光定量PCR之前一定要對引物進行優(yōu)化，選擇合適的退火溫度等，這些對于準確檢測靶基因的相對和絕對表達量非常重要。

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Supported by:the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region "The correlation analysis of some candidate miRNAs and target genes in the halophyteHalostachyscaspicaunder high salt intensity"(2015211C274)

Effects of Different Primers and Annealing Tempearatures on the Amplification Eefficiency of Real-Time PCR Reference Gene β-actin in the HalophyteHalostachysCaspica

BAI Xue-qin, YANG Rui-rui, ZENG You-ling

(XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering,CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

【Objective】 To study the effects of different primers and annealing temperatures on real quantitative PCR amplification efficiency of reference gene β-actin with the halophyteHalostachyscaspicaas research material.【Method】Standard curves of β-actin and peroxidase gene,POD(representative gene responding to salt stress)from this species were built with well-designed two pairs of primers named β-actin1 and β-actin2 for β-actin as internal reference gene, and a pair of primers forPODgene and amplification curves were obtained under different conditions for these genes.【Result】Results showed that the amplification efficiency of the primers β-actin1 was higher than that of the primers β-actin2 in theHalostachyscaspicabranches under the 55℃ or 58℃ annealing temperature, and amplification efficiency at 55℃ annealing temperature was higher than that at 58℃. On the other hand, it was found there were some differences in the relative expression levels ofHalostachyscaspicaPODgene using the internal reference gene β-actin with two pairs of primers β-actin1 and β-actin2 under the 55℃ annealing temperature.【Conclusion】The research indicates that primers and annealing temperatures can influence the fluorescence quantitative PCR amplification efficiency and then affect relative expression level of candidate genes at a certain extend.

Halostachyscaspica; different primers and annealing temperatures; β-actin; amplification efficiency

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.02.019

2016-11-21

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金"極端耐鹽植物鹽穗木高鹽脅迫下一些差異表達候選的miRNA與靶向基因的相關(guān)性分析"(2015211C274)

白雪芹(1989-)，女，甘肅人，碩士研究生，研究方向為植物抗逆生理和分子機制，(E-mail)1621654925@qq.com

曾幼玲(1971- )，女，四川人，副教授，研究方向為植物抗逆生理和分子機制，(E-mail)zeng_ylxju@126.com

Q786

A

1001-4330(2017)02-0352-09