華濤，馮磊，張雪花，唐波，常晨，劉國陽，吳培培，陳麗，張道華*，侯繼波*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室，江蘇南京210014;2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州225009)

PK-15細胞在微載體懸浮放大培養(yǎng)及PCV2增殖工藝研究

華濤1，2，馮磊1，2，張雪花1，2，唐波1，2，常晨1，2，劉國陽1，2，吳培培1，2，陳麗1，2，張道華1，2*，侯繼波1，2*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室，江蘇南京210014;2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州225009)

為建立在生物反應器內(nèi)微載體逐級放大培養(yǎng)PK-15細胞和增殖PCV2技術(shù)。采用分批式培養(yǎng)方法，研究了PK-15細胞在微載體胰酶消化放大懸浮培養(yǎng)及豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)增殖工藝。結(jié)果表明，5 g/L的微載體和高糖DMEM下，采用4.0×105cells/mL的初始接種密度及培養(yǎng)至第2天進行換液操作工藝可以獲得最佳的PK-15細胞生長效能。胰酶消化轉(zhuǎn)移將PK-15細胞從1 L反應器放大至3 L反應器，微載體上細胞貼附均勻、生長旺盛，培養(yǎng)3 d細胞密度可達34.3×105cells/mL。采用感染復數(shù)為0.1的接毒比例，細胞接毒后在微載體上傳至第3代收獲毒液可獲得最高的PCV2增殖效價107.25TCID50/mL。為PCV2疫苗的生物反應器規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎。

PK-15細胞;微載體;消化放大;豬圓環(huán)病毒2型;懸浮培養(yǎng)

豬圓環(huán)病毒(PCV)發(fā)現(xiàn)于1974年，作為PK-15細胞的污染被命名為豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)，動物試驗證明其沒有致病性［1］。自20世紀90年代初，由豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)發(fā)現(xiàn)以來，PCV2給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失，各國政府和養(yǎng)豬企業(yè)加大了對豬圓環(huán)相關(guān)疾病(PCVAD)防治的關(guān)注和投入［2］。疫苗免疫是預防PCVAD最有效的手段，國內(nèi)外PCVAD的商品化疫苗主要有3類:全病毒滅活疫苗、重組毒滅活疫苗和亞單位疫苗［3－4］。由于全病毒滅活疫苗生產(chǎn)成本相對較低，并具有優(yōu)良免疫效果，在我國市場上使用較廣，且國內(nèi)廠家主要生產(chǎn)滅活疫苗，但多數(shù)廠家PCV2的增殖滴度較低［5］。PCV感染宿主細胞后，病毒采用滾環(huán)復制模式進行復制，在細胞生長的S期復制效率較高，隨宿主細胞復制而復制，因此PCV2的復制周期比其他病毒長，這為研制高效的PCV2疫苗帶來了障礙［6－7］。PCV2滅活疫苗生產(chǎn)方式依然延用了傳統(tǒng)的實驗室大方瓶或滾瓶連續(xù)傳代培養(yǎng)方式，占地面積大，工序操作繁瑣，瓶與瓶之間病毒增殖滴度的不穩(wěn)定。在生物反應器中以持續(xù)攪拌的方式進行動物細胞的微載體懸浮培養(yǎng)，微載體提供了更大的細胞貼壁表面積，而且反應器能自動監(jiān)控細胞生長或病毒繁殖時的最適生化條件，其營養(yǎng)物質(zhì)、氣體及熱量的傳遞更加充分均勻，為細胞生長及病毒增殖提供相對優(yōu)質(zhì)、恒定的培養(yǎng)環(huán)境，整個生物過程控制精確，易于重復，保證了疫苗產(chǎn)品批次間質(zhì)量的一致性，并具備規(guī)模放大的可能性［8－9］。國內(nèi)眾多疫苗廠家進行了微載體擴增PCV2研究，主要集中在多聚糖球形和紙片微載體培養(yǎng)，培養(yǎng)工藝均采用滾瓶或方瓶到反應器的一次性放大工藝［10－11］。雖獲得了較高的病毒滴度，但前期所需滾瓶量非常大，才能在反應器上進行一次性高密度放大，且沒有進行微載體傳代培養(yǎng)的報道，無法在反應器內(nèi)進行無毒細胞－接毒－多次傳代－收毒的工業(yè)放大，使其在密閉的反應器內(nèi)進行。由于PK-15細胞耗能比較大，如何選用營養(yǎng)成分較高的培養(yǎng)基，以及如何換液補料成為制約PK-15細胞高效增殖的主要障礙;另外由于PCV2復制效率較低，需要PK-15細胞帶毒傳代，而細胞帶毒后易產(chǎn)生凋亡現(xiàn)象，較高的接毒強度反而不利于細胞的有效復制，無法達到較高的病毒滴度。因此如何為PK-15細胞提供適宜生長條件，以及多大的接毒劑量，成為無毒細胞擴增－接毒－多次傳代－收毒的工業(yè)放大過程中的關(guān)鍵問題。本研究建立了微載體逐級放大培養(yǎng)工藝培養(yǎng)PCV2，為在反應器內(nèi)進行無毒細胞擴增－接毒－傳代－收毒的工業(yè)放大提供試驗依據(jù)和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與病毒

PCV2-DBN-SX07(Genbank No.:FJ660968)由國家獸用生物制品工程中心保存［12］;PK-15細胞由本實驗室保存。

1.2 材料

Cytodex 1購自GE公司。首先稱取一定量的Cytodex 1置于二甲基二氯硅烷硅化的瓶子內(nèi)，加入PBS(pH 7.2)水化，比例約為80～150 mL/g Cytodex 1，約3 h后將PBS傾去，加入新的PBS，高壓滅菌121℃，30 min，冷卻后傾去PBS，用培養(yǎng)基洗漆1次后傾去，重新加入新鮮培養(yǎng)基置4℃?zhèn)溆谩?/p>

細胞培養(yǎng)液MEM、高塘DMEM和新生牛血清購自GIBICO公司。配制含有10%新生牛血清的MEM和DMEM培養(yǎng)液，含100 IU/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素，經(jīng)無菌0.22μm濾膜過濾除菌，置4℃?zhèn)溆?。胰蛋白酶購自GIBICO公司，用無Ca2+、Mg2+離子磷酸鹽緩沖液配制成0.25%濃度胰蛋白酶溶液，調(diào)整pH至7.5～8.0，經(jīng)無菌0.22μm濾膜過濾除菌，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 設備

滾瓶設備購自瑞士IBS公司，培養(yǎng)體積為250 mL。1和3 L動物細胞反應器購自荷蘭Applicon，121℃高壓滅菌30 min用于PK-15細胞微載體懸浮培養(yǎng)，反應器培養(yǎng)體積0.8和2.4 L，具有溶氧、pH、溫度、轉(zhuǎn)速及四氣(N2、O2、CO2及空氣)控制系統(tǒng)。

1.4 試驗方法

1.4.1 培養(yǎng)基對細胞生長的影響微載體濃度在3 mg/mL條件下，PK-15細胞接種密度為2.0×105cells/mL接種1 L動物細胞反應器，轉(zhuǎn)速均為40 r/ min，溶氧飽和度為50%，溫度37℃，pH 7.0，觀察含10%血清高糖DMEM和MEM培養(yǎng)基對細胞生長的影響

1.4.2 細胞接種量對細胞生長的影響在優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎上，不同初始細胞密度2.0×105、4.0× 105和6.0×105cells/mL的PK-15細胞分別接種于1 L動物細胞反應器中，微載體用量分別為3 g/L，觀察不同初始密度對細胞生長的影響，確定最佳接種細胞密度。

1.4.3 微載體濃度對細胞生長的影響在優(yōu)化細胞接種密度的基礎上，在含10%血清高糖DMEM，接種細胞密度4.0×105cells/mL條件下，觀察3、5、7 mg/mL微載體濃度對細胞生長的影響。

1.4.4 微載體消化狀態(tài)條件的確定PK-15細胞增殖3 d后，Cytodex 1微載體上細胞生長成單層時，進行在位消化轉(zhuǎn)移放大，首先停止攪拌，待微載體完全沉降將培養(yǎng)基排出，37℃溫浴的PBS以約100 mL/g微載體清洗3次，去除殘留的培養(yǎng)基。加入37℃溫浴的胰酶，50 mL/g微載體，在37℃消化，在5、10、15 min取樣0.2 mL，加入0.2 mL培養(yǎng)基進行中止，在顯微鏡下觀察消化情況。消化完全后，接種細胞密度4.0×105cells/mL到下一級生物反應器內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，補加微載體至5 mg/mL，補加原有培養(yǎng)基體積后進行培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d換掉培養(yǎng)基一半，觀察細胞生長情況。

1.4.5 不同接毒量在微載體上消化放大培養(yǎng)根據(jù)摸索的培養(yǎng)工藝，PK-15細胞在反應器中驗證其放大培養(yǎng)PCV2工藝的可行性。細胞培養(yǎng)罐安裝完畢后，微載體為4 g/L，初始細胞密度4.0×105cells/mL，轉(zhuǎn)速為40 r/min。第一級生物反應器中培養(yǎng)24 h后，PCV2以不同感染復數(shù)(MOI)接入含有相同PK-15細胞密度微載體培養(yǎng)物中，MOI為0.5、0.1和0.05。接毒后2 d，進行帶毒細胞傳代，每代取樣測定PCV2效價，確定最佳接毒MOI和最佳收貨時間。微載體上的細胞傳代培養(yǎng)方式:用胰酶消化完全后，接種細胞密度4.0×105cells/mL到下一級生物反應器內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，補加微載體至5 mg/mL，加入培養(yǎng)基進入下一級生物反應器內(nèi)培養(yǎng)，工作體積為0.8 L，在培養(yǎng)第2天換掉一半培養(yǎng)基。以上生物反應器培養(yǎng)參數(shù)均為:pH 7.0，溶氧飽和度為50 %，溫度37℃，攪拌速度40 r/min。

1.5 細胞技術(shù)和計算方法

細胞密度測定:均勻吸取微載體培養(yǎng)樣品，離心去除上清，用PBS洗3遍，0.25%胰酶溶液于37℃消化10 min獲得游離細胞。進行臺盼藍染色，血球計數(shù)板計算活、死細胞數(shù)，計算細胞存活率和細胞密度。每天取樣測定，繪制PK-15細胞生長曲線。

1.6 葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨測定

葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨的濃度測定均采用Nova 400全自動生化分析儀進行測定。方法為:收取微載體培養(yǎng)樣品，10 000 r/min離心取上清，在Nova 400全自動生化分析儀測定以上細胞基本代謝情況。

1.7 PCV2滴度測定

含10%血清正常培養(yǎng)的PK-15細胞在96孔板上長至單層時，接入連續(xù)10倍稀釋的病毒樣品，每個稀釋度接入8個孔，每孔200μl，接毒后4 d進行間接免疫熒光。PK-15細胞無水乙醇固定1 h，0.5‰Tween-20的PBS(PBST)洗滌后加入PCV2陽性豬血清(1∶200)，37℃孵育1 h，PBST洗滌5次，每次5 min。加入FITC-SPA熒光二抗(1∶200)，37℃孵育l h，PBST洗滌5次，每次5 min，于熒光顯微鏡下觀察陽性細胞孔數(shù)。按Karber方法計算病毒滴度，結(jié)果以1 mL中半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量(TCID50/mL)表示。

1.8 統(tǒng)計學分析

應用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Duncan’s多重分析，比較各組差異，以不同字母表示差異顯著(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對PK-15細胞生長的影響

在3 g/L微載體濃度條件下，初始細胞接種密度為2.0×105cells/mL，采用高糖DMEM和MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的PK-15細胞，如圖1所示。高糖DMEM培養(yǎng)基所獲得細胞密度為18.2×105個/ mL，是MEM培養(yǎng)基的1.42倍，高糖DMEM培養(yǎng)效果優(yōu)于MEM培養(yǎng)基。且在細胞生長后期MEM培養(yǎng)基所獲得的細胞存活率顯著低于高糖DMEM。

2.2 不同PK-15細胞接種密度對其在微載體上生長影響

微載體濃度為3 g/L時，初始細胞接種密度為2.0×105、4.0×105和6.0×105cells/mL，使PK-15細胞在微載體上生長曲線呈現(xiàn)差異性變化(圖2)。低初始細胞密度2.0×105cells/mL使PK-15細胞生長延遲，細胞生長缺乏初始密度，造成微載體上細胞分布較少，同時還存在很多空的微載體(圖3A)。6.0×105cells/mL的高初始細胞密度可使PK-15細胞快速進入生長期，但細胞存活率相對較低，這可能是細胞密度較大導致細胞聚團，或單個微載體分配細胞較多導致游離細胞不粘附的現(xiàn)象，不能提供有效生長表面(圖3C)。4.0×105cells/mL相對適中的初始細胞密度接種與微載體上培養(yǎng)時，PK-15細胞既能均勻的貼附于微載體表面，使細胞快速生長，同時為后續(xù)生長的細胞預留充裕的生長表面積，獲得較高的細胞密度(22.3×105cells/mL)和細胞存活率(圖3B)。

圖1 不同培養(yǎng)基對PK-15細胞的生長曲線和細胞存活率比較Fig.1 Comparison of growth curve and viability of PK-15 cells with differentmedia

圖2 不同PK-15細胞初始密度的生長曲線和細胞存活率比較Fig.2 Comparison of growth curve and viability of PK-15 cells with different initial densities of cells

圖3 不同初始密度的PK-15細胞培養(yǎng)3 d時的增殖形態(tài)Fig.3 Morphology of PK-15 cells with different initial densities of cells for 3-d suspension culture

2.3 不同微載體濃度對PK-15細胞生長的影響

由圖4可知，在含10%血清高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，PK-15細胞的接種密度4.0×105個/mL條件下，隨著微載體濃度提高，細胞密度也相應提高。用相同的細胞密度接種3、5、7 mg/mL微載體濃度所能達到的最高細胞密度分別為22.2× 105、26.1×105、26.4×105個/mL。其中5和7 mg/ mL微載體中培養(yǎng)效果相似，其細胞濃度較高，5 mg/ mL微載體濃度經(jīng)濟較好，各組細胞存活率均相似。2.4 PK-15細胞培養(yǎng)過程中的基本代謝

圖4 不同微載體濃度的PK-15細胞生長曲線和細胞存活率比較Fig.4 Comparison of growth curve and viability of PK-15 cells with differentmicrocarrier concentration

圖5 PK-15細胞微載體懸浮培養(yǎng)過程中葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺及氨的濃度Fig.5 Glucose，lactate，glutamine and ammonia concentrations in microcarrier suspension culture system for PK-15 cells

接種細胞密度4.0×105cells/mL條件下，微載體濃度提高5 mg/mL以上細胞培養(yǎng)密度不再提高，推測為10%血清高糖DMEM培養(yǎng)基無法支持細胞高密度生長。在接種細胞密度4.0×105個/mL、微載體濃度5 mg/mL條件下，在1 L反應器對葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸及氨基本代謝進行檢測，如圖5所示。在培養(yǎng)至第1天葡萄糖和谷氨酰胺濃度變?yōu)?4.8和2.4 mmol/L，為原濃度的64%和62%。培養(yǎng)至第2天葡萄糖和谷氨酰胺濃度下降至4.8和1.2 mmol/L，僅為原濃度的21%和35%，乳酸和氨代謝副產(chǎn)物濃度的累積達到23.7和2.1 mmol/L。第3天葡萄糖為0.6 mmol/L，幾乎消耗完全，谷氨酰胺為0.4 mmol/L，僅為原濃度的11%，乳酸和氨代謝副產(chǎn)物濃度進一步提高。細胞培養(yǎng)至第2天后，培養(yǎng)基已無法支持細胞迅速生長。

2.5 不同補料方式對PK-15細胞生長的影響

根據(jù)微載體懸培養(yǎng)過程中營養(yǎng)成分及代謝產(chǎn)物濃度的變化，在第2天時開始補料或?qū)⑵渑囵B(yǎng)基換掉一半的培養(yǎng)方式進行比較。如圖6所示，通過換液或補料均可提高細胞的密度，均好于普通培養(yǎng)。補料式操作在培養(yǎng)的第2天補加葡萄糖和谷氨酰胺使其濃度分別為12和2 mmol/L，為細胞增加了充足的營養(yǎng)，但代謝產(chǎn)物的積累同樣更高，培養(yǎng)至第3天氨和乳酸的濃度分別為4.6和35.3 mmol/L，高于普通培養(yǎng)測定的結(jié)果，影響細胞的增殖，最大細胞密度30.8×105cells/mL。在第2天進行換液操作，停止攪拌發(fā)酵罐，附著細胞的微載體自動沉降后去除一半原培養(yǎng)液，更換為新鮮培養(yǎng)液。去除了一半前2 d積累的代謝副產(chǎn)物，同時補充了充足的營養(yǎng)更有利于細胞增殖，最大細胞密度達到34.7×105個/mL，顯示最好的生長性能。

圖6 不同培養(yǎng)方式對PK-15細胞在微載體上生長的影響Fig.6 Effects of different culture modes on growth curve of PK-15 cells onmicrocarriers

圖7 PK-15細胞在反應器內(nèi)微載體上消化轉(zhuǎn)移放大Fig.7 Scale-up of PK-15 cells cultured on Ctytodex 1 by transfer of tripsin digest in bioreator

圖8 PK-15細胞感染PCV2(MOI=0.01)傳至第3代病毒滴度為107.5TCID50/m LFig.8 Virus titer being107.5TCID50/mL at the 3rdpassage of PK-15 cells infected with PCV2(MOI=0.01)

2.6 PK-15細胞在微載體上消化轉(zhuǎn)移放大培養(yǎng)

PK-15細胞在微載體上培養(yǎng)3 d，待細胞生長成單層時，進行在位消化轉(zhuǎn)移放大，首先停止攪拌，靜置20 min左右待微載體完全沉降，將培養(yǎng)基排出，37℃溫浴的PBS以約100 mL PBS/g微載體清洗3次，去除殘留的培養(yǎng)基。向微載體內(nèi)加入37℃預熱的胰酶，攪拌混勻。在5、10、15min取樣0.2mL，加入0.2 mL培養(yǎng)基進行中止，當胰酶消化10 min后細胞全部脫落(圖7)。接種細胞密度4.0×105個/ mL到下一級生物反應器內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，補加微載體至5 mg/mL，補加原有培養(yǎng)基體積后進行培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d換掉培養(yǎng)基一半，3 d后細胞貼附于微載體上生長良好(圖7)，細胞密度為34.3×105個/mL。采用此方法PK-15細胞能在微載體上進行多次傳代，且細胞密度為30×105個/mL以上。

表1 不同感染復數(shù)(MOI)對PCV2增殖效價的影響Table 1 Effects of differentmultiples of infection(MOI)on PCV2 propagation titers

圖9 反應器微載體上PK-15細胞感染PCV2(MOI=0.01)細胞形態(tài)變化Fig.9 Pathological changes of PK-15cells infected with PCV2(MOI=0.01)

2.7 PCV2不同接毒量對病毒收獲得影響

過高或過低的感染復數(shù)(MOI=0.5或0.05)均導致較低的PCV2增殖效價(表1)，說明接毒劑量直接影響病毒的增殖效率。MOI=0.1時可以收獲最高的PCV2增殖效價，第3代時達到最高107.25TCID50/mL(圖8)，第4代時細胞無法貼附于微載體生長(圖9)。MOI=0.05接毒劑量，PK-15細胞第3代病毒滴度達到最高的106.75TCID50/mL，第4代時細胞開始脫落;MOI=0.5時病毒滴度在第2代為106.65TCID50/mL，細胞第3代時就無法貼附于微載體生長。以上各組試驗結(jié)果顯示，PCV2接毒劑量為MOI=0.1時，PK-15細胞感染后第3代為最佳收毒時間。

3 討論

本研究比較了MEM和高糖DMEM培養(yǎng)基對細胞生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細胞所能達到最終細胞密度為18.2×105個/ mL，是MEM培養(yǎng)基的1.42倍。在反應器內(nèi)，高通氧條件下高糖DMEM培養(yǎng)基含有葡萄糖4500 mg/ L，更適合于生長較快腫瘤細胞。高糖培養(yǎng)環(huán)境中代謝過程中所多余的葡萄糖生成乳酸是其他培養(yǎng)液的5倍，因此在長時間培養(yǎng)時，應采用間歇換液的方式，以消除代謝產(chǎn)物給細胞生長帶來的不利影響［13］。本研究在進行細胞代謝檢測時同樣發(fā)現(xiàn)乳酸蓄積量較高，培養(yǎng)第2天以后細胞增殖明顯降低，在培養(yǎng)第2天時進行換液可以更進步提供細胞密度。

在反應器中微載體懸浮培養(yǎng)細胞初期，微載體與細胞的黏附完全是一種物理性碰撞的過程，符合泊松分布規(guī)則，選擇合適的細胞初始密度和微載體用量比例可以達到較好的培養(yǎng)效果［14］。本研究中，PK-15細胞初始密度4×105個/mL在5 g/L的Cytodex 1微載體上獲得較為均勻的細胞分布效果，細胞黏附充分，細胞增殖密度和細胞存活率均獲得最好的水平。計算其細胞與微載體的比例為5 mg微載體4×105個細胞，根據(jù)說明書1g Cytodex 1粉末在PBS中的溶脹后可形成4.3×106微載體，可近似確定每個微載體上獲得17個左右初始細胞為最佳接種比例。細胞比例過高時，高濃度微載體的表面積未能充分被利用，且培養(yǎng)基無法支撐更高密度的細胞生長。但該比例應用于不同動物細胞時應有所改變，可能與不同細胞在微載體展開生長的速率及生長形態(tài)大小不同有關(guān)［15］。

PK-15細胞在微載體上充分黏附、展開生長后，為其提供營養(yǎng)物質(zhì)、氧及低副產(chǎn)物積累的生長環(huán)境是獲得高密度培養(yǎng)的關(guān)鍵。適時的換液可以提供充足的營養(yǎng)并去除代謝副產(chǎn)物的積累，是最佳的培養(yǎng)方式。生物反應器的換液操作相對方便，微載體自然沉降即可有效分離培養(yǎng)上清與培養(yǎng)物，在較短時間內(nèi)完成換液全過程。本研究顯示，PK-15生長速率較快，培養(yǎng)第2天葡萄糖即下降為原濃度的21 %，換液操作操作可顯著改善細胞第3天的生長性能，效果優(yōu)于不換液和補料。

PCV2整個基因組僅有1700多個堿基，編碼5種蛋白:Cap、Rep、Rep`、ORF3和ORF4蛋白，僅有Rep、Rep`參與基因組的復制，需要細胞內(nèi)各種復制蛋白酶等因素作用下將病毒基因組環(huán)狀單股DNA轉(zhuǎn)換成雙股環(huán)狀DNA，并啟動病毒的復制，病毒的復制模式為滾環(huán)復制［6］。普遍觀點是PCV復制是隨宿主細胞復制而復制，在細胞生長的S期復制效率較高，因此PCV2的復制周期比其他病毒長，這為研制高效的PCV2疫苗帶來了障礙［7］。PCV2效價最高峰的出現(xiàn)時間因各毒株的增殖速率的不同而異，疫苗生產(chǎn)采用滾瓶傳代的方式進行生長。根據(jù)PCV2感染及增殖特點，本研究中0.1的感染復數(shù)最為匹配PCV2感染及增殖過程的要求，病毒在微載體上傳至第3代可獲得較高滴度。試驗結(jié)果表明過高或過低的接毒量均不利于的增殖，過高時細胞在接毒第3代時就無法有效貼附于微載體生長，過低病毒生長周期延長，病毒所獲得的最高滴度也較低。

4 結(jié)論

微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)是目前細胞培養(yǎng)中日趨成熟的一種技術(shù)，已應用于多種疫苗的生產(chǎn)過程中，如流感疫苗、黃熱病毒疫苗和狂犬病疫苗等［16－18］。國外疫苗生產(chǎn)企業(yè)的微載體培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)能夠達到連續(xù)放大至6頓反應器，且生產(chǎn)過程全程在密閉管道中自動化控制。國內(nèi)微載體培養(yǎng)技術(shù)應用于人用或獸用疫苗的生產(chǎn)才剛剛起步，培養(yǎng)工藝、培養(yǎng)規(guī)模均遠遠落后于國外。本試驗對PK-15細胞的微載體懸浮消化放大培養(yǎng)、PCV2增殖等工藝進行了初步探索，在動物細胞反應器中PK-15細胞接毒后能夠連續(xù)3代傳毒。本試驗為建立工藝放大至實驗室中試水平，以及在反應器內(nèi)進行無毒細胞擴增－接毒－傳代－收毒的工業(yè)放大提供試驗依據(jù)和理論基礎。

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(責任編輯 李山云)

Scale-up Process of M icrocarrier Suspension Culture of PK-15 Cells and Propagation of PCV2

HUA Tao1，2，F(xiàn)ENG Lei1，2，ZHANG Xue-hua1，2，TANG Bo1，2，CHANG Chen1，2，LIU Guo-yang1，2，WU Pei-pei1，2，CHEN Li1，2，ZHANG Dao-hua1，2*，HOU Ji-bo1，2*
(1.National Research Center of Engineering and Technology for Veterinary Biologicals;Key Laboratory of Engineering and Technology for Veterinary Blologicals，Ministry of Agriculture，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Jiangsu Nanjing 210014，China;2.Jiangsu Coinnovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Jiangsu Yangzhou 225009，China)

In order to develop a technique for scale-up ofmicrocarrier suspension culture of PK-15 cells and propagation of PCV2 in bioreactor，batch-wise suspension culture of PK-15 cells onmicrocarriers(cytodex 1)using scale-up of tripsin digestand propagation of porcine circovirus type 2(PCV2)were investigated.The results showed that the optimal growth efficiency could be achieved by 4.0×105cells per 1 mL inoculation on 5 g/L microcarriers concentration，DMEM medium with high glucose and media replacement after 2-day culture.The highest PCV2 titerwas achieved 107.25TCID50/mL at the3rdpassage of PK-15 cells infected with 0.1multiple of infection(MOI)of PCV2.The optimal processes achieved in this study laid the experimental foundation formass production of PCV2 vaccines in bioreactor scale.

PK-15 cells;Microcarrie;Scale-up of digest;PCV2;Suspension culture

S52.651

A

1001－4829(2017)2－0474－07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.2.039

2016－04－01

江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新項目［CX(14)5044］;農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(201303046);江蘇省農(nóng)業(yè)支撐計劃(BE2012370)

華濤(1981－)，男，江蘇連云港人，博士，從事獸用生物制品工程技術(shù)和疫苗研究，E-mail:huatao541121@163.com，Tel:15951948013，*為通訊作者:張道華，E-mail:zhangdh2005@163.com，侯繼波，E-mail:houjibo@jaas.ac.cn。