夏俊芳,劉 霞,李曉燕,張珍珍,古麗娜孜,馬 瑤,木麗登,王 威,張亞南,武 運(yùn)

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

脅迫因素對(duì)玻璃表面蠟樣芽孢桿菌菌膜形成的影響分析

夏俊芳,劉 霞,李曉燕,張珍珍,古麗娜孜,馬 瑤,木麗登,王 威,張亞南,武 運(yùn)*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

以食源性致病菌蠟樣芽孢桿菌形成的菌膜為研究對(duì)象,模擬食品加工過(guò)程中溫度脅迫、酸堿脅迫、營(yíng)養(yǎng)脅迫、滲透脅迫、防腐劑脅迫等外源條件,采用超聲波平板菌落計(jì)數(shù)玻璃表面菌膜形成量,結(jié)晶紫染色法觀察菌膜在玻璃表面的生長(zhǎng)形態(tài)。結(jié)果表明:溫度脅迫下,低溫4 ℃、高溫50 ℃均能形成菌膜且隨著溫度升高菌膜形成量先升高后降低,溫度30 ℃時(shí)菌膜形成量最大;酸堿脅迫下,pH小于或大于7.0時(shí),菌膜的形成受到抑制,pH7.0時(shí)菌膜形成量最大;營(yíng)養(yǎng)脅迫下,添加葡萄糖有利于菌膜形成,添加4%葡萄糖有明顯的促進(jìn)菌膜形成的效果;滲透脅迫下,低濃度的氯化鈉對(duì)蠟樣芽孢桿菌菌膜形成有促進(jìn)作用,高濃度的氯化鈉對(duì)菌膜形成有抑制作用,添加0.5%氯化鈉有明顯的促進(jìn)菌膜形成的效果;防腐脅迫下,食品防腐劑濃度為0.15%高于濃度為0.10%時(shí)的菌膜形成量,在食品加工中不能僅憑加入食品防腐劑而疏忽對(duì)菌膜的控制。

蠟樣芽孢桿菌,菌膜,玻璃表面,脅迫因素

食源性致病菌嚴(yán)重危害著人們的健康,全球每年因食源性疾病而發(fā)病的人數(shù)約10億人,美國(guó)每年約有4800萬(wàn)人患病,12.8萬(wàn)人入院接受治療[1],我國(guó)平均每6個(gè)人中就有1人次罹患食源性疾病[2]。蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus,簡(jiǎn)稱B.cereus)是常見的食源性致病菌之一,廣泛存在于土壤、空氣、水和塵埃中[3]極易污染食物,污染后在感官無(wú)明顯變化,很容易誤食而發(fā)生中毒[4],引起惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉等[5-6],同時(shí)B.cereus具有極強(qiáng)的菌膜形成能力,以及由此能力賦予的極強(qiáng)的抗逆生存和致病能力。據(jù)美國(guó)國(guó)家健康研究所和疾控中心報(bào)道,超過(guò)65%的由微生物引起的疾病與菌膜有關(guān)[7]。

菌膜是微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中為適應(yīng)生存環(huán)境而形成的一種與浮游菌相對(duì)應(yīng)的菌細(xì)胞群體,它附著于活力組織或無(wú)活力組織表面,由其產(chǎn)生的細(xì)胞外多聚基質(zhì)包裹的菌體細(xì)胞構(gòu)成[8]。在自然環(huán)境中B.cereus主要以生物菌膜的形式存在[9]即菌體被自身所分泌的胞外聚合物包裹聚集而形成生物群落。B.cereus在食品加工、包裝、儲(chǔ)存等過(guò)程中容易黏附于不銹鋼、有機(jī)玻璃、聚氯乙烯及玻璃等非生物表面并形成生物菌膜[10]一旦形成生物菌膜,不僅會(huì)污染食品,增加設(shè)備清洗難度,還會(huì)給食品加工、貯運(yùn)設(shè)備帶來(lái)嚴(yán)重危害,引起食品安全問(wèn)題[11-12]。

研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)細(xì)菌形成生物菌膜一般經(jīng)過(guò)粘附、聚集、成熟、分散等過(guò)程,環(huán)境因素如溫度、pH、碳源、無(wú)機(jī)鹽、培養(yǎng)時(shí)間等對(duì)其影響很大[13],食品加工環(huán)境營(yíng)養(yǎng)豐富,存在高糖高酸高鹽等多種脅迫因素,使食源性致病菌容易在各種加工及非加工接觸面等處形成生物菌膜,增加食品受微生物污染機(jī)率成為威脅食品安全的重大隱患。因此本文以B.cereus為受試菌,模擬食品加工過(guò)程中溫度脅迫、酸堿脅迫、營(yíng)養(yǎng)脅迫、滲透脅迫、防腐劑脅迫等外源條件,采用超聲波平板菌落計(jì)數(shù)和結(jié)晶紫染色法研究玻璃載體上該菌菌膜形成的變化趨勢(shì),為實(shí)際生產(chǎn)中有效控制B.cereus及其菌膜的形成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)(CMCC63303) 由上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基 購(gòu)于北京陸橋生物技術(shù)有限公司。

山梨酸鉀、苯甲酸鈉、氯化鈉、葡萄糖、硫酸、氫氧化鈉等 均為分析純,天津市盛淼精細(xì)化工有限公司;結(jié)晶紫 天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心。

SK2200H超聲波清洗器 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司;FE20 PLUS pH計(jì) 上海梅特勒托利多儀器有限公司;LDZX-40SCI型高壓滅菌鍋 上海早安醫(yī)療器械廠;LHS-150SC恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;FA2104N電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備 將B.cereus標(biāo)準(zhǔn)菌株用LB肉湯30 ℃培養(yǎng)18 h后取1 mL純菌液,用無(wú)菌蒸餾水依次稀釋10-1～10-7倍共7個(gè)濃度梯度(依次標(biāo)記為1～7號(hào))。取1～7號(hào)梯度菌液1 mL加入15 mL的融化并冷卻到45 ℃左右無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,冷凝后于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)(各梯度純菌懸液分別設(shè)3個(gè)重復(fù),并計(jì)算三個(gè)重復(fù)的計(jì)數(shù)平均值),1～7號(hào)梯度菌液計(jì)數(shù)結(jié)果分別為5.2×108～5.2×102CFU/mL,于4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 載體的清洗 將載體玻璃片(規(guī)格10 mm×10 mm)用洗滌劑清洗,置于丙酮中超聲15 min,除去表面油脂,再用蒸餾水沖洗干凈后置于75%的乙醇浸泡30 min,蒸餾水沖凈,烘干后滅菌備用。然后放入裝有10 mL LB肉湯的15 mm×150 mm試管中,滅菌備用。

1.2.3 菌膜的培養(yǎng) 滅菌培養(yǎng)皿中加入10 mL LB肉湯培養(yǎng)基中(滅菌)和放入已滅菌的玻璃片,接入0.1% 108CFU/mLB.cereus菌懸液,混合均勻,30 ℃培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng),隔天換液。

1.2.4B.cereus菌膜活菌計(jì)數(shù) 前處理及超聲:去除培養(yǎng)24 h菌膜的培養(yǎng)液,用無(wú)菌磷酸緩沖溶液反復(fù)沖洗,洗去浮游菌,再取10 mL無(wú)菌磷酸緩沖液加入到試管中,并用超聲波清洗儀(振蕩頻率為45 Hz)處理15 min。稀釋及培養(yǎng):從經(jīng)過(guò)超聲波清洗儀處理后的試管中吸取1 mL菌液,沿管壁慢慢注入含有9 mL無(wú)菌水的試管內(nèi),搖勻,梯度稀釋后制成10-3、10-4、10-5稀釋度的菌懸液,各取1 mL,分別加入培養(yǎng)皿內(nèi)(每個(gè)稀釋度做3個(gè)培養(yǎng)皿),再向培養(yǎng)皿中傾注約15 mL融化并冷卻到45 ℃左右無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,冷凝后,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后取出,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

總菌落數(shù)(cm2)=(同一稀釋度3個(gè)平皿上的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10)/玻璃片的面積

1.2.5 結(jié)晶紫染色法觀察菌膜 從培養(yǎng)皿中取出培養(yǎng)一定時(shí)間的菌膜載體,經(jīng)滅菌多次充分漂洗,去掉浮游菌,置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中,加入3 mL甲醇固定15 min,在每個(gè)平皿中加入3 mL 2%結(jié)晶紫染色5 min后,自來(lái)水沖洗干凈,室溫下干燥30 min,再加入3 mL 33%冰醋酸脫色,晾干后光學(xué)顯微鏡下(100×10)觀察。

1.2.6B.cereus菌膜生長(zhǎng)曲線的繪制 將11個(gè)玻璃片分別放入裝有10 mL LB肉湯培養(yǎng)基的試管中,滅菌后,冷卻至室溫,分別接入0.1% 108CFU/mL的B.cereus菌懸液,將試管放在30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、16、20、24、48、72 h后,對(duì)菌膜進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.7 不同脅迫因素對(duì)B.cereus菌膜形成的影響分析 玻璃片為載體材料,以B.cereus菌膜的活菌數(shù)lg(CFU/cm2)為指標(biāo),考察各脅迫因素(溫度、pH、營(yíng)養(yǎng)、高滲、防腐劑)對(duì)B.cereus菌膜形成的影響。

為提高未成年人的法律意識(shí)，積極貫徹落實(shí)《學(xué)?！捌呶濉逼辗▽?shí)施方案》，大力開展法律知識(shí)講座。利用邀請(qǐng)法制副校長(zhǎng)到校開展講座、觀看未成年人普法宣傳片、舉行法律知識(shí)競(jìng)賽等活動(dòng)為載體，在未成年人中開展法制宣傳和法律知識(shí)教育，使學(xué)生從小養(yǎng)成守法懂法的良好習(xí)慣。通過(guò)制作宣傳版面、設(shè)計(jì)宣傳櫥窗、校園紅領(lǐng)巾廣播站設(shè)置法律法規(guī)宣傳欄目等方式，積極宣傳《憲法》《未成年人保護(hù)法》《教育法》《義務(wù)教育法》等法律法規(guī)，促使學(xué)生增強(qiáng)法律意識(shí)，提升依法保護(hù)自己的能力，提升運(yùn)用法律法規(guī)的意識(shí)。

1.2.7.1 不同溫度脅迫對(duì)B.cereus菌膜形成的影響 把玻璃片分別放入裝有10 mL LB培養(yǎng)基的試管中,加入0.1 mL初始菌懸液濃度108CFU/mL的B.cereus菌懸液分別在4、25、30、50、60、70 ℃條件下培養(yǎng)24 h,進(jìn)行B.cereus菌膜活菌數(shù)的測(cè)定。

1.2.7.2 不同酸堿脅迫對(duì)B.cereus菌膜形成的影響 把玻璃片分別放入pH為3、5、7、9、11的10 mL LB培養(yǎng)基試管中滅菌,然后加入0.1 mL初始菌懸液濃度108CFU/mL的B.cereus菌懸液,在30 ℃條件下培養(yǎng)24 h,進(jìn)行B.cereus菌膜活菌數(shù)的測(cè)定。

1.2.7.3 不同營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)B.cereus菌膜形成的影響 把玻璃片分別放入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、2%、4%、6%、8%、10%葡萄糖的10 mL LB培養(yǎng)基試管中滅菌,然后加入0.1 mL初始菌懸液濃度108CFU/mL的B.cereus菌懸液,在30 ℃條件下培養(yǎng)24 h,進(jìn)行B.cereus菌膜活菌數(shù)的測(cè)定。

1.2.7.4 不同滲透脅迫對(duì)B.cereus菌膜形成的影響 把玻璃片分別放入NaCl濃度分別為0、0.5%、4%、6%、8%、10%、12%的10 mL LB培養(yǎng)基試管中滅菌,然后加入0.1 mL初始菌懸液濃度108CFU/mL的B.cereus菌懸液,30 ℃下培養(yǎng)24 h,進(jìn)行B.cereus菌膜活菌數(shù)的測(cè)定。

1.2.7.5 不同防腐脅迫對(duì)B.cereus菌膜形成的影響 把玻璃片分別放入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、0.02%、0.05%、0.10%、0.15%的食品防腐劑(苯甲酸鈉、山梨酸鉀)的10 mL LB培養(yǎng)基試管中滅菌,然后加入0.1 mL初始菌懸液濃度108CFU/mL的B.cereus菌懸液,在30 ℃條件下培養(yǎng)24 h,進(jìn)行B.cereus菌膜活菌數(shù)的測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用EXCEL軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1B.cereus菌膜生長(zhǎng)曲線

圖1 B.cereus菌膜形成數(shù)隨時(shí)間的變化Fig.1 Changes of the formation of B. cereus biofilms over time

2.2 不同脅迫因素對(duì)B.cereus菌膜形成的影響分析

2.2.1 不同溫度脅迫對(duì)B.cereus菌膜形成的影響 由圖2可知,培養(yǎng)溫度在4～30 ℃時(shí),B.cereus菌膜的活菌數(shù)隨溫度的升高而升高,4 ℃菌膜的活菌數(shù)為4.30(lg(CFU/cm2),30 ℃菌膜的活菌數(shù)達(dá)到6.58(lg(CFU/cm2),但超過(guò)30 ℃時(shí),隨溫度的增加菌膜的活菌數(shù)反而有所減少,50 ℃菌膜的活菌數(shù)為4.36(lg(CFU/cm2),60、70 ℃菌膜活菌數(shù)為0(lg(CFU/cm2)。圖3表示在玻璃載體上培養(yǎng)24 h且經(jīng)過(guò)結(jié)晶紫染色后用顯微鏡觀察B.cereus菌膜照片,其中,圖3a,即空白玻璃片觀察到的圖片,無(wú)紫色菌體;圖3b,4 ℃培養(yǎng)可見菌體相連呈清晰的紫色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);圖3c,25 ℃培養(yǎng),菌體密度明顯增大;圖3d,30 ℃培養(yǎng)大量菌體相連呈紫色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且菌體數(shù)目明顯大幅增加,局部菌體大量密集呈團(tuán)狀;圖3e,50 ℃菌體零星散落但仍可看見有部分網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);圖3f,60 ℃菌體嚴(yán)重變形,死亡菌體粗壯無(wú)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);圖3g,70 ℃菌體零星散落,無(wú)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

圖2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)B.cereus形成數(shù)的影響Fig.2 Effect of temperature on the formation of B. cereus biofilms

圖3 結(jié)晶紫染色法觀察不同培養(yǎng)溫度對(duì)B.cereus菌膜形成數(shù)的影響Fig.3 Effect of temperature on the formation of B. cereus biofilms by crystal violet staining注:a空白玻璃片;b～g分別表示4、25、30、50、60、70 ℃ B. cereus菌膜在顯微鏡(100×10)觀察圖。

因此,溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)菌膜形成數(shù)產(chǎn)生較大影響,30 ℃時(shí)B.cereus菌膜形成量最大,這與浮游態(tài)B.cereus的最適生長(zhǎng)溫度一致。同時(shí),圖1、圖2表明不僅室溫(25 ℃)條件下可以生成B.cereus菌膜,甚至低溫(4 ℃),高溫(50 ℃)都可形成,高溫脅迫刺激會(huì)有利于蠟樣芽孢桿菌菌膜形成,這一結(jié)果與Rode 等[15]報(bào)道的亞最適生長(zhǎng)溫度有利于金黃色葡萄球菌菌膜形成較一致,表明生產(chǎn)過(guò)程中及時(shí)清潔和有效除菌的必要性。

2.2.2 不同酸堿脅迫對(duì)B.cereus菌膜形成的影響 圖4為不同 pH對(duì)B.cereus菌膜形成的影響,培養(yǎng)基pH在3～7時(shí),菌膜形成數(shù)隨 pH增加呈不斷上升趨勢(shì),當(dāng)pH在7～11 時(shí),菌膜形成數(shù)明顯下降,pH7時(shí),菌膜形成數(shù)達(dá)到最大值為6.32(lg(CFU/cm2),說(shuō)明偏酸或偏堿環(huán)境對(duì)B.cereus菌膜的形成會(huì)受到抑制;同時(shí)采用結(jié)晶紫染色觀察pH對(duì)菌膜形成的影響,圖5a,當(dāng)pH3時(shí),菌粘附與玻片,菌膜成團(tuán)聚集呈粘液狀相連,表面較強(qiáng)的酸度對(duì)菌體形狀有顯著影響;圖5b,pH5時(shí)菌體散開,菌體相連呈較為清晰的紫色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);圖5c,pH7時(shí),大量菌體相連呈紫色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)局部菌體大量密集呈團(tuán)狀;圖5d,pH9時(shí),菌體密集度大幅度減小,部分粘液相連菌體,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較少;圖5e,當(dāng)pH11時(shí),偶見散落的紫色菌體,無(wú)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。與圖4分析結(jié)果相吻合,pH7時(shí)B.cereus菌膜形成量最大,這與李南薇等[16]在不銹鋼片表面的研究結(jié)果一致。

圖4 不同pH對(duì)B.cereus菌膜形成數(shù)的影響Fig.4 Effect of pH on the formation of B.cereus biofilms

圖5 結(jié)晶紫染色法觀察不同pH對(duì)B.cereus菌膜形成數(shù)的影響Fig.5 Effect of pH on the formation of B.cereus biofilms by crystal violet staining注:a～e分別表示pH為2、5、7、9、11時(shí) B.cereus菌膜在顯微鏡(100×10)觀察圖。

2.2.3 不同營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)B.cereus菌膜形成的影響 如圖6所示,葡萄糖添加量<10%的范圍,菌膜形成量均大于不添加葡萄糖的菌膜形成量;在0～4%時(shí)隨著添加量增加B.cereus菌膜形成量呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì),當(dāng)添加量為4%時(shí)B.cereus菌膜形成量為最大,達(dá)7.48(lg(CFU/cm2)是不添加葡萄糖時(shí)的1.70倍,同時(shí)采用結(jié)晶紫染色觀察葡萄糖濃度對(duì)菌膜形成量的影響,圖7a,不添加葡萄糖的觀察圖,紫色菌體相連;圖7b,添加葡萄糖2%的觀察圖,紫色菌體相連密度增大;圖7c,添加葡萄糖4%的觀察圖,菌體密集成團(tuán),結(jié)構(gòu)粗壯,呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);圖7d,添加葡萄糖6%的觀察圖,菌體密度減弱,形態(tài)無(wú)變化,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)減弱;圖7e,添加葡萄糖8%的觀察圖,菌體密度減弱,菌體相連度減弱,見紫色散落菌體;圖7f,添加葡萄糖10%的觀察圖,菌體密度進(jìn)一步減弱,見紫色散落菌體。整體來(lái)看,添加葡萄糖有利于B.cereus菌膜形成,揭示富營(yíng)養(yǎng)條件有利于B.cereus菌膜形成。在低濃度時(shí)B.cereus菌膜形成量隨葡萄糖濃度增加而升高,當(dāng)葡萄糖濃度超過(guò)4%時(shí),菌膜形成量反而降低,這與馬悅等[17]對(duì)B.cereus在PMMA、PVC載體研究結(jié)果一致,當(dāng)碳源物質(zhì)一旦超過(guò)一定限度,高濃度的葡萄糖產(chǎn)生高滲透壓,抑制B.cereus菌膜的形成。

圖6 B.cereus菌膜形成數(shù)隨葡萄糖濃度的變化Fig.6 Changes of the formation of B. cereus biofilms over glucose concentration

圖7 結(jié)晶紫染色法觀察B.cereus菌膜隨葡萄糖濃度的變化Fig.7 Changes of the formation of B. cereus biofilms over glucose concentration by crystal violet staining注:a～f分別表示添加葡萄糖濃度為0%、2%、4%、6%、8%、10%時(shí)B. cereus菌膜在顯微鏡(100×10)觀察圖。

2.2.4 不同滲透脅迫對(duì)B.cereus菌膜形成的影響 圖8為NaCl對(duì)B.cereus菌膜形成量的結(jié)果,添加NaCl促進(jìn)了菌膜的形成,隨著添加量的增加,B.cereus菌膜形成量先增后減,當(dāng)NaCl添加量為0.5%時(shí)菌膜形成量最大,當(dāng)NaCl濃度進(jìn)一步增大,菌膜形成量逐漸降低;同時(shí)采用結(jié)晶紫染色觀察NaCl濃度對(duì)菌膜形成量的影響,圖9a紫色菌體相連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);圖9b大量菌體相連呈紫色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)局部菌體大量密集呈團(tuán)狀;圖9c,菌體部分呈團(tuán)狀部分粘連;圖9d,菌體零星散落,單個(gè)存在未觀察到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);圖9e～圖9g,散落菌體很少,幾乎無(wú)菌膜存在。表明,低滲脅迫對(duì)菌膜形成有利,而隨著NaCl濃度增強(qiáng),B.cereus菌膜總量逐漸減少,可能是由于高濃度的NaCl,導(dǎo)致細(xì)胞微生物細(xì)胞脫水死亡從而抑制菌膜的形成。

圖8 B.cereus菌膜形成數(shù)隨氯化鈉濃度的變化Fig.8 Changes of the formation of B.cereus biofilms over sodium chloride concentration

圖9 結(jié)晶紫染色法觀察B.cereus菌膜隨氯化鈉濃度的變化Fig.9 Changes in the formation of B.cereus biofilms over sodium chloride concentrationby crystal violet staining注:a～f分別表示添加NaCl濃度為0%、0.5%、4%、6%、8%、10%、12% B.cereus菌膜在顯微鏡(100×10)觀察圖。

2.2.5 不同防腐脅迫對(duì)B.cereus菌膜形成的影響 苯甲酸鈉(pH2.5～pH4.0)在食品中的限量值為0.2～1.0 g/kg,山梨酸鉀(pH5.0～pH6.0)在食品中的限量值0.2～2.0 g/kg,以0.02%、0.05%、0.10%、0.15%添加量加入到培養(yǎng)液中觀察防腐劑對(duì)B.cereus菌膜形成的影響。由圖10可知,不同濃度的不同防腐劑對(duì)B.cereus菌膜形成的影響不同,添加0.02%苯甲酸鈉B.cereus菌膜形成量是添加該濃度山梨酸鉀的1.03倍,而當(dāng)添加0.05%山梨酸鉀的菌膜形成量是該濃度苯甲酸鈉的1.31倍?？傮w來(lái)看，添加防腐劑,菌膜的形成量會(huì)減少但并不呈直線下降趨勢(shì),而當(dāng)添加高濃度防腐劑時(shí)菌膜形成量反而升高,如添加防腐劑濃度為0.15%時(shí),不論是山梨酸鉀還是苯甲酸鈉菌膜形成量均高于添加防腐劑濃度為0.10%時(shí)的形成量,因?yàn)榉栏瘎┠軌蛞种莆⑸锏纳L(zhǎng),而當(dāng)菌膜菌在形成菌膜后,一旦處于不利環(huán)境(過(guò)高濃度防腐劑),為了保護(hù)自己反而會(huì)形成更多的菌膜,這對(duì)食品加工中菌膜的防治又提出了新的考驗(yàn),在加工中不能僅憑加入食品防腐劑便疏忽對(duì)菌膜的控制。

圖10 防腐劑對(duì)B.cereus菌膜形成數(shù)的影響Fig.10 Effect of preservatives on B. cereus biofilms formation

3 結(jié)論

B.cereus可在玻璃表面形成菌膜,培養(yǎng)時(shí)間24 h時(shí),當(dāng)溫度30 ℃,pH7.0,形成B.cereus菌膜量最大。同時(shí)多種脅迫因素也會(huì)形成B.cereus菌膜,溫度脅迫下,低溫4 ℃、高溫50 ℃均能形成菌膜;酸堿脅迫下,pH小于或大于7.0時(shí),菌膜的形成受到抑制;營(yíng)養(yǎng)脅迫下,添加葡萄糖有利于B.cereus菌膜形成,揭示富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境有利于B.cereus菌膜形成,4%葡萄糖有明顯的促進(jìn)菌膜形成的效果;滲透脅迫下,添加低濃度的NaCl(0.5%)對(duì)B.cereus形成有促進(jìn)作用而高濃度的NaCl(大于4%)對(duì)菌膜形成抑制作用明顯;防腐脅迫下,在食品可添加的最高限量防腐劑濃度下仍能形成B.cereus菌膜,甚至0.15%防腐劑B.cereus菌膜形成量高于0.10%的菌膜形成量。菌膜的形成嚴(yán)重阻礙了致病菌的消除,它就像細(xì)菌的保護(hù)傘,增強(qiáng)了細(xì)菌對(duì)外界不利條件的抵抗力,因此,在食品加工中為有效防止菌膜的形成,首先應(yīng)嚴(yán)格控制食品加工過(guò)程微生物的存在,尤其是致病菌,不能僅憑加入食品防腐劑便疏忽對(duì)菌膜的控制,其次對(duì)加工設(shè)備和包裝容器進(jìn)行嚴(yán)格清洗,防止有糖份殘留滋生菌膜,最后對(duì)低溫加工車間及冷庫(kù)也應(yīng)加強(qiáng)菌膜控制,有效抑制低溫菌及其菌膜存在。

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Effects of stress factors on the formation ofBacilluscereusbiofilm on glass surfaces

XIA Jun-fang,LIU Xia,LI Xiao-yan,ZHANG Zhen-zhen,GuLi-nazi, MA Yao,Mu-Li-deng,WANG Wei,ZHANG Ya-nan,WU Yun*

(College of Food Science and Pharmacy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

Biofilms formed by foodborne pathogenic bacteriaBacilluscereuswas used as material,the effect of food processing temperature stress,pH stress,nutritional stress,osmotic stress and preservatives stress on the formation ofBacilluscereusbiofilms were investigated,and the formation of the biofilms were measured by ultrasonic plate method and observed crystal violet staining. The results showed that under the temperature stress,theBacilluscereusbiofilm formed at 4 ℃ and 50 ℃,the formation of biofilms were increased then decreased with increasing temperature,Bacilluscereusformed stable biofilms at 30 ℃. Under the pH stress,when the pH was less or more than 7.0,the formation of biofims were significantly reduced,Bacilluscereusformed stable biofilms at pH7.0. Under the stress of nutrition,the abilities of biofilms formation would be improved by adding proper glucose in culture medium and the 4% glucose had obvious effect on promoting the formation ofBacilluscereusbiofilms. Under the osmotic stress,low concentration of sodium chloride promoted the formation ofBacilluscereusbiofilms,high concentration of sodium chloride could inhibit the formation ofBacilluscereusbiofilms and the 0.5% sodium chloride had obvious effect on promoting the formation ofBacilluscereusbiofilms. Under preservative stress,theBacilluscereusbiofims of adding 0.15% food preservative were higher than 0.10%. In the food processing,it would not neglect controling bacteria biofilms just only adding food preservatives.

Bacilluscereus;biofilm;glass surfaces;stress factors

2016-10-24

夏俊芳(1986-)，女，碩士，講師，主要從事食品微生物安全控制,E-mail:junfangxia@126.com。

*通訊作者:武運(yùn)(1965-)，女，碩士，教授，主要從事食品生物技術(shù)研究，E-mail:wuyunster@sina.com。

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)校前期資助課題(XJAU201522)。

TS201.3

B

1002-0306(2017)07-0105-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.012