吳 杰 ， 項(xiàng) 勛，趙屹欽，鄧紫艷，王世玉，常 華

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201)

?

微孢子蟲研究進(jìn)展

吳 杰 ， 項(xiàng) 勛，趙屹欽，鄧紫艷，王世玉，常 華*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201)

微孢子蟲是人類、哺乳類、昆蟲等脊椎動(dòng)物以及無脊椎動(dòng)物專性細(xì)胞的寄生真核生物，是常見的人獸共患寄生原蟲。目前已有14種微孢子蟲被報(bào)道能夠感染人類并致病，在獸醫(yī)公共衛(wèi)生方面也是比較重要的問題之一。論文從微孢子蟲的病原學(xué)、蛋白質(zhì)研究、檢測(cè)技術(shù)及防治等方面進(jìn)行綜述。

微孢子蟲；病原學(xué)；檢測(cè)；分子生物學(xué)

微孢子蟲(Microsporidia)廣泛分布于脊椎、無脊椎動(dòng)物中，包括兩棲類、哺乳類、昆蟲以及人類，是一種原蟲病，多見于魚類[1]、蠶業(yè)中。在19世紀(jì)50年代中期，整個(gè)歐洲的蠶絲產(chǎn)業(yè)都受到嚴(yán)重威脅，迫使人們不得不對(duì)病因進(jìn)行研究，在此過程中發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲。該家蠶微孢子蟲是第一種被記錄的微孢子蟲[2]。

微孢子蟲缺少真核生物中常見的細(xì)胞器，包括高爾基體、線粒體、過氧化物酶體等，而且核糖體結(jié)構(gòu)與原核生物的相似。最初認(rèn)為微孢子蟲是缺乏線粒體的，但是有研究發(fā)現(xiàn)，微孢子蟲中具有線粒體的分子痕跡[3]。1995年，Clark C和Roger A在溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoebahistolytica)中發(fā)現(xiàn)能夠編碼線粒體蛋白的相關(guān)基因，并確認(rèn)該生物為一種古真核生物；隨后在蝗蟲微孢子蟲中發(fā)現(xiàn)了與真核生物線粒體很相似的熱激蛋白HSP70。在蝗蟲微孢子蟲與兔腦炎微孢子蟲(Enterocytozooncuniculi)基因組中也發(fā)現(xiàn)與線粒體相關(guān)基因。因此，研究者認(rèn)為微孢子蟲的線粒體結(jié)構(gòu)是在進(jìn)化中丟失，并非一開始就沒有。

近年來，隨著感染微孢子蟲人群的增多，對(duì)微孢子蟲的檢測(cè)方法也越來越多，國(guó)內(nèi)外較為常用的為套式PCR技術(shù)[4]，與多位點(diǎn)序列分型技術(shù)[5-7]對(duì)MS1、MS3、MS4、MS7等4個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行分析研究。微孢子蟲多感染AIDS病人，并致使患者腹瀉等，現(xiàn)在還沒有有效的藥物對(duì)其進(jìn)行治療。本文從微孢子蟲的病原學(xué)、蛋白質(zhì)研究及檢測(cè)、防治等方面進(jìn)行闡述，為今后研究提供參考。

1 病原學(xué)

1.1 病原種類

目前，在世界上報(bào)道的1 400種微孢子中有8屬14個(gè)種被發(fā)現(xiàn)能夠使人類感染，其中的畢氏腸微孢子蟲(E.bieneusi)、兔腦炎微孢子蟲(Enterocytozooncuniculi)、海倫腦炎微孢子蟲(E.hellem)、腸腦炎微孢子蟲(E.intestinalis)是感染人類比較普通的，且孢子較小的4種微孢子蟲。僅僅由畢氏腸微孢子蟲對(duì)人類造成的感染，就達(dá)到90%以上。

1.2 生活史

一般可將微孢子蟲的生活史分為3個(gè)時(shí)期。在第1時(shí)期，也稱感染階段，微孢子蟲將其孢子釋放到環(huán)境中，將具有感染性的孢子內(nèi)容物，攝入到宿主細(xì)胞內(nèi)；在第2時(shí)期，即裂體增殖，微孢子蟲即在細(xì)胞內(nèi)繁殖；在第3時(shí)期孢子增殖階段，即可形成感染性的孢子。

1.3 流行病學(xué)

1.3.1 國(guó)內(nèi)外研究概況 在1857年微孢子蟲首次發(fā)現(xiàn)于蠶中，這使得當(dāng)時(shí)歐洲蠶絲產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)大幅度下滑[8]。1922年首次在兔體內(nèi)發(fā)現(xiàn)感染微孢子蟲。1959年，Matsubayashi等在日本報(bào)道了第1例人類微孢子蟲病的病例。調(diào)查發(fā)現(xiàn)是一位疑似吃過鮭魚的9歲男孩體中發(fā)現(xiàn)[9]。目前，我國(guó)關(guān)于人類感染微孢子蟲的報(bào)道較少，只有劉淑萍等[10]曾報(bào)道過微孢子蟲，而且發(fā)現(xiàn)其會(huì)與其他原蟲混合感染的病例和感染腦腸炎微孢子蟲的病例。

1.3.2 分布 現(xiàn)今的微孢子蟲呈世界范圍分布，在北美洲、歐洲、澳洲、非洲等地多次報(bào)道。起初，微孢子蟲被認(rèn)為多感染于AIDS病人[11]，有報(bào)道稱這類患者的微孢子蟲感染率高達(dá)9%～50%, 而且微孢子蟲的發(fā)病不受季節(jié)影響。該寄生蟲主要感染AIDS病人，一般感染AIDS病人的多為畢氏微孢子蟲與腦腸炎微孢子蟲，且寄生于十二指腸下段至空腸上段。感染微孢子蟲的病人，一般表現(xiàn)為持續(xù)性或慢性腹瀉。微孢子蟲之所以會(huì)使人類致病，是被吞食的成熟孢子在小腸絨毛上皮細(xì)胞復(fù)制，導(dǎo)致腸絨毛縮短。而且有些絨毛覆蓋面積也減少，從而導(dǎo)致病人出現(xiàn)吸收不良伴有腹瀉。該寄生蟲還會(huì)隨血液循環(huán)到達(dá)其他組織，再次對(duì)人體造成感染。尤其是使人免疫功能遭到破壞。隨著檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)，在健康人群中也逐漸發(fā)現(xiàn)病例。其中器官移植者、兒童與老年人是最易感染微孢子蟲人群?；颊邥?huì)產(chǎn)生急性、限行腹瀉等癥狀。微孢子蟲可以寄生在人體肺、膽管、腸道、肝臟等組織，也會(huì)感染人的眼部，因而可能引起不同病癥，如角膜結(jié)膜炎、腹瀉、肺部感染、肝炎、膽囊炎、皮膚潰爛等。

2 微孢子蟲的蛋白

2.1 表面蛋白

最早日本科學(xué)家河原畑勇等[12]將家蠶Nosema屬通過表面抗原蛋白的結(jié)構(gòu)、組分等差異來給家蠶微孢子蟲分類。當(dāng)時(shí)將其區(qū)別為Bombycis型、M11型、M12型3種。而在中國(guó)陳祖佩等[13]也對(duì)不同微孢子蟲的表面抗原蛋白差異進(jìn)行了探究，采用5 g/LK2CO3提取3種家蠶微孢子蟲的表面抗原蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3種表面抗原蛋白并無共同成分存在。崔紅娟等[14]將去除表面蛋白的微孢子蟲，使其感染家蠶，發(fā)現(xiàn)表面蛋白被去除掉后，微孢子蟲發(fā)病緩慢，結(jié)果說明其表面蛋白對(duì)家蠶致病性或有一定影響。趙唯希等[15]在分離家蠶微孢子蟲表面蛋白時(shí)，采用0.1mol/L NaOH裂解液與超聲波破碎法提取總蛋白，并用SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，結(jié)果可見微孢子蟲表面蛋白表達(dá)豐富。

2.2 孢壁蛋白

張坤等[16]在研究中發(fā)現(xiàn)了Aloc SWP2蝗蟲微孢子蟲孢壁蛋白，并通過RNAi 干擾、侵染成功對(duì)該蛋白的轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行了干擾，感染后的宿主東亞飛蝗蛻皮困難，中腸出現(xiàn)了嚴(yán)重的潰爛，脂肪體含量低微，出現(xiàn)死亡，進(jìn)行干擾后使蝗蟲的死亡過程大幅延長(zhǎng)。李艷紅[17]則利用免疫沉淀-蛋白印跡-質(zhì)譜的方法分析與鑒定蠶微孢子蟲的孢壁蛋白單克隆抗體的靶蛋白。試驗(yàn)中成功獲得抗原蛋白，該抗原蛋白與SWP26孢壁蛋白單克隆抗體是相對(duì)應(yīng)的。譚小輝等[18]通過碳酸鉀溶液誘導(dǎo)家蠶微孢子蟲發(fā)芽，然后將其進(jìn)密度梯度離心，獲取到了SWP32和SWP25孢壁蛋白。試驗(yàn)同時(shí)驗(yàn)證這兩種孢壁蛋白是由孢殼脫落的可能。

2.3 微管蛋白

家蠶微孢子蟲的極管是由極管蛋白PTP1、PTP2 和 PTP3組成[19]。肖圣燕等[20-22]利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù) (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù)克隆獲得了從家蠶分離出的內(nèi)網(wǎng)蟲屬微孢子內(nèi)網(wǎng)蟲屬微孢子蟲Endoreticulatussp. Zhenjiang α-微管蛋白基因cDNA，并通過生物信息軟件對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了探究。高永珍等通過SDS-PAGE法對(duì)家蠶微孢子蟲和藍(lán)螢葉甲微孢子的極絲蛋白進(jìn)行分析。

3 檢測(cè)

因微孢子蟲極小，通常是染色后再進(jìn)行觀察，常用的染色方法有KMnO4-甲基紫法、抗酸的三色染色法、熒光染色劑Calcofluor M2R 染色法等，雖然這些通過染色進(jìn)行觀察的方法比母蛾鏡檢法的檢出率要高。但這些方法一般都不能將微孢子蟲鑒定到種。因電子顯微鏡觀察操作步驟繁瑣、耗時(shí)、費(fèi)用高等，也不作為常規(guī)檢測(cè)方法。

隨著免疫學(xué)檢測(cè)方法的不斷發(fā)展，已有多種方法被逐漸應(yīng)用。這些方法有熒光抗體檢測(cè)法、環(huán)狀凝聚法、玻片凝聚法、酶聯(lián)免疫吸附法、單抗間接ELISA等。李艷紅等在2006年用間接免疫熒光方法檢測(cè)體外培養(yǎng)細(xì)胞系中的家蠶微孢子蟲及極絲彈出過程，研究發(fā)現(xiàn)多克隆抗體按1∶100稀釋可看到較強(qiáng)熒光的微孢子蟲，為黃綠色熒光[23]。姜義仁等[24]采用c-ELISA檢測(cè)柞蠶微孢子蟲，該方法靈敏度可達(dá)1.6×105spores/mL。但免疫學(xué)檢測(cè)法在實(shí)際操作中缺乏穩(wěn)定性。

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼采用PCR等分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行研究?，F(xiàn)在普遍用套氏PCR技術(shù)對(duì)比氏微孢子蟲的ITS[25](轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))基因序列進(jìn)行擴(kuò)增,因?yàn)楹颂求wRNA的ITS在不同分離株之間差異較大，因而可以作為檢測(cè)比氏腸微孢子蟲的標(biāo)準(zhǔn)[26]。同時(shí)，與多位點(diǎn)序列分型技術(shù)對(duì)MS1、MS3、MS4、MS7位點(diǎn)進(jìn)行微孢子蟲的基因型分析研究。劉吉平等[27]設(shè)計(jì)了VIF/530R引物，該引物可以快速檢測(cè)家蠶微孢子蟲和近緣微孢子蟲，結(jié)果表明PCR 檢測(cè)家蠶微孢子蟲靈敏度可達(dá)到3×104Nb/mL。通過對(duì)以rRNA推定假基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用PCR對(duì)家蠶微孢子蟲進(jìn)行的檢測(cè)來判斷該方法的靈敏度。何永強(qiáng)、吳姍等采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)家蠶微孢子蟲的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。該實(shí)時(shí)熒光定量PCR避免了PCR檢測(cè)后電泳帶來的污染。

4 治療

目前尚未有對(duì)微孢子蟲病的特效藥物。有研究發(fā)現(xiàn)，煙曲霉素對(duì)治療結(jié)膜、角膜炎有明顯效果，一般為口服，每天60 mg，但煙曲霉素對(duì)患者會(huì)產(chǎn)生毒副作用。在治療初期就已表現(xiàn)出來，如腸胃痙攣、腹瀉、體重減輕等。蜜蜂微孢子蟲病也可以通過煙曲霉素[28]進(jìn)行治療，但會(huì)有藥物殘留在蜂蜜當(dāng)中，人類使用后會(huì)對(duì)機(jī)體造成一定的傷害。雖然商業(yè)合成的煙曲霉素藥劑具有較高穩(wěn)定性，降低了毒性，但其中添加二環(huán)己基胺(DCH)同樣具有毒性，也會(huì)產(chǎn)生藥物殘留，對(duì)人產(chǎn)生危害[29]。有研究表明，其衍生物TNP-470毒副作用較小，是較為有前景的抗微孢子蟲藥。阿苯達(dá)唑能夠?qū)ξ㈡咦酉x的發(fā)育、傳播等進(jìn)行有效的抑制，使相應(yīng)癥狀得到緩解，但停藥后病癥會(huì)再次發(fā)作。也有人試用滅滴靈，劑量為每天服用3次，每次約500 mg；或者服用丙硫咪唑每天2次，每次400 mg，但不會(huì)殺死蟲體，只對(duì)感染微孢子蟲而引起腹瀉的AIDS患者起緩解作用，一旦停藥，也會(huì)復(fù)發(fā)。另外，碘液對(duì)控制微孢子蟲也有一定的作用。

5 展望

近年來，微孢子蟲逐漸被認(rèn)為不僅可以感染AIDS病人，越來越多感染正常群體，逐漸引起大家關(guān)注，關(guān)于治療效果在獸醫(yī)公共衛(wèi)生健康問題中也備受關(guān)注。目前沒有特效藥物治療該病，給人和家畜的健康帶來困擾。由上述發(fā)現(xiàn)微孢子蟲的孢子內(nèi)部壓力變化與孢子發(fā)芽有關(guān)，孢子的發(fā)芽主要受Ca2+、pH等的影響。隨著孢子內(nèi)部壓力逐漸增高，孢子發(fā)芽加快。由此推測(cè)抑制孢子發(fā)芽產(chǎn)生可以減少侵染。而很多環(huán)境因子會(huì)對(duì)微孢子蟲的發(fā)芽造成影響，通過對(duì)萌發(fā)條件的改變，進(jìn)而使微孢子蟲病的暴發(fā)得到良好控制；也可以通過對(duì)微孢子蟲發(fā)育、傳播的抑制，從而對(duì)其進(jìn)行治療與控制。

[1] Lallo M A. Culture and propagation of microsporidia of veterinary interest[J]. J Vet Med Sci, 2016, 78(2): 171.

[2] Nageli K W. Uber die neue Krankheit der Seidenraupe und verwandte Organismen[J]. Bot Z, 1857, 15: 760-761.

[3] 向 恒, 潘國(guó)慶, 周澤揚(yáng). 微孢子蟲系統(tǒng)進(jìn)化研究的變遷與展望[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2014, 41(4): 734-743.

[4] 扈鴻霞, 馬宇軒, 王艷紅, 等. 蝗蟲微孢子蟲套式PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(21): 4239-4245.

[5] Karim M R, Wang R, He X, et al. Multilocus sequence typing of Enterocytozoon bieneusi in nonhuman primates in China[J]. Vet Parasitol, 2014, 200(1): 13-23.

[6] Li W, Cama V, Akinbo F O, et al. Multilocus sequence typing ofEnterocytozoonbieneusi: lack of geographic segregation and existence of genetically isolated sub-populations[J]. Infect Gene Evol, 2013, 14: 111-119.

[7] 刁瑞南. 東北地區(qū)隱孢子蟲及畢氏腸微孢子蟲系統(tǒng)進(jìn)化分析與多位點(diǎn)分型研究[D]. 黑龍江哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[8] 張建燕. 中國(guó)蜜蜂微孢子蟲種質(zhì)分布及侵染意蜂中腸的蛋白質(zhì)組分析[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2015.

[9] Matsubayashi H, Koike T, Mikata T, et al. A case ofEncephalitozoon-like-body infection in man[J]. AMA Arch Pathol, 1959, 67(2): 181-187.

[10] 劉淑萍, 李大年, 麻 琳, 等. 微孢子蟲腦炎一例臨床和病理表現(xiàn)史[J]. 中華神經(jīng)科雜志, 2008, 41(1): 41-48.

[11] Mirjalali H, Mohebali M, Mirhendi H, et al. Emerging intestinal microsporidia infection in HIV^ sup+^/AIDS patients in Iran: Microscopic and molecular detection[J]. Iranian J Parasitol, 2014, 9(2): 149.

[12] 河原畑勇, 早坂昭二. 家蠶病原性微粒子孢子表面抗原的特異性[J]. 九州蠶絲,1985,16:43-46.

[13] 陳祖佩, 崔紅娟. 家蠶 3 種微孢子蟲孢子表面抗原特性的研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1995, 8(3): 57-60.

[14] 崔紅娟, 周澤揚(yáng), 萬永繼, 等. 家蠶微孢子蟲表面抗原蛋白對(duì)家蠶致病性的影響[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 1999, 25(4): 261-262.

[15] 趙唯希. 家蠶微孢子蟲表面蛋白的鑒定研究[D]. 重慶：重慶師范大學(xué). 2015.

[16] 張 坤. 蝗蟲微孢子蟲侵染宿主的分子機(jī)制[D]. 黑龍江哈爾濱：黑龍江大學(xué), 2015.

[17] 李艷紅. 家蠶微孢子蟲(Nosemabombycis)孢壁蛋白 SWP26 的研究[D]. 重慶：西南大學(xué), 2008.

[18] 譚小輝, 潘國(guó)慶, 吳正理, 等. 家蠶微孢子蟲孢壁蛋白與其發(fā)芽的相關(guān)性[J]. 動(dòng)物學(xué)報(bào), 2008, 54(6): 1068-1074.

[19] 龍夢(mèng)嫻, 吳玉嬌, 陳 潔,等. 微孢子蟲極管蛋白的研究進(jìn)展[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2014(5):917-923.

[20] Pan G, Xu J, Li T, et al. Comparative genomics of parasitic silkworm microsporidia reveal an association between genome expansion and host adaptation[J]. BMC Genomics, 2013, 14(1): 1.

[21] 肖圣燕. 家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP25 互作蛋白的篩選及Endoreticulatussp. Zhenjiang α-微管蛋白的研究[D]. 江蘇鎮(zhèn)江：江蘇科技大學(xué), 2015.

[22] 高永珍, 黃可威, 常智杰. 家蠶病原性微孢子蟲極絲蛋白的研究[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2001, 27(2): 128-130.

[23] 李 田, 齊曉冉, 陶美林, 等. 4種微孢子蟲的分泌蛋白的比較基因組學(xué)分析[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2013，39(3): 527-536.

[24] 姜義仁, 王伯陽, 孫 影, 等. 間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA 法對(duì)柞蠶微孢子蟲的檢測(cè)[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2013(5): 1364-1370.

[25] 杜帥之, 潘廣林, 邵俊峰, 等. 秦嶺地區(qū)幾種珍稀動(dòng)物畢氏腸微孢子蟲基因分型[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2016, 36(5): 790-794.

[26] 刁瑞南, 肖立華, 宋銘忻, 等. 畢氏腸微孢子蟲基因分型及公共衛(wèi)生學(xué)重要性[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 36(12): 988-991.

[27] 劉吉平, 曹 陽, Smith J E, et al. 模擬感染家蠶微粒子病的 PCR 分子診斷技術(shù)研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004, 37(12): 1925-1931.

[28] 陳秀賢, 藺哲廣, 胡福良, 等. 煙曲霉素在防治蜜蜂孢子蟲病中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào), 2016, 38(3): 648-654.

[29] 曹葳蕤, 薛曉鋒, 吳黎明. 煙曲霉素及其防治蜜蜂微孢子蟲病的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2016(2): 8.

Progress on Microsporidia

WU Jie, XIANG Xun, ZHAO Yi-qin, DENG Zi-yan, WANG Shi-yu, CHANG Hua
(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan, 650201,China)

The microsporidia are obligate intracellular eukaryotic parasites, especially in vertebrates and invertebrates，such as the humans, mammals, insects, etc. and common zoonotic parasites. At present, there are 14 kinds of microsporidia which have been reported to be able to infect human and make people ill, it is one of the more important problems in veterinary public health. Therefore, this paper made a summary about the etiology of the microsporidia, the studies of protein, the detecting technology, prevention and cure, etc.

microsporidia; etiology; detection; molecular biology

2016-11-15

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)校青年科研基金項(xiàng)目(A2006096);云南省高校獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)展專項(xiàng)(A3008366)

吳 杰(1993-)，女，吉林人，碩士，主要從事人獸共患寄生蟲病研究。 *通訊作者

S855.12

A

1007-5038(2017)06-0078-04