劉 莉，趙 倩，邱樹磊，郝福星，吳 植，張 斌，武彩紅*，鄭筱峰

(1．揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2．江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；3．河南省新鄉(xiāng)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南新鄉(xiāng) 45300)

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冷凍保存前平衡溫度對(duì)豬精子結(jié)構(gòu)的影響

劉 莉1,2，趙 倩3，邱樹磊2，郝福星2，吳 植2，張 斌2，武彩紅2*，鄭筱峰2

(1．揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2．江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；3．河南省新鄉(xiāng)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南新鄉(xiāng) 45300)

研究冷凍保存前平衡溫度對(duì)精子結(jié)構(gòu)的影響，為提高豬精子冷凍效果提供參考。新鮮豬精液(Ⅰ組)稀釋后于17℃過夜保存(Ⅱ組)，然后于冷凍Ⅰ液中4 ℃平衡1.5 h(Ⅲ組)，再加入預(yù)冷的冷凍Ⅱ液于4 ℃平衡45 min(Ⅳ組)。通過精子形態(tài)正常率及活力檢測(cè)，吖啶橙(AO)染色檢測(cè)精子DNA完整性，碘化丙啶(PI)染色檢測(cè)精子頭部質(zhì)膜完整性，低滲腫脹試驗(yàn)(HOS)檢測(cè)精子尾部質(zhì)膜完整性，異硫氰熒光素標(biāo)記的花生凝集素(FITC-PNA)染色檢測(cè)精子頂體完整性，并用掃描電鏡(SEM)觀察精子結(jié)構(gòu)，評(píng)價(jià)冷凍保存前平衡溫度對(duì)豬精子結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，與新鮮精液相比，Ⅱ組精液的精子DNA完整性、質(zhì)膜完整性、頂體完整性等精子結(jié)構(gòu)檢測(cè)指標(biāo)所受影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； Ⅲ組和Ⅳ組的精子結(jié)構(gòu)檢測(cè)指標(biāo)明顯受到影響(P<0.05)，但Ⅲ組和Ⅳ組間無顯著差異(P>0.05)。掃描電鏡檢測(cè)結(jié)果表明，17℃過夜保存精子未見異常，頭、頸、尾結(jié)構(gòu)完整，頂體完整、光滑；Ⅲ組精子頭部質(zhì)膜及頭頸結(jié)合部有輕微損傷；Ⅳ組精子尾部和頭頸結(jié)合部有不同程度的斷裂。冷凍前從17℃降低至4℃及4℃平衡對(duì)豬精子結(jié)構(gòu)有一定程度的損傷。

精液冷凍；平衡溫度；精子結(jié)構(gòu)；豬

精液的有效冷凍保存在品種改良和優(yōu)良種質(zhì)資源保存中具有重要意義，但精子在冷凍過程中因“冷休克”和胞內(nèi)冰晶形成[1]，不可避免地引起精子形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的損傷[2-4]。與體細(xì)胞相比，精子質(zhì)膜富含膽固醇、磷脂以及高密度脂肪酸[5]，對(duì)“冷休克”具有更強(qiáng)的耐受性[6]，因此，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為精子的冷凍損傷主要來自于細(xì)胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，而忽略了“冷凍休克”造成的損傷。豬精子對(duì)低溫非常敏感[7]，溫度低于14℃時(shí)，精子因受到冷打擊而失去受精能力。因此，在豬精液冷凍保存過程中，溫度變化不容忽視。本試驗(yàn)旨在觀察冷凍保存前平衡溫度對(duì)豬精子結(jié)構(gòu)的影響，為提高豬精液長(zhǎng)期保存的效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 精液采集與稀釋

健康、性成熟公豬由江蘇姜曲海種豬場(chǎng)提供，假陰道法無菌采集精液，1 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，分別檢測(cè)形態(tài)和活力(形態(tài)正常率達(dá)到80%及活力達(dá)到70%時(shí)可用于試驗(yàn))。將精液過濾至37 ℃預(yù)熱燒杯中，與稀釋液(德國(guó)米尼圖MII配制)按1∶1.5混合。

1.2 精液冷凍前處理

稀釋后精液于17 ℃恒溫箱中過夜保存，然后保持17 ℃條件下離心(800 r/min，12 min)，棄上清后于沉淀中1∶1加入冷凍Ⅰ液(100 mL雙蒸水中含Tris、檸檬酸鈉、葡萄糖、青霉素、鏈霉素、海藻糖分別為2.42 g、1.48 g、1.1 g、0.06 g、0.1 g和375 mmol/L，20%卵黃)于4 ℃條件下平衡1.5 h；再加入4℃預(yù)冷的冷凍Ⅱ液(冷凍Ⅰ液中添加甘油，其終濃度為3%)，使精液最終稀釋比為1∶2，再于4℃條件下平衡45 min。

1.3 精子形態(tài)正常率及活力檢測(cè)

于相差顯微鏡下觀察精子體積、形態(tài)及頂體是否正?；蛴袩o缺損，每個(gè)樣本觀察不少于200個(gè)精子。于顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)向前運(yùn)動(dòng)精子所占的百分率，即為精子活力。每個(gè)樣本觀察、計(jì)數(shù)不少于200個(gè)精子。

1.4 精子DNA完整性檢測(cè)

采用吖啶橙染色檢查精子DNA完整性。精液樣本經(jīng)PBS洗3次，然后用PBS調(diào)節(jié)沉淀使精子濃度達(dá)2×104/mL；取精液直接涂片、自然干燥，于無水乙醇-冰醋酸(3∶1)混合液中固定，5 min后置入吖啶橙染液中染色10 min。蒸餾水沖洗、干燥、石蠟油封片，熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)至少300個(gè)精子[8]。綠色表明精子DNA 雙鏈完整，具有受精能力；紅色或黃色表明精子DNA 雙鏈損傷的，無受精能力(圖1A)。吖啶橙溶液：磷酸氫二鈉溶液：Na2HPO4·12H2O 10.74 g于100 mL蒸餾水中；吖啶橙溶液：0.1 g吖啶橙溶解于100 mL蒸餾水中；枸櫞酸溶液：1.91 g枸櫞酸溶解于100 mL蒸餾水中。臨用時(shí)，分別取吖啶橙溶液、枸櫞酸和磷酸氫二鈉溶液按0.75∶1∶4混合，使用。

1.5 精子膜完整性檢測(cè)

1.5.1 頭部質(zhì)膜完整性評(píng)價(jià)方法(PI染色) 100 μL Hepes/BSA(NaCl 0.759 9 g，KCl 0.029 8 g，Hepes 0.238 3 g，BSA 0.1 g，果糖0.252 2 g，MgCl2·6H2O 0.102 g，CaCl2·2H2O 0.014 7 g，溶解于100 mL蒸餾水中)中加入2 μL碘化丙啶(PI，0.025 g溶于10 mL PBS)，再加入精液懸液50 μL，37℃孵育30 min，取10 μL精液懸液滴于載玻片中央，再滴加少量抗熒光淬滅劑DABCO(10 mL甘油/PBS(9∶1)溶液中含DABCO0.02 468 g)，蓋片，無色指甲油封片，在熒光顯微鏡(Nikon，T1-SM)下觀察。PI染色陽性者為頭部精子質(zhì)膜破損的死精子，其頭部核區(qū)呈現(xiàn)紅色熒光(圖1B)。

1.5.2 尾部質(zhì)膜完整性評(píng)價(jià)方法(低滲腫脹試驗(yàn)) 100 μL低滲液(100 mL雙蒸水中含二水檸檬酸鈉和果搪分別為0.735 g和1.351 g，0.22 μm濾膜過濾后4℃保存)中加入10 μL精子，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min；于顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)精子，計(jì)算尾部質(zhì)膜完整率(圖1C，即彎尾精子的百分率)。

1.6 精子頂體完整性檢測(cè)

1 mL丙酮(-20 ℃預(yù)冷)中加入500 μL精液，于4 ℃固定5 min，離心(500 r/min，6 min)后棄上清，沉淀經(jīng)PBS(pH 7.2)洗2次后用HEPES/BSA封閉30 min，再加入異硫氰熒光素標(biāo)記的花生凝集素(FITC-PNA，0.001 g溶解于10 mL PBS中，-20 ℃避光保存)50 μL于37 ℃孵育30 min，離心(500 r/min，6 min)，沉淀再用PBS(pH 7.2)洗2次，取10 μL懸液滴于載玻片中央，再滴加少量抗熒光淬滅劑DABCO，蓋片，無色指甲油封片，熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)[9]。頂體完整精子，可見頂體呈綠色熒光且邊緣光滑(圖1D)。

1.7 掃描電鏡樣本制備

精液置于25 mL/L戊二醛中4℃條件下固定6 h，然后于PBS中洗2～3次，30 min/次；精子包埋于40 g/L瓊脂后于10 mL/L鋨酸(OsO4)中固定1.5 h，再經(jīng)PBS清洗2～3次[11]；乙醇逐級(jí)脫水，乙酸異戊脂置換；干燥、粘臺(tái)、噴金；掃描電子顯微鏡觀察、拍照。

1.8 試驗(yàn)分組

根據(jù)冷凍保存前平衡溫度，將精液分為4組，其中Ⅰ組為新鮮精液對(duì)照組，Ⅱ組為17℃過夜保存精液，Ⅲ組為加入冷凍Ⅰ液后4 ℃平衡1.5 h精液，Ⅳ組為加入4℃預(yù)冷的冷凍Ⅱ液后4 ℃平衡45 min精液。

1.9 數(shù)據(jù)處理

每組重復(fù)3次，各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 冷凍保存前平衡溫度對(duì)精子DNA、頭部質(zhì)膜、尾部質(zhì)膜及頂體完整性的影響

冷凍保存前平衡溫度對(duì)豬精子DNA、頭部質(zhì)膜、尾部質(zhì)膜及頂體的影響結(jié)果見表1和圖1。

表1 冷凍保存前平衡溫度對(duì)精子DNA、頭部質(zhì)膜、尾部質(zhì)膜及頂體完整率的影響

注：*同一列中，不同字母表示差異顯著，P<0.05。

Note:*In the same column,the different letters indicate significant difference,P<0.05.

由表1可見，與對(duì)照組DNA完整性、頭部質(zhì)膜完整率、尾部質(zhì)膜完整率和頂體完整率(分別為94.3%、92.2%、92.4%和93.8%)相比，17℃過夜保存精液其精子結(jié)構(gòu)檢測(cè)指標(biāo)雖有所下降(分別為90.6%、91.5%、88.5%和90.7%)，但其變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Ⅲ組和Ⅳ組各指標(biāo)(分別為75.2%、87.4%、73.6%和83.6%；71.3%、85.2%、72.1%和82.4%)均顯著低于Ⅰ組和Ⅱ組(P<0.05)， 但Ⅲ組和Ⅳ組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2 冷凍保存前平衡溫度對(duì)精子超微結(jié)構(gòu)的影響

在掃描電鏡(SEM)下，冷凍保存前平衡溫度對(duì)豬精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響見圖2。 在SEM下可見豬新鮮精子(圖2A)和Ⅱ組精子(圖2B)結(jié)構(gòu)完整，由頭、頸、尾3部分構(gòu)成。頭頸部結(jié)合完好；尾部主段、中段和末端結(jié)構(gòu)完整；頂體結(jié)構(gòu)完整，邊緣清晰，局部無隆起；Ⅲ組精子(圖2C和2D)和Ⅳ組精子(圖2E和2F)頭、頸、尾結(jié)構(gòu)完成，但頭頸部有不同程度的斷裂(圖2D和圖2F)，Ⅲ組精子頭部部分質(zhì)膜輕微損傷(圖2C)，Ⅳ組精子尾部末端部分?jǐn)嗔?圖2E)。

A.熒光顯微鏡下精子AO染色結(jié)果：綠色為DNA完整精子 ，橙色為DNA斷裂精子；B.熒光顯微鏡下PI染色結(jié)果：紅色為精子頭部質(zhì)膜損傷；C.顯微鏡下精子低滲腫脹試驗(yàn)結(jié)果：尾部彎曲為精子尾部質(zhì)膜完整，尾部未發(fā)生彎曲為精子尾部質(zhì)膜受損精；D.熒光顯微鏡下FITC-PNA染色結(jié)果：綠色為精子完整頂體

A.AO staining features of boar sperm under the fluorescent microscope：Green and yellow represent sperms with integrated DNA and rupture DNA,respectively.B.PI staining features of boar sperm under the fluorescent microscope：Red represents sperms with membrane damage in head.C.Experiments of hypoosmotic swelling under the microscope:crooked tail represents integrated membrane in tail.And without crooked tail represents damage membrane in tail.D.FITC-PNA staining features of boar sperm under the fluorescent microscope：Green represents sperms with integrated acrosome

圖1 冷凍保存前平衡溫度對(duì)豬精子DNA、頭部質(zhì)膜、尾部質(zhì)膜及頂體的影響

Fig.1 Effects of equilibration temperature before freezing on DNA,membrane in head,membrane in tail and acrosome in boar sperms

3 討論

豬精子對(duì)低溫打擊和冷凍非常敏感，豬精子冷凍后容易表現(xiàn)出精子活率喪失，精子膜選擇通透性降低，頂體膜損傷等問題，所以精子凍存技術(shù)和方案的優(yōu)化對(duì)于挖掘精子潛力尤為重要[11]。精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)與受精能力密切相關(guān)[12]。研究認(rèn)為，精子質(zhì)膜完整性是反映精子存活與否的重要指標(biāo)；頂體結(jié)構(gòu)完整是精子發(fā)生正常頂體反應(yīng)的基礎(chǔ)，是精子成功受精的關(guān)鍵；而精子DNA完整性則直接與精子質(zhì)量及其后代生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)[13]。

豬冷凍精液在生產(chǎn)制作過程中，穩(wěn)定平衡溫度在合理范圍內(nèi)極為重要，因它能直接影響到冷凍精液的品質(zhì)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，17℃過夜平衡，精子結(jié)構(gòu)未發(fā)生顯著改變，但4℃平衡后精子DNA完整性及頭部質(zhì)膜、尾部質(zhì)膜和頂體完整率都顯著降低。掃描電鏡下，17℃過夜平衡處理精子未見異常， 4℃平衡后精子頭頸結(jié)合部輕微斷裂，尾部及頭部質(zhì)膜也發(fā)生輕微損傷，但頂體結(jié)構(gòu)未見明顯異常。表明，溫度在降低至4℃及4℃平衡不可避免的引起了豬精子損傷。說明盡管精子對(duì)“冷休克”具有一定的耐受性，但冰點(diǎn)之上的溫度下降還是會(huì)對(duì)精子的結(jié)構(gòu)造成一定的破壞，該研究結(jié)果與Clarke G N[15]研究結(jié)果一致。雖然本研究冷凍保存前平衡處理對(duì)精子造成了一定損傷，但仍符合精子冷凍保存前處理要求的各指標(biāo)值。不過，如何降低冷凍前平衡對(duì)精子損傷仍需進(jìn)一步探索。

A.Ⅰ組(新鮮)精子；B.Ⅱ組精子；C～D.Ⅲ組精子；E～F.Ⅳ組精子。A.精子結(jié)構(gòu)完整，無損傷(2 600×)；B.頭頸部未見異常，頭部頂體完整，表面光滑(6 000×)；C.頭頸部結(jié)合完好，但頭部質(zhì)膜損傷(10 000×)；D.頭部頂體完整，表面光滑，但頸部輕微斷裂(12 000×)；E.精子尾部部分缺損(5 000×)；F.頭部頂體完整，表面光滑，但頭頸結(jié)合部輕微斷裂(10 000×)

A.Micrographs derived from Ⅰ group sperm; B.Micrographs derived from Ⅱ group sperm; C-D.Micrographs derived from Ⅲ group sperm; E-F.Micrographs derived from Ⅳ group sperm.A.Sperm with intact structure and no damage (2 600×); B.Sperm with acrosomal intactness,smooth surface and normal neck (6 000×); C.damaged membrane in head(10 000×); D.Partial fracture between head and neck.but with acrosomal intactness and smooth surface(12 000×); E.Partial fracture tail(5 000×); F.Partial fracture between head and neck.but with acrosomal intactness and smooth surface(10 000×)

圖2 掃描電鏡(SEM)下，冷凍保存前平衡溫度對(duì)豬精子超微結(jié)構(gòu)的影響

Fig.2 Effect of equilibration temperature before freezing on the ultrastructure of boar sperms under the SEM

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Effect of Equilibration Temperature Before Freezing on Boar Sperm Structure

LIU Li1,2,ZHAO Qian3,QIU Shu-lei2,HAO Fu-xing2,WU Zhi2,ZHANG Bin2,
WU Cai-hong2,ZHENG Xiao-feng2
(1.VeterinaryCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu,225009,China；2.JiangsuAnimalHusbandryandVeterinaryCollege,Taizhou,Jiangsu,225300,China; 3.InstituteofAnimalHealthSupervisionofXinxiang,Xinxiang,Henan,45300,China)

To investigate the effect of equilibration temperature before freezing on boar sperm structure and to provide reference for optimize the cryopreservation protocol of boar semen,fresh semen (Ⅰ group) was diluted and then preserved at 17℃ for overnight time (Ⅱ group).Next,the semen was mixed with Ⅰ freezing liquid at the ratio of their volume 1:1 and then kept for 1.5 hour at 4℃ (Ⅲ group).Finally,the semen was mixed with Ⅱ freezing liquid and then kept for 45minutes at 4℃(Ⅳ group).In order to evaluate the effect of equilibration temperature before freezing on boar sperm structure,we examined semen samples by the normal proportion and activity assay of sperm morphology，the acridine orange(AO) staining,propidium iodide (PI) staining,hypoosmotic swelling test (HOS),fluorescein isothiocyanate labeled peanut (FITC-PNA) staining and scanning electron microscopy (SEM) observation.Compare with fresh sperm,all the indexes of sperm from Ⅱ group decrease but no statistical difference between them (P>0.05).All the indexes of sperm from Ⅲ and Ⅳ groups decrease obviously (P<0.05).But there was no significant difference between Ⅲ group and Ⅳ group (P>0.05).Under SEM,sperm from Ⅱ group did not show abnormal and showed intact structure including head,neck and tail and intact and smooth acrosome.Sperm from Ⅲ group showed lightly damage in head member and junction between head and neck.Sperm from Ⅳ group showed different degree fracture in tail and junction between head and neck.In conclusion,temperature change can cause sperm damage when sperms undergo the temperature drop from 17℃ to 4℃ and 4℃equilibration before freezing.

sperm freezing; equilibration temperature; sperm structure; boar

2016-08-15

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2008589)；江蘇省“333工程”[蘇農(nóng)辦人2013(3)號(hào)]；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院“鳳凰人才工程”[(2014)30號(hào)];江蘇省教育廳“青藍(lán)工程”培養(yǎng)對(duì)象(蘇教辦師〔2017〕5號(hào))

劉 莉(1981-)，女，江蘇銅山人，碩士，講師，主要從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)教學(xué)研究。 *通訊作者

S857.2

A

1007-5038(2017)06-0038-05