郭淼，張曉鶯，李燕云

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院，烏魯木齊830002)

中腦神經(jīng)損傷可引起滑車神經(jīng)以及動眼神經(jīng)等方面的疾患。一定數(shù)量神經(jīng)細(xì)胞的存活是受損中腦神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)的基礎(chǔ)。神經(jīng)再生是神經(jīng)發(fā)育過程的再現(xiàn)，因此對神經(jīng)細(xì)胞生長發(fā)育過程的研究有助于探討損傷修復(fù)的機(jī)制，從而為神經(jīng)損傷的治療提供依據(jù)。銀杏內(nèi)酯B(GB)是銀杏葉提取物中的重要成分，目前已用于腦缺血、老年癡呆癥、心血管疾病及哮喘等疾病的治療[4]。海人藻酸(KA)是類似于谷氨酸的一種興奮性神經(jīng)毒素，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中常被作為引起細(xì)胞死亡的經(jīng)典細(xì)胞損傷模型藥物。目前，對GB治療中腦神經(jīng)損傷的作用尚不明確。 2015年3月～2016年1月，我們應(yīng)用KA制備大鼠胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，觀察GB對細(xì)胞存活以及生長的影響，探討GB對大鼠中腦神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為GB在神經(jīng)損傷修復(fù)治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 健康成年雌雄Wistar大鼠各30只，體質(zhì)量250 g左右，63～70日齡，由中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。GB、KA、MTT(美國Sigma公司)；胰蛋白酶(1∶250)、HEPES及高糖DMEM干粉培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；微量加樣器(法國Gilson公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；臺式低速離心機(jī)TDL-5C(上海菲恰爾分析儀器有限公司)。

1.2 大鼠胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 大鼠雌、雄鼠合籠受孕，取30只受孕15 d的孕鼠，脫頸處死后，放入盛有75%乙醇容器內(nèi)，消毒5 min，于無菌條件下取出胚胎放置于培養(yǎng)基中，取出胚胎中腦組織，用PBS溶液將血污清洗干凈，剪碎腦組織，置于37 ℃、濃度為0.25%的Trypsin溶液中浸泡5 min進(jìn)行消化，之后將消化液吸除，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，將沉淀吹打后制作為單神經(jīng)細(xì)胞懸液[6]。使用臺盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為4×108/mL的細(xì)胞懸液，接種在涂有10 mg/L的Poly-L-Lysine培養(yǎng)板上，在溫度37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后待細(xì)胞貼壁后，全量換液1次。以后每2～3天半量換液。采用神經(jīng)元特異性免疫組化染色(NSE)鑒定原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞[8]，經(jīng)鑒定神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒，即為NSE陽性，中腦神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)成功。

1.3 細(xì)胞分組及干預(yù)方法 中腦神經(jīng)細(xì)胞密度調(diào)整為4×106/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加50 μL細(xì)胞懸液。24 h后，待細(xì)胞貼壁，分為對照組、神經(jīng)生長因子(NGF)組(NGF組)、GB組、KA組、NGF+KA組、GB+KA組。對照組僅在培養(yǎng)基中培養(yǎng)；NGF組在培養(yǎng)基中加入50 mg/L NGF；GB組在培養(yǎng)基中加入50 mg/L GB；KA組在培養(yǎng)基中加入100 μmol/L KA；NGF+KA組在培養(yǎng)基中加入50 mg/L NGF及100 μmol/L KA；GB+KA組在培養(yǎng)基中加入50 mg/L GB及100 μmol/L KA。每組分為6個復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。

1.4 細(xì)胞存活率測定 采用MTT法。對各組細(xì)胞培養(yǎng)后每隔4 h對每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用移液器移除上清液。每孔加入DMSO 150 μL，置于振蕩器振蕩15 min后，用酶標(biāo)儀(490 nm波長)在各孔測得A值，即為細(xì)胞存活率。

1.5 集落分化率測定 采用Giemsa染色法。各組分為10孔，培養(yǎng)10 d后，對中腦神經(jīng)細(xì)胞集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。以胞體飽滿呈圓形或橢圓形，光暈明顯，突起均勻光滑的細(xì)胞認(rèn)為是活細(xì)胞；以胞體腫脹或皺縮，形態(tài)不規(guī)則，空泡化，突起斷裂呈串珠樣甚至消失認(rèn)為是細(xì)胞受損或死亡。細(xì)胞用4%甲醛固定，再放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜，次晨沖洗2次，Giemsa染色，經(jīng)Leica采集圖像觀察染成藍(lán)色的胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞集落，計(jì)數(shù)集落數(shù)，以對照組集落數(shù)為100%，計(jì)算中腦神經(jīng)細(xì)胞集落分化率。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率比較 對照組在24、48、72、96 h時細(xì)胞存活率無明顯變化。KA組在48、72、96 h時細(xì)胞存活率均低于對照組(P均<0.05)；NGF+KA組、GB+KA組在48、72、96 h時，細(xì)胞存活率均高于KA組(P均<0.05)；NGF組、GB組在72、96 h時，細(xì)胞存活率均高于對照組(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組中腦神經(jīng)細(xì)胞集落分化率比較 對照組、NGF組、GB組、KA組、NGF+KA組、GB+KA組集落分化率分別為100%、131%、134%、29.5%、29.5%、86.1%、82.1%，NGF組、GB組集落分化率均高于對照組(P均<0.05)，KA組、NGF+KA組、GB+KA組集落分化率均低于對照組(P均<0.05)，NGF+KA組、GB+KA組集落分化率均高于KA組(P均<0.05)。

表1 各組細(xì)胞存活率比較

注：與同時點(diǎn)對照組比較，*P<0.05；與同時點(diǎn)KA組比較，△P<0.05；與同組24 h時比較，#P<0.05。

3 討論

神經(jīng)再生是神經(jīng)發(fā)育過程的重演，受多種機(jī)制所調(diào)控[9～11]。對神經(jīng)細(xì)胞生長發(fā)育過程的研究有助于探討損傷修復(fù)的機(jī)制，從而為神經(jīng)損傷的治療提供依據(jù)。神經(jīng)營養(yǎng)因子如NGF、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)可以促進(jìn)損傷大鼠中腦神經(jīng)細(xì)胞突起的生長，有助于中腦神經(jīng)細(xì)胞的功能恢復(fù)。但是，這些神經(jīng)營養(yǎng)因子通過血腦屏障的能力較弱，不良反應(yīng)較多[1～3]。因此，尋找可以透過血腦屏障同時有神經(jīng)保護(hù)作用的小分子物質(zhì)，是目前防治中腦損傷研究的一個新思路。

銀杏葉提取物的活性成分主要是黃酮、內(nèi)酯，目前已分離出銀杏內(nèi)酯A、B、C、J、M及白果內(nèi)酯等五種內(nèi)酯[15]。其中，GB是銀杏葉提取物中的重要成分，也是血小板活化因子受體的天然拮抗劑，其特異性抗血小板活化因子的作用最強(qiáng)。據(jù)報道，GB可保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，顯著降低大腦皮層細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放；減少亞硝酸根離子形成的毒性，降低丙二醛(MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，導(dǎo)致NO的毒性減弱，對自由基對細(xì)胞膜和線粒體損傷引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有拮抗作用；改善新陳代謝；提高細(xì)胞膜通透性；使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境得以良性循環(huán)。與此同時，GB能減輕KA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的超載，進(jìn)而對神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用[16,17]。目前，GB制劑主要用于心血管疾病、腦缺血、腦老化、老年癡呆癥及哮喘病的治療。但GB對腦細(xì)胞的影響作用尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，NGF+KA組、GB+KA組細(xì)胞存活率均高于對照組，表明GB和NGF均能改善由KA誘導(dǎo)的胚胎中腦神經(jīng)元損傷。本研究結(jié)果顯示，NGF組、GB組在72、96 h時細(xì)胞存活率均高于對照組，提示GB在72 h后能夠明顯促進(jìn)大鼠胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞的生長，并且對大鼠胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞的生長起保護(hù)作用，具有與NGF相同的功能。

細(xì)胞集落表示細(xì)胞獨(dú)立生存能力，細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境有較大的適應(yīng)性和具有較強(qiáng)的獨(dú)立生存能力時，細(xì)胞集落率高。本研究發(fā)現(xiàn)， NGF+KA組、GB+KA組集落分化率高于KA組，提示GB能促進(jìn)胚胎大鼠中腦神經(jīng)細(xì)胞的生長與分化， 其保護(hù)中腦神經(jīng)細(xì)胞的作用與NGF相似。

綜上所述，GB能有效對抗KA對大鼠中腦神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，其作用機(jī)制可能與GB促進(jìn)中腦神經(jīng)細(xì)胞的生長與分化有關(guān)。