張媛華

摘要：酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosine kinase，PTK）參與多種植物生理過程，但在氣孔運動中的研究相對較少，且與過氧化氫（H2O2）在脫落酸（abscisic acid，ABA）誘導氣孔關(guān)閉中的關(guān)系尚不清楚。通過PTK激酶的抑制劑和H2O2的清除劑及合成抑制劑的使用，初步研究了PTK在ABA誘導氣孔關(guān)閉中的作用及與H2O2的相互關(guān)系。酪氨酸蛋白激酶抑制劑木黃酮（genistein）和tyrphostin A23抑制ABA和外源H2O2誘導的氣孔關(guān)閉，且能夠促進ABA誘導關(guān)閉的氣孔重新開放。PTK參與ABA誘導的氣孔關(guān)閉，且通過調(diào)控保衛(wèi)細胞內(nèi)H2O2水平進而調(diào)控氣孔運動。

關(guān)鍵詞：PTK激酶；ABA；H2O2；氣孔；蠶豆

中圖分類號： Q945.19文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0077-02

酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosine kinase，PTK）是一種能有選擇性地使不同底物的酪氨酸殘基磷酸化的一種酶。正常情況下，細胞的酪氨酸激酶磷酸化作用是由酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶拮抗調(diào)節(jié)維持平衡的。相對于動物細胞中的研究而言，植物中的蛋白酪氨酸激酶起步較晚，僅有少量報道[1-2]。[JP2]Zi等證實酪氨酸蛋白磷酸酶抑制劑PAO和酪氨酸蛋白激酶抑制劑木黃酮能夠抑制花粉萌發(fā)和花粉管的生長，并且導致花粉管不同程度的畸變[1]。隨后Yemets等證明，PTKs抑制劑（除莠霉素A、木黃酮及tyrphostin AG18）均可能通過影響根毛中的皮質(zhì)微管結(jié)構(gòu)進而改變根毛的生長和發(fā)育[2]。然而Ghelis等的結(jié)果提示了PTKs抑制ABA誘導的氣孔關(guān)閉，但是關(guān)于其機制卻不清楚[3]。因此，本試驗就PTK在脫落酸（ABA）誘導氣孔關(guān)閉中與H2O2的相互關(guān)系進行初步研究。[JP]

1材料與方法

木黃酮、tyrphostin A23、過氧化氫酶（catalase，CAT）、DPI（二苯基氯化碘鹽，diphenyleneiodonium chloride）、MES[2-（N-嗎啉）乙磺酸，2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid]均購自 Sigma 公司，H2DCF-DA（2′，7′-二氯熒光素-3′，6′-二乙酸酯，2，7-dichlorofluorescein diacetate）購自Biotium公司，DMSO（二甲基亞砜，dimethyl sulfoxide）購自 Amresco 公司，其他均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1材料培養(yǎng)

蠶豆（Vicia faba L.）種子經(jīng)消毒、催芽后培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)箱光—暗周期設(shè)定為14 h—10 h，光照度為 300 μmol/（m2·s），溫度為25 ℃/18 ℃，相對濕度75%。幼苗生長期間澆水1次/d。取4周齡植株莖頂端完全展開的第1對葉片用于試驗分析。

1.2氣孔分析

氣孔分析參照McAinsh等的方法[4]進行。測量時隨機選取5個視野，每個視野隨機選取6個氣孔。每個處理重復3次，所得數(shù)據(jù)計算平均數(shù)和標準誤差。

2結(jié)果與分析

2.1ABA誘導氣孔關(guān)閉

由圖1可見，ABA能明顯促進光下的氣孔關(guān)閉。隨ABA濃度的增加，抑制程度增大。與對照相比，1、5、10、15 μmol/L 分別抑制了23.5%、35.5%、47.9%、51.5%?？紤]到 10 μmol/L 已對氣孔產(chǎn)生很好的抑制效果，隨后的試驗中均采用此濃度。

2.2木黃酮和tyrphostin A23抑制ABA誘導的氣孔關(guān)閉

木黃酮和tyrphostin A23是PTK激酶的專一性抑制劑。圖2結(jié)果表明，不同濃度的木黃酮（圖2-a）和tyrphostin A23（圖2-b）均可明顯抑制ABA誘導的氣孔關(guān)閉。與對照相比，最低濃度10 μmol/L的木黃酮和tyrphostin A23促進氣孔開放分別達24.1%和26.6%。且隨濃度升高，抑制ABA的程度呈劑量依賴型增大。至150 血酸ASA和過氧化氫酶CAT能明顯抑制該過程，而過氧化氫產(chǎn)生酶NADPH氧化酶的抑制劑DPI卻不能抑制該過程。該結(jié)果表明，清除保衛(wèi)細胞中的H2O2能夠促進氣孔開放。而H2O2誘導的氣孔關(guān)閉同樣被木黃酮和tyrphostin A23所抑制，表明木黃酮和tyrphostin A23可能通過類似清除的方式促進氣孔開放。

[HTK]2.4木黃酮和tyrphostin A23促進ABA誘導關(guān)閉的氣孔重新開放[HT]

研究表明，ABA能夠促進保衛(wèi)細胞的產(chǎn)生和H2O2的積累進而誘導氣孔關(guān)閉[5]。而圖4顯示，100 μmol/L 木黃酮和tyrphostin A23不僅抑制ABA誘導的氣孔關(guān)閉，且能夠促進ABA已經(jīng)誘導關(guān)閉的氣孔重新開放。同樣，H2O2的清除劑抗壞血酸ASA和過氧化氫酶CAT也能逆轉(zhuǎn)ABA關(guān)閉的氣孔重新開放，而H2O2產(chǎn)生酶-NADPH氧化酶的抑制劑DPI卻不能逆轉(zhuǎn)該過程（圖4）。結(jié)果表明，木黃酮、tyrphostin A23與H2O2的清除劑ASA和CAT二者作用結(jié)果相似，推測木黃酮、

tyrphostin A23可能通過清除保衛(wèi)細胞內(nèi)部H2O2的方式逆轉(zhuǎn)ABA誘導關(guān)閉的氣孔重新開放。

木黃酮和tyrphostin A23作為2種特異的PTK激酶抑制劑，能夠有選擇地抑制PTK激酶的活性[6-7]。本研究結(jié)果顯示，ABA誘導的氣孔關(guān)閉可被PTK激酶的抑制劑木黃酮和tyrphostin A23抑制，表明PTK激酶參與ABA誘導的蠶豆氣孔關(guān)閉。該結(jié)果與Ghelis等在擬南芥中的研究結(jié)果[3]一致。

H2O2作為一種重要的信號分子參與多種環(huán)境因子和植物激素誘導的氣孔關(guān)閉[8-9]。本試驗研究結(jié)果表明，木黃酮和tyrphostin A23是通過類似于H2O2清除劑ASA和CAT清除保衛(wèi)細胞內(nèi)H2O2的方式抑制外源過氧化氫誘導的氣孔關(guān)閉，而不是通過抑制H2O2生成的方式參與氣孔運動（圖3、圖4）。該結(jié)果表明，PTK激酶的活性可能通過促進H2O2的積累進而參與ABA誘導的氣孔關(guān)閉。此外，木黃酮和tyrphostin A23能夠逆轉(zhuǎn)ABA誘導已關(guān)閉的氣孔重新開放，效應(yīng)也同ASA和CAT相似，異于DPI。該結(jié)果不僅進一步證實了上述推測，還表明木黃酮和tyrphostin A23可能具有清除細胞內(nèi)H2O2的功能，與PTK通過磷酸化肌動蛋白參與花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長機制不同[1]。

3結(jié)論

PTK激酶可能通過調(diào)節(jié)H2O2水平參與ABA誘導的氣孔關(guān)閉。木黃酮和tyrphostin A23通過清除細胞內(nèi)H2O2的方式不僅能抑制外源H2O2誘導的氣孔關(guān)閉，還能逆轉(zhuǎn)ABA誘導關(guān)閉的氣孔重新開放。

參考文獻：

[1]Zi H J， Xiang Y， Li M， et al. Reversible protein tyrosine phosphorylation affects pollen germination and pollen tube growth via the actin cytoskeleton[J]. Protoplasma，2007，230（3-4）：183-191.

[2]Yemets A， Sheremet Y， Vissenberg K， et al. Effects of tyrosine kinase and phosphatase inhibitors on microtubules in Arabidopsis root cells[J]. Cell Biology International，2008，32（6）：630-637.

[3]Ghelis T， Bolbach G， Clodic G， et al. Protein tyrosine kinases and protein tyrosine phosphatases are involved in abscisic acid-dependent processes in Arabidopsis seeds and suspension cells[J]. Plant Physiology，2008，148（3）：1668-1680.

[4]McAinsh M R， Clayton H， Mansfield T A， et al. Changes in stomatal behavior and guard cell cytosolic free calcium in response to oxidative stress[J]. Plant Physiology，1996，111（4）：1031-1042.