番茄自毒物質(zhì)降解菌的篩選及其降解效果

何志剛+婁春榮+王秀娟+董環(huán)+趙穎

摘要：通過篩選用于降解番茄分泌自毒物質(zhì)苯甲酸的菌株，研究其降解效果。以苯甲酸為唯一碳源，采用逐漸提高苯甲酸濃度的馴化方法，篩選到3株能夠高效降解苯甲酸的菌株，經(jīng)過鑒定分別為芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、鏈霉菌屬吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus、納西桿菌屬耐堿納西桿菌Naxibacter alkalitolerans。3株菌株發(fā)酵培養(yǎng)的降解率分別為95.32%、91.63%和90.15%，并且對番茄根系分泌的自毒物質(zhì)（肉桂酸、香草酸等）均有較強(qiáng)的降解效果，盆栽試驗結(jié)果表明，通過施加菌劑可以有效緩解自毒物質(zhì)對番茄幼苗的抑制作用，明顯提高番茄苗期株高和葉綠素等生長指標(biāo)，根際自毒物質(zhì)降解率最高達(dá)到98.69%，后期增產(chǎn)效果顯著，B2菌株增產(chǎn)達(dá)到16.20%。篩選到的3株菌株具有用于修復(fù)番茄連作障礙的微生物菌肥的潛力。

關(guān)鍵詞：番茄；自毒物質(zhì)；降解菌；篩選；降解效果

中圖分類號：S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）05-0114-03

設(shè)施農(nóng)業(yè)連作障礙嚴(yán)重制約著我國番茄生產(chǎn)，而引起連作障礙的原因主要為土傳病害、根系分泌物的自毒作用以及土壤理化性質(zhì)劣變[1]。有研究表明，酚酸類自毒物質(zhì)具有化感抑制作用，而酚酸類化合物已被鑒定是植物根系分泌物中的主要自毒性物質(zhì)[2]。作物分泌的多酚類化合物能破壞細(xì)胞膜的功能，抑制受體植物超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性，[JP2]導(dǎo)致體內(nèi)活性氧含量增多，啟動膜質(zhì)過氧化，破壞膜結(jié)構(gòu)。另有研究發(fā)現(xiàn)，化感物質(zhì)可明顯抑制受體三磷酸腺苷（ATP）酶的活性，從而影響受體的光合與呼吸作用[3-4]。高濃度苯甲酸和肉桂酸能顯著抑制番茄幼苗根系過氧化物酶（POD）活性，大幅度提高枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)[5]。[JP]

有研究報道，采用合理施肥、輪作倒茬、土壤消毒、種苗脫毒、施用有機(jī)改良劑以及接種生防菌劑等方法，可以緩解營養(yǎng)元素失衡和病原菌增多引起的再植病害，利用微生物制劑可緩解酚酸和丙烯酸對草莓、黃瓜的自毒危害[6]，但目前尚無利用微生物制劑消除番茄自毒物質(zhì)的報道。本研究探索了利用微生物菌劑降解番茄根系分泌自毒物質(zhì)苯甲酸的可行性，以期為番茄連作障礙微生態(tài)修復(fù)劑的研制提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1培養(yǎng)基

試驗采用無機(jī)鹽培養(yǎng)基，各組成成分及含量分別為（NH4）2SO4 2 g/L，KH2PO4 2 g/L，Na2HPO4 1.3 g/L，苯甲酸100～1 000 mg/L，NaCl 5 g/L，余量為水；pH值6.8～7.2。

1.2菌株的分離

采用逐漸提高苯甲酸濃度的馴化方法，將連作多年番茄根系土壤懸液按10%的接種量接種于含有100 mg/L苯甲酸的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30 ℃搖床150 r/min，培養(yǎng)3 d后，以10%接種量轉(zhuǎn)至苯甲酸濃度為300 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)。按此方式連續(xù)循環(huán)3次，直到苯甲酸濃度達(dá)到 1 000 mg/L，然后進(jìn)行平板涂布，將培養(yǎng)皿放于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接入液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，反復(fù)涂布[7]。

1.3菌株的篩選與鑒定

1.3.1初篩將5 mL苯甲酸降解菌篩選液體培養(yǎng)基裝入15 mm×150 mm試管中，121 ℃滅菌30 min，冷卻后將分離得到的菌株懸液接種到液體培養(yǎng)基中，每菌株重復(fù)2管，28 ℃避光培養(yǎng)5 d，每24 h觀察記錄1次生長情況，根據(jù)生長狀況初篩菌株。

1.3.2復(fù)篩將苯甲酸降解菌篩選液體培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，每瓶50 mL，滅菌后冷卻。將初篩試驗得到的菌懸液接入三角瓶中，接種量為每瓶1 mL，對照接入1 mL無菌水，每處理重復(fù)3次，28 ℃避光培養(yǎng)10 d，檢測苯甲酸殘留量，計算降解率。

1.3.3鑒定對復(fù)篩獲得的菌株進(jìn)行16S rDNA序列測定。采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取PCR產(chǎn)物 1 μL 進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外檢測。用瓊脂糖凝膠純化試劑盒（大連寶生物公司）切膠回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。16S rDNA的測序工作由大連寶生物公司完成。將菌株的16S rDNA 序列測序結(jié)果登錄GenBank，并用BLAST與GenBank中的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較。將得到的相似菌株的16S rDNA，利MEGA 5.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析各分離菌株的進(jìn)化地位，同時利用生理生化指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

[HTK]1.4菌株對苯甲酸的降解試驗[HT]

將50 mL苯甲酸作唯一碳源的降解液體培養(yǎng)基分別裝入250 mL三角瓶中，滅菌冷卻后接入復(fù)篩獲得的菌懸液，接種量為每瓶1 mL，對照接入1 mL無菌水，每處理重復(fù)3次， 28 ℃ 避光培養(yǎng)7 d后，檢測苯甲酸殘留量。

1.5底物廣譜性

取50 mL錐形瓶，每個錐形瓶中加入25 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基，以不同的芳香化合物作為唯一碳源和能源進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后觀察菌株的生長情況。

1.6苯甲酸的測定方法

取待測液20 mL，加入到50 mL離心管中，充分?jǐn)嚢韬?，搖床振蕩2 h，然后室溫下8 000 r/min離心10 min，取上清液置于51 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干，然后加高純水定容至2 mL，進(jìn)樣前過0.22 μm微孔濾膜作為進(jìn)樣品。標(biāo)準(zhǔn)樣品苯甲酸為色譜純，具體方法采用文獻(xiàn)[8]方法，色譜柱為Agillent C18柱（250 mm×4.0 mm×5 μm）；柱溫為30 ℃；紫外檢測波長為 230 nm；流動相為甲醇 ∶[KG-*3]0.02 mol/L乙酸銨=7 ∶[KG-*3]93；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別移取濃度為1.0 mg/mL的苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.25、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，至100 mL容量瓶中，用水稀釋成濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，按上述的色譜條件進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7盆栽試驗

試驗共設(shè)4個處理：對照（CK）、B2、A11、F2。菌株發(fā)酵后利用草炭吸附最終菌株的數(shù)量約108 CFU/g。采用營養(yǎng)缽育苗的方法，每個營養(yǎng)缽裝土300 g，播種前各處理施入等量氮、磷、鉀，其中CK施化肥，其他處理按2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的施肥量拌入。營養(yǎng)缽育苗至2～3張真葉時移栽到盛有5 kg土的盆缽中（盆缽?fù)寥兰尤?.6 mmol/L苯甲酸60 mL預(yù)處理），每盆栽種3株苗，每處理5盆（重復(fù)）。盆中菌肥的施用量均為0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。苗期測定株高、葉綠素含量、根際土壤中苯甲酸含量（方法同上），成熟期測定產(chǎn)量。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的分離篩選與鑒定

能在篩選培養(yǎng)基上良好生長的菌株即能以苯甲酸為唯一碳源，表明其對苯甲酸有降解能力。根據(jù)初篩生長狀況，分離得到156株菌株，經(jīng)復(fù)篩獲得3株降解性能較強(qiáng)的菌株，編號分別為B2、F2及A11。經(jīng)16S rDNA序列測定，將3種菌株的16S rDNA序列測序結(jié)果登錄GenBank，并用BLAST與 GenBank 中16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌株B2與Bacillus sp.CR-7的16S rRNA序列同源性達(dá)到100%，菌株F2與Naxibacter sp.OX3b1-S6的16S rDNA序列同源性達(dá)到100%，菌株A11與Streptomyces sp.Ank150的16S rDNA序列同源性達(dá)到100%。經(jīng)過生理生化指標(biāo)綜合鑒定后B2為芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌2.3底物廣譜性

某些植物可通過地上部淋溶、根系分泌和植株殘茬腐解等途徑來釋放一些物質(zhì)對同茬或下茬同種或同科植物生長產(chǎn)生抑制作用，這種現(xiàn)象被稱為自毒作用[9]。目前，已在番茄、黃瓜和辣椒等多種設(shè)施園藝作物組織和根系分泌物中分離出包括苯甲酸、肉桂酸和水楊酸在內(nèi)的10余種自毒物質(zhì)[10]。從表2中可以看到，B2除了對香草酸降解能力稍低外，對其他幾種醛酸類物質(zhì)都有一定降解能力，A11除對肉桂酸降解能力稍差外，對其他幾種醛酸類物質(zhì)都有較好2.4菌株對番茄自毒作用的緩解效果

3結(jié)論

作物連作障礙的產(chǎn)生原因是錯綜復(fù)雜的，是作物與土壤2個系統(tǒng)內(nèi)部諸多因素綜合作用結(jié)果的外觀表現(xiàn)。由于作物種類和栽培條件不同，作物發(fā)生連作障礙的主要原因也可能不同。自毒物質(zhì)通過影響植物生理生化代謝活動進(jìn)而影響植物生長發(fā)育，根系是植物接觸化感物質(zhì)最早的器官[11]。本研究結(jié)果表明，從土壤中可以篩選到能分解番茄根泌自毒物質(zhì)苯甲酸、解除化感抑制作用的菌株。在實驗室條件下，以苯甲酸為唯一碳源，供試菌株均對苯甲酸具有較強(qiáng)的降解作用，這些菌株具有作為番茄根泌自毒物質(zhì)降解菌的潛力，可用于番茄連作障礙的微生物修復(fù)，至于這些具有解毒功能的菌株在番茄生產(chǎn)中的實際效果，尚待后續(xù)的生物試驗證明。

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