楊海婧+田豐+馬永清+王煥+徐宗才+李永平+馬正華+劉麗穎

摘要：研究小麥、蠶豆和油菜的莖、葉的陰干樣品浸提液、根系分泌物對秦艽種子萌發(fā)的影響。利用蒸餾水和甲醇浸提小麥、蠶豆、油菜的莖葉陰干樣品獲取秦艽種子萌發(fā)刺激物，用乙酸乙酯萃取農(nóng)作物根系分泌物，再用丙酮浸提獲取秦艽種子刺激物，分別處理秦艽種子進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)，測定不同處理的秦艽種子發(fā)芽率和秦艽種子胚根長。結(jié)果表明：小麥莖葉的陰干樣品水浸提液和甲醇浸提液對秦艽種子萌發(fā)及胚根生長有較弱的抑制作用，小麥根系分泌物對秦艽種子萌發(fā)及胚根生長有一定的促進(jìn)作用；蠶豆莖葉的陰干樣品水浸提液和甲醇浸提液及根系分泌物均對秦艽種子萌發(fā)及胚根生長有較弱的抑制作用，油菜莖葉的陰干樣品水浸提液和甲醇浸提液及根系分泌物均對秦艽種子萌發(fā)及胚根生長有較強(qiáng)的抑制作用。隨著稀釋倍數(shù)的增加、陰干樣水浸提液抑制秦艽種子發(fā)芽作用降低。

關(guān)鍵詞：農(nóng)作物；浸提液；根系分泌物；秦艽；萌發(fā)率；胚根長；化感作用

中圖分類號(hào)：S567.23+9.04 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）05-0145-04

秦艽（Gentiana macrophylla Pall）為龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬（Gentiana）秦艽組（Sect. Cruciata Gaudin）多年生草本植物[1]，主要分布在中國西北部[2]；味苦、辛平，性微寒，有祛風(fēng)濕、止痹痛、清濕熱的功效，用于風(fēng)濕痹痛、筋脈拘攣、濕熱黃疽等病癥，為祛風(fēng)濕清熱之首藥[3-4]。由于大量采集野生秦艽，導(dǎo)致野生秦艽迅速消減[5]、野生秦艽資源匱乏[6]。秦艽的人工栽培迫在眉睫，將秦艽與農(nóng)作物進(jìn)行套種是秦艽人工栽培的一個(gè)重要方法。近年來，化感作用研究也得到了迅速發(fā)展，并在生產(chǎn)實(shí)踐中加以應(yīng)用[7-8]，有些植物分泌物中生物活性物質(zhì)有利于其他某些植物對營養(yǎng)元素的吸收，從而促進(jìn)其生長[9]。將秦艽套種于春小麥（Triticum aestivum L.）、春蠶豆（Vicia faba L.）和春油菜（Brassica campestris L.）田中，發(fā)現(xiàn)小麥套種田的秦艽出苗率高，而蠶豆、油菜田的秦艽出苗率極低，甚至為零[10]。目前只見到了麻花秦艽（Gentiana straminea Maxim）浸提液對紫花苜蓿（Medicago sativa L.）的抑制作用較小麥強(qiáng)，麻花秦艽葉浸提液的抑制作用較根強(qiáng)[11]，尚未發(fā)現(xiàn)小麥、油菜及蠶豆對秦艽種子萌發(fā)及幼苗生長影響的報(bào)道。

研究小麥、油菜及蠶豆對秦艽種子萌發(fā)的化感作用，可以優(yōu)選適宜與秦艽套種的農(nóng)作物，指導(dǎo)秦艽的人工栽培技術(shù)，豐富禾本科、十字花科、豆科作物與龍膽科植物的化感理論，對增加農(nóng)民收入和保護(hù)生態(tài)環(huán)境都具有重要的意義。

[BT1#][STHZ]1材料與方法

[HTK]1.1試驗(yàn)材料[HT]

本試驗(yàn)的供體小麥品種為阿勃、蠶豆品種為青蠶11號(hào)、油菜品種為青雜3號(hào)；受體植物為大葉秦艽，由青海大通藥材種植園提供。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用二因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，因素A為農(nóng)作物：A1小麥，A2蠶豆，A3油菜；因素B為浸提液稀釋倍數(shù)：B1清水對照，B2原液，B3稀釋10倍液，B4稀釋100倍液。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1秦艽種子表面消毒

將秦艽種子用1%（體積分?jǐn)?shù)）次氯酸鈉溶液在超聲波清洗器中處理3 min，采用滅菌蒸餾水清洗后再用75%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇超聲1 min，然后用蒸餾水沖洗至無色，晾干備用。在培養(yǎng)皿內(nèi)（直徑90 mm，高20 mm）鋪雙層濾紙，加入適量蒸餾水，然后在濾紙上均勻鋪直徑 10 mm 的玻璃纖維濾紙（whatman GF/A）約60張，將表面消毒晾干后的秦艽種子均勻撒到玻璃纖維濾紙片上，每張25～45粒，在 25 ℃ 的黑暗條件下備用。

1.3.2發(fā)芽試驗(yàn)

1.3.2.1水浸提試驗(yàn)

將開花期的小麥、油菜、蠶豆莖葉分別陰干后粉碎過0.45 mm的篩。分別稱取3種農(nóng)作物莖葉粉碎樣1.0 g于三角瓶中，加入10 mL滅菌蒸餾水，置于超聲波清洗機(jī)中超聲30 min，超聲后的溶液用濾紙過濾，取上清液為原液，用滅菌蒸餾水稀釋10倍和100倍液待用，即為第1次浸提液的不同濃度液。在直徑90 mm的培養(yǎng)皿中，邊緣擺放含秦艽種子的玻璃纖維濾片，中間放置1個(gè)保濕的三角濾紙片，用移液槍吸取以上3種濃度100 μL浸提液加到種子上，每個(gè)濃度4次重復(fù)。用Parafilm封口膜將培養(yǎng)皿密封，在25 ℃黑暗培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)13 d，在顯微鏡下觀察秦艽種子發(fā)芽率和胚根長，以滅菌蒸餾水處理作為對照。

1.3.2.2甲醇浸提試驗(yàn)

甲醇浸提方法應(yīng)將溶液加到空白的玻璃纖維濾片上，待甲醇蒸發(fā)完后再疊放1層帶有種子的玻璃纖維濾片，再給種子加200 μL的蒸餾水。其余步驟與水浸提相同。

1.3.2.3乙酸乙酯萃取水培根系分泌物試驗(yàn)

根系分泌物的收集：將供試的小麥、蠶豆和油菜種子采用和秦艽相同的方法進(jìn)行表面消毒，晾干分別放置小麥400粒、蠶豆200粒、油菜400粒，在豆芽機(jī)（康源牌自動(dòng)豆芽苗菜機(jī)）中進(jìn)行培養(yǎng)，待各農(nóng)作物發(fā)芽長根時(shí)開始，每隔3 d放入等量的活性炭（100 g用紗布包裹），共收集3次。根系分泌物的萃取分離：參考賀峰等的方法[12]，將活性炭取出，過濾除去水分，放入燒杯中，加入丙酮（丙酮的量須淹沒過活性炭頂部），將燒杯放入超聲清洗機(jī)中超聲3 min，取出后用布氏漏斗進(jìn)行抽濾（1～2次）。將濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（ER-52A，上海亞榮生化儀器場）減壓濃縮，濃縮物先用蒸餾水溶解，得到50 mL水溶液，倒入分液漏斗中，少量不溶于水的物質(zhì)用乙酸乙酯溶解后倒入分液漏斗中。按乙酸乙酯與蒸餾水1 ∶[KG-*3]1的比例萃取3次。[JP+1]將得到的乙酸乙脂相液合并，無水硫酸鈉除去多余水分，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，獲得供試的乙酸乙酯提取物（小麥 155.0 mg，蠶豆264.0 mg，油菜66.0 mg）。將5 mL丙酮加入乙酸乙酯提取物并超聲30 s左右后，得到干物質(zhì)浸提液，干物質(zhì)浸提液做秦艽種子發(fā)芽試驗(yàn)。以蒸餾水處理作為對照。[JP]

1.4指標(biāo)測定和數(shù)據(jù)處理

1.4.1發(fā)芽指標(biāo)測定將秦艽種子培養(yǎng)13 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率（GR）=（萌發(fā)的種子數(shù)/播種數(shù)）×100%。

1.4.2生長指標(biāo)發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，采用常規(guī)測量方法測量每皿萌發(fā)的秦艽種子的胚根長。然后將發(fā)芽率和根長轉(zhuǎn)化為化感效應(yīng)指數(shù)RI值后進(jìn)行比較，RI值的計(jì)算公式如下：

[JZ]RI=[JB（{]1-C/T（T≥C）T/C-1（T

式中：C為對照值，T為處理值，RI>0表示促進(jìn)作用，RI<0表示抑制作用，其絕對值的大小與作用強(qiáng)度呈正比例關(guān)系[13]。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x[TX-*5]±s”表示，應(yīng)用Excel 2007及DPS 7.05軟件對其進(jìn)行處理分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同農(nóng)作物莖葉陰干樣水浸提液對秦艽種子發(fā)芽的影響

在浸提液相同濃度下，小麥陰干樣水浸提液處理的秦艽種子發(fā)芽率最高，蠶豆次之，油菜最低。3種農(nóng)作物原液處理的秦艽種子發(fā)芽率最低，10倍液次之，100倍液最高。RI值反映了不同處理指標(biāo)值增減的相對值。小麥原液處理的秦艽種子發(fā)芽率低于對照，10倍液、100倍液高于對照，蠶豆和油菜不同濃度處理的秦艽種子發(fā)芽率均低于對照。小麥對秦艽種子萌發(fā)的化感指數(shù)與蠶豆、油菜有顯著差異。說明小麥莖葉陰干樣水浸提液對秦艽種子發(fā)芽的影響表現(xiàn)出高濃度抑制、低濃度促進(jìn)的規(guī)律，蠶豆和油菜對秦艽種子萌發(fā)有抑制作用，油菜的抑制作用最強(qiáng)，并表現(xiàn)出隨著稀釋倍數(shù)的增加莖葉陰干樣水浸提液抑制秦艽種子發(fā)芽作

3討論和結(jié)論

分別利用小麥、蠶豆、油菜的莖葉陰干樣品的蒸餾水、甲醇浸提液及其稀釋液，根系分泌物浸提液及稀釋液處理秦艽種子，測定秦艽種子的發(fā)芽率及秦艽種子胚根長，可以克服大田中小麥、蠶豆、油菜套種秦艽后，秦艽種子萌發(fā)及幼苗生長時(shí)的光、溫、水等生態(tài)因子的影響，能準(zhǔn)確測定出小麥、蠶豆、油菜對秦艽種子化感作用的影響。秦艽屬半陰性植物[14]，種子細(xì)小，千粒質(zhì)量0.25～0.3 g，1年后秦艽種子生活力顯著下降[15-17]，利用當(dāng)年的秦艽種子作為受體是進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)的關(guān)鍵。

綜合分析小麥、蠶豆及油菜莖葉陰干樣水浸提液及其稀釋液和甲醇浸提液及其稀釋液，乙酸乙酯萃取小麥、蠶豆及油菜根系分泌物丙酮浸提液及其稀釋液，處理秦艽種子后秦艽種子的發(fā)芽率及胚根生長的差異，可以比較全面地反映小麥、蠶豆及油菜對秦艽的化感作用。

利用油菜、蠶豆的莖葉陰干樣的水浸提液和甲醇浸提液處理秦艽種子的結(jié)果與用乙酸乙酯萃取農(nóng)作物根系分泌物丙酮浸提液處理秦艽種子的結(jié)果是相同的。利用小麥的莖葉陰干樣的水浸提液和甲醇浸提液處理秦艽種子表現(xiàn)為較弱的抑制作用，而用乙酸乙酯萃取農(nóng)作物根系分泌物丙酮浸提液處理秦艽種子表現(xiàn)為較弱的促進(jìn)作用。2種方法的結(jié)果雖然不是完全一致（因?yàn)樾←溓o葉陰干樣的水浸提液和甲醇浸提液與小麥根系分泌物的丙酮浸提液成分差異較大），但影響較弱是一致的。因此，小麥對秦艽的種子萌發(fā)的影響較小。這是造成小麥套種田的秦艽出苗率高，而蠶豆、油菜田的秦艽出苗率極低[10]的重要原因之一。

參考文獻(xiàn)：[HJ1.7mm]

[1]朱強(qiáng)，李小龍，鄭紫燕，等. 藥用植物秦艽的研究概述[J]. 農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2008，29（3）：62-65，80.

[2]Chen L，Chen Q，Xu D，et al. Changes of gentiopicroside synthesis during somatic embryogenesis in Gentiana macrophylla[J]. Planta Medica，2009，75（15）：1618-1624.

[3]卿德剛，倪慧，賈曉光，等. 西部資源秦艽的研究進(jìn)展及新疆地產(chǎn)秦艽的開發(fā)前景[J]. 新疆中醫(yī)藥，2004，22（3）：60-62，封3.

[4]張西玲，晉玲，劉麗莎. 近10年秦艽、麻花艽研究概況[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志，2003，10（1）：62-63.

[5]Tang J，Yang Y，Li M，et al. Research of botanical resources and utilization of Gentiana macrophylla in Liupan Mountain[J]. The Journal of Agricultural Science，2006，27：59-62.

[6]王笠，許亮. 麻花艽的研究進(jìn)展[J]. 中國民族民間醫(yī)藥，2015（6）：17-19.

[7]張曉珂，姜勇，梁文舉，等. 小麥化感作用研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，15（10）：1967-1972.

[8]王玉彥，吳鳳芝. 間混套作中的化感作用及其研究方法[J]. 北方園藝，2009（8）：136-139.

[9]王延鵬. 植物間化感作用研究概況[J]. 山東林業(yè)科技，2008，38（3）：84-88.[ZK）]

[10]李永平，田豐，李福安，等. 不同套種作物對麻花艽生長的影響[J]. 北方園藝，2014（1）：156-158.

[11]許可成，魏小紅，趙萌，等. 麻花秦艽水浸提液對紫花苜蓿和小麥種子萌發(fā)和幼苗生長的影響[J]. 草業(yè)科學(xué)，2015，32（3）：413-420.

[12]賀鋒，陳輝蓉，吳振斌. 植物間的相生相克效應(yīng)[J]. 植物學(xué)通報(bào)，1999，16（1）：19-27.

[13]Willamson G B，Richardson D. Bioassays for allelopathy：measuring treatment responses with independent controls[J]. J Chem Ecol，1988，14（1）：181-187.

[14]張玉云. 淺析影響秦艽移栽成活率的因素[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)，2006（11）：374.

[15]楊昌武，李季花，劉偉莉. 秦艽栽培技術(shù)[J]. 云南農(nóng)業(yè)科技，2007（6）：45-46.

[16]路奎，王國祥，彭云霞，等. 不同栽培年限和采收期對小秦艽種子萌發(fā)特性的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（5）：661-663.

[17] Xue S H，Luo X J，Wu Z H，et al. Cold storage and cryopreservation of hairy root cultures of medicinal plant Eruca sativa Mill.，Astragalus membranaceus and Gentiana macrophylla Pall[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult，2008，92（3）：251-260.