郭曉 商云霞+王夢遠+劉曉婷+楊紅洋 +陳潔 谷新利

摘要：探討在體外環(huán)境下不同質量濃度中藥復方多糖對雞外周血淋巴細胞信號分子表達的影響。分別采用200、100、50、25、0 μg/mL 5個中藥復方多糖質量濃度梯度在體外條件下刺激雞外周血淋巴細胞，采用ELISA法測定中藥多糖作用1、2、4 h時細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）的含量，以及作用24 h時鈣離子（Ca2+）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（iNOS）的分泌水平。結果表明，與對照組相比，試驗組能顯著提高細胞培養(yǎng)上清中cAMP、cGMP的水平（P<0.05）。當作用1 h時，100 μg/mL多糖處理組與其他試驗組的cAMP差異顯著（P<0.05）；作用2、4 h時，200 μg/mL多糖組的cAMP、cGMP分泌水平顯著高于其他試驗組。與對照組相比，100、200 μg/mL多糖組能顯著提高細胞培養(yǎng)上清液中Ca2+、NO的分泌水平（P<0.05），25、50 μg/mL多糖組對淋巴細胞中Ca2+、NO的分泌水平無顯著影響（P>0.05）。中藥復方多糖能顯著提高淋巴細胞分泌iNOS的水平（P<0.05），而與其他多糖組相比，100 μg/mL 多糖組淋巴細胞分泌iNOS的水平顯著提高（P<0.05）。中藥復方多糖可通過改變Ca2+、cAMP、cGMP、NO、iNOS等細胞內(nèi)信號分子的活性或含量而啟動細胞信號傳導，從而調(diào)節(jié)細胞的活性和功能，促進相關基因的表達和釋放，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

關鍵詞：中藥復方；多糖；黃麻雞；淋巴細胞；免疫信號分子

中圖分類號： S852.4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0167-03

中草藥具有安全、低毒、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，被廣泛研究并運用到畜禽生產(chǎn)中以有效增強畜禽機體抵抗病原的能力。研究發(fā)現(xiàn)，中草藥中提取的多糖是能夠調(diào)節(jié)畜禽免疫力的主要物質之一[1]。單一活性多糖是近年來中藥免疫藥理學研究的熱點，卻鮮見關于中藥復方多糖的研究。目前，中藥多糖免疫調(diào)節(jié)作用的機制尚未明確。已有研究發(fā)現(xiàn)，中藥多糖通過與免疫細胞表面受體結合，改變環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）、鈣離子（Ca2+）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（iNOS）等免疫細胞內(nèi)信號分子的活性或含量而啟動細胞信號傳導，調(diào)節(jié)細胞的活性和功能，促進相關基因的表達和釋放，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[2-3]。

朱曉慶等研究發(fā)現(xiàn)，中藥復方免疫增強劑能在一定質量濃度范圍內(nèi)增強雞的免疫調(diào)節(jié)作用[4]。本試驗以雞外周血淋巴細胞為研究對象，在體外條件下研究一定純度中藥復方多糖對淋巴細胞中環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）、鈣離子（Ca2+）、一氧化氮（NO）、誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）等信號分子產(chǎn)生的影響，為進一步揭示中藥復方多糖的作用機制提供依據(jù)。

1材料與方法

[HTK]1.1試驗藥物[HT]

中藥復方多糖是由筆者所在實驗室自主開發(fā)的中藥復方免疫增強劑，經(jīng)水提-醇沉法提取后，由AB-8大孔吸附樹脂吸附解吸附后獲得精制中藥多糖，經(jīng)苯酚-硫酸法測定中藥多糖含量為79.6%。采用滅菌蒸餾水將其配制成 200 μg/mL 的中藥復方多糖母液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，于4 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑與儀器

葡萄糖標準品、苯酚、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、乙醇、丙酮、石油醚、濃硫酸均為AR級。雞外周血淋巴細胞分離液（TBD，天津市灝洋生物制品科技有限責任公司），PBS磷酸緩沖液（Hy Clone，賽默飛世而生物化學制品北京有限公司），胎牛血清（Gibco公司），RPMI1640培養(yǎng)基（Hy Clone），雙抗（Gibco公司）。雞cAMP、cGMP、Ca2+、NO、iNOSELISA檢測試劑盒均購自上海藍基生物科技有限公司。

生物安全柜（Thermo公司），CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司），垂直離心機（Thermo公司），OLYMPUS倒置相差顯微鏡，Power Wave XS2 BioTek型酶標儀。

1.3試驗動物

40羽新疆黃麻雞購自石河子市孵化場，按照試驗動物飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)至體質量達1.5～2.0 kg。

1.4試驗方法

1.4.1雞外周血淋巴細胞的分離與培養(yǎng)

采用含EDTA的無菌采血管在雞翅下靜脈采集2 mL血液，將血液用等體積PBS液稀釋混勻，將稀釋的4 mL血液緩慢加入4 mL淋巴細胞分離液層上，采用Ficoll密度梯度離心法（22 ℃，800 g，垂直離心30 min），收集中間層白色云霧狀的外周血單核細胞（PBMC）。得到的細胞經(jīng)5倍體積的PBS（4 ℃）洗滌2次（2 500 r/min，離心10 min），最后采用完全RPMI1640培養(yǎng)液洗滌1次（2 500 r/min，離心10 min）。將細胞重懸在1 mL含15%胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，除去貼壁細胞，收集懸浮細胞。采用PBS緩沖液洗滌細胞2次（1 500 r/min，離心10 min），再用完全RPMI1640培養(yǎng)基重懸懸浮細胞，經(jīng)臺盼藍染色，細胞存活率大于95%，采用細胞計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至5×106個/mL。試驗分為5個組，即空白對照組（多糖質量濃度為 0 μg/mL）以及不同質量濃度多糖組，多糖組的終質量濃度分別為200、100、50、25 μg/mL。

1.4.2淋巴細胞cAMP和cGMP的測定

按上述方法分離培養(yǎng)淋巴細胞，調(diào)整細胞濃度至5×106個/mL。取6個24孔培養(yǎng)板，按以上分組，每組5個孔，每孔加入1 mL淋巴細胞懸液并加入多糖，使其終質量濃度分別達到200、100、50、25、0 μg/mL。將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、2、4 h，分時段離心收集細胞培養(yǎng)上清。按ELISA試劑盒說明書測定cAMP、cGMP的含量。

1.4.3淋巴細胞Ca2+、NO、iNOS的測定

按以上方法分離培養(yǎng)并分組，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，以 3 000 r/min 離心15 min，收集細胞上清液。采用ELISA法測定Ca2+、NO、iNOS的含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.4數(shù)據(jù)分析

各項免疫指標數(shù)據(jù)結果以“平均值±標準差”（x[TX-*5]±s）表示。采用SPSS 17.0軟件對各免疫性狀結果進行單因素方差分析。統(tǒng)計分析結果均以α=0.05作為差異顯著性判斷標準。

2結果與分析

2.1中藥復方多糖對cAMP、cGMP含量的影響

由表1可知，與對照組相比，試驗組顯著提高了細胞培養(yǎng)上清中cAMP、cGMP的水平（P<0.05）。當作用1 h時，與其他試驗組相比，100 μg/mL多糖組的cAMP差異顯著（P<0.05）；當作用2、4 h時，200 μg/mL多糖組的cAMP、cGMP分泌水平顯著高于其他試驗組。[FL）]

3結論與討論

黃芪多糖能使小鼠脾淋巴細胞中cGMP濃度迅速升高，一定劑量的半枝蓮多糖能使小鼠脾淋巴細胞內(nèi)cAMP水平升高[6]。趙飛艷等研究表明，沙蔥多糖可顯著提高淋巴細胞內(nèi)cAMP、cGMP含量[7]。本研究表明，一定純度的中藥復方多糖能顯著提高淋巴細胞培養(yǎng)上清中cAMP、cGMP的水平，且cAMP、cGMP的平均水平隨著時間的延長及中藥復方多糖質量濃度的升高而增加，這與帥學宏等[8]、高建峰等[9]利用其他多糖的研究結果具有相似趨勢。

鈣離子是細胞信號轉導的重要分子之一，對淋巴細胞信號轉導和功能實現(xiàn)具有重要作用[10]。淋巴細胞鈣離子水平直接影響淋巴細胞的分裂、巨噬細胞的吞噬作用并促進 IL-2 的釋放等。研究表明，多糖可引起淋巴細胞內(nèi)鈣離子濃度的改變，從而調(diào)節(jié)機體免疫功能[11]。本研究表明，一定純度的中藥復方多糖能顯著提高淋巴細胞培養(yǎng)上清中Ca2+的水平，這與劉媛等的研究結果[12]相一致。

一氧化氮（NO）是由一氧化氮合成酶（iNOS）催化，經(jīng)多步氧化還原反應而生成的，在生物體內(nèi)是一種重要的信使分子和效應分子[13]。張明等研究發(fā)現(xiàn)，適宜劑量的中藥復方多糖（CPPS）能顯著提高小鼠脾淋巴細胞的增殖活性和細胞培養(yǎng)液中的NO含量，提示CPPS可能通過NO介導信號通路，引起cGMP生成，進而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用[14-16]。余桂朋等研究發(fā)現(xiàn)，艾葉多糖能增強巨噬細胞生成NO的能力，且在試驗劑量范圍內(nèi)存在劑量-效應關系[17]。本研究表明，一定純度的中藥復方多糖能促進雞外周血淋巴細胞中NO、iNOS的生成，這與韓杰等關于一定濃度刺五加多糖對體外培養(yǎng)的仔豬外周血淋巴細胞內(nèi)NO、iNOS影響的研究結果[18]相一致。

一定純度的中藥復方多糖能通過提高細胞內(nèi)Ca2+、NO、iNOS的水平來改變cAMP、cGMP分泌，影響免疫細胞信號的傳導，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

參考文獻：

[1]許欽坤，趙翠燕. 黃芪多糖在家禽上的研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39（10）：5903-5904.

[2]張媛，尚曉婭，徐春蘭，等. 植物多糖對淋巴細胞免疫調(diào)節(jié)功能影響的研究進展[J]. 化學與生物工程，2012，29（12）：1-6.

[3]Kim H S，Kim Y J，Lee H K，et al. Activation of macrophages by polysaccharide isolated from Paecilomyces cicadae through toll-like receptor 4[J]. Food and Chemical Toxicology，2012，50（9）：3190-3197.

[4]朱曉慶，李效振，喬海博，等. 11味中藥多糖提取物對不同 MHC B-LβII基因型雞新城疫抗體水平和IFN-γ、IL-4含量的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學報，2013，44（10）：1685-1692.

[5]戴必勝，蔣林，劉朝亮，等. 中草藥和蘆薈多糖對肉雞cAMP/cGMP與免疫功能的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2008，47（10）：1189-1193.

[6]葉華，鄭學寶. 半枝蓮多糖對小鼠脾淋巴細胞cAMP含量的影響[J]. 廣東醫(yī)學院學報，2009，41（5）：216-219.

[7]趙飛艷，敖長金，薩茹麗，等. 沙蔥多糖對綿羊外周血淋巴細胞信號轉導相關分子的影響[J]. 細胞與分子免疫學雜志，2013，29（11）：1125-1128.

[8]帥學宏，蘇子杰，胡庭俊，等. 山豆根多糖對雞脾臟淋巴細胞信號轉導相關分子水平的影響[J]. 動物醫(yī)學進展，2010，31（1）：36-41.[HJ1.84mm]

[9]高建峰，胡庭俊，高艷艷. 黃芪多糖對小鼠免疫細胞NO-cGMP信號系統(tǒng)的效應[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2008，40（5）：65-67.[ZK）]

[10]Paredes R M，Etzler J C，Watts L T，et al. Chemical calcium indicators[J]. Methods，2008，46（3）：143-151.

[11]汲晨鋒，肖鳳，季宇彬. 青龍衣多糖對S180小鼠紅細胞Ca2+、Mg2+-ATP酶活性及[Ca2+]i的影響[J]. 中草藥，2008，39（12）：1842-1844.

[12]劉媛，趙紅，蔡云，等. 馬尾松花粉多糖硫酸酷化前后對小鼠脾細胞鈣離子濃度的影響[J]. 藥物生物技術，2011（5）：396-398.

[13]楊伊妹，王化冰. NO與自身免疫疾病的免疫調(diào)節(jié)[J]. 中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病志，2004，11（5）：306-308.

[14]張明. 復方中藥多糖對體外脾淋巴細胞增殖、NO生成和蛋白激G的影響[J]. 動物醫(yī)學進展，2010，31（9）：37-40.

[15]勞雪芬，鄒慧，徐筱萌，等. 富硒女貞子水提物、粗多糖對小鼠免疫的影響[J]. 揚州大學學報（農(nóng)業(yè)與生命科學版），2015，36（1）：72-77.

[16]賈俊剛. 補血草多糖對大鼠血清及骨骼肌生化指標的影響[J]. 揚州大學學報（農(nóng)業(yè)與生命科學版），2016，37（4）：32-36.

[17]余桂朋，尹美珍，黃志，等. 艾葉多糖對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能及NO生成的影響[J]. 湖北理工學院學報，2012，28（5）：54-58.

[18]韓杰，邊連全，劉顯軍，等. 刺五加多糖對斷奶仔豬外周血淋巴細胞信號傳導的影響[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014，26（10）：1584-1592.