宰金麗，馬 帥，王 濤，賈秉光，柴淑梅，張 倩，林矯矯，傅志強(qiáng)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

·研究論文·

日本血吸蟲TOR真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在293T細(xì)胞中的表達(dá)

宰金麗，馬 帥，王 濤，賈秉光，柴淑梅，張 倩，林矯矯，傅志強(qiáng)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

本研究擴(kuò)增到日本血吸蟲SjTOR完整的蛋白編碼區(qū)并將其克隆到pXJ40-FLAG載體的Hind Ⅲ、XhoⅠ 酶切位點(diǎn)，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pXJ40-FLAG-TOR。將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，然后應(yīng)用間接免疫熒光、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot檢測其在293T細(xì)胞中的表達(dá)情況。測序結(jié)果表明SjTOR蛋白編碼區(qū)為1245 bp，真核表達(dá)質(zhì)粒pXJ40-FLAG-TOR構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后，應(yīng)用間接免疫熒光染色可觀察到轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞有特異性綠色熒光，空質(zhì)粒對照則未見。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pXJ40-FLAG-TOR 6 h后SjTOR蛋白的基因已有轉(zhuǎn)錄，至轉(zhuǎn)染24 h時(shí)轉(zhuǎn)錄水平最高，隨后開始降低。Western blot結(jié)果顯示SjTOR蛋白分子量約53 kDa，可被FLAG單抗和抗SjTOR-ED1抗血清識(shí)別。結(jié)果表明SjTOR蛋白可以在293 T細(xì)胞中表達(dá)，為進(jìn)一步研究SjTOR蛋白的生物學(xué)功能和DNA疫苗打下了基礎(chǔ)。

日本血吸蟲；TOR蛋白；基因克隆；真核表達(dá)

日本血吸蟲病是我國南方地區(qū)嚴(yán)重危害人民身體健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的人畜共患寄生蟲病，其病原體是日本血吸蟲。血吸蟲尾蚴鉆過終末宿主的皮膚，經(jīng)歷復(fù)雜的移行過程發(fā)育為成蟲后，在哺乳動(dòng)物的下腔靜脈系中長期寄生。血吸蟲是一種古老的寄生生物，在長期進(jìn)化過程中形成了對宿主的適應(yīng)性，特別是其通過各種途徑（分子）逃避宿主免疫損傷，避免被宿主的免疫應(yīng)答所清除，這一現(xiàn)象稱免疫逃避，它是吸血蟲得以在宿主體內(nèi)長期存活并完成生活史的關(guān)鍵[1]。補(bǔ)體反應(yīng)是反應(yīng)非常迅速、級聯(lián)放大的免疫防御機(jī)制，是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要組成部分。研究表明血吸蟲尾蚴突破皮膚屏障后就受到宿主免疫應(yīng)答的攻擊，補(bǔ)體反應(yīng)是宿主最早開始?xì)x體的免疫應(yīng)答[2,3]。已有研究表明在成蟲階段，血吸蟲可通過和補(bǔ)體C1q結(jié)合最終抑制膜攻擊復(fù)合物形成來抑制和調(diào)節(jié)宿主補(bǔ)體反應(yīng)[4,5]。已發(fā)現(xiàn)多個(gè)血吸蟲分子可能和補(bǔ)體免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，并且作用于補(bǔ)體反應(yīng)的多個(gè)節(jié)點(diǎn)[2]。

TOR（trispanning orphan receptor）蛋白是一種位于血吸蟲體被表面抗原受體，可以結(jié)合補(bǔ)體C2a分子[3]，推測其在血吸蟲免疫逃避過程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)室馬帥等[6]克隆了日本血吸蟲TOR基因，利用原核系統(tǒng)表達(dá)了SjTOR基因N端第一個(gè)膜外區(qū)的重組蛋白，該重組蛋白具有較好的抗原性并能誘導(dǎo)顯著的減蟲率。日本血吸蟲TOR全長蛋白的研究尚未見報(bào)道。分析SjTOR基因的翻譯修飾位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)其具有較多的糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)，這些可能對其生物學(xué)功能有重要作用。在大腸桿菌中獲得的重組蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性及構(gòu)象。因此本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pXJ40-FLAG-TOR并在真核細(xì)胞293T細(xì)胞中表達(dá)SjTOR蛋白，為進(jìn)一步在體內(nèi)研究SjTOR全長蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 Trizol、SuperscriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen 公司；Ex Taq DNA 聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD19-T 載體、HindⅢ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）均購自 TaKaRa 生物工程（大連）有限公司；DNA純化回收試劑盒、小型質(zhì)?；厥赵噭┖匈徸?Axygen公司；大型質(zhì)粒純化回收試劑盒購自 QIAGEN 公司；FuGene?HD 轉(zhuǎn)染試劑購自Progema 公司；Anti-FLAG mouse monoclonal antibody購自 CMCTAG 公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗購自北京碧云天生物技術(shù)研究所；pXJ40-FLAG 質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所禽病實(shí)驗(yàn)室保存；Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor? 488 conjugate購自Invitrogen; DAPI 染料購自上海前塵生物科技有限公司；抗熒光淬滅封片液購自sigma公司；293T細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、PBS購自Gibco公司；日本血吸蟲蟲體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所血吸蟲實(shí)驗(yàn)室保存；6 周齡雄性 BALB/c 購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；中國大陸株日本血吸蟲陽性釘螺由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供。

1.2 方法

1.2.1 利用在線軟件預(yù)測SjTOR磷酸化和糖基化位點(diǎn) 分別利用DISPHOS預(yù)測蛋白磷酸修飾位點(diǎn)，YinOYang 1.2 和NetNGlyc 1.0 Server分別預(yù)測氨基酸O型糖基化修飾位點(diǎn)和 N型糖基化修飾位點(diǎn)。

1.2.2 載體構(gòu)建與引物設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)引物分別在SjTOR基因ORF的上、下游引入Hind Ⅲ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)體系與條件參考2×Taq Master Mix（康為世紀(jì)）說明書。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 2 min；94℃變性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 90 s，共34個(gè)循環(huán)；72℃終延伸2min，4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)小量DNA片段快速純化回收試劑盒純化回收后，與pXJ40-FLAG載體進(jìn)行雙酶切連接，轉(zhuǎn)化至DH5α中，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定并進(jìn)行測序驗(yàn)證。將構(gòu)建成功重組質(zhì)粒pXJ40-FLAG-TOR利用QIAGEN 質(zhì)粒抽提試劑盒大量提取質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用完全培養(yǎng)基稀釋到一定的細(xì)胞濃度，分別加入孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)90%左右，按照FuGENE? HD Transfection Reagent試劑盒操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量分析293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染pXJ40-FLAG-TOR基因后的轉(zhuǎn)錄水平 分別于轉(zhuǎn)染細(xì)胞前和轉(zhuǎn)染細(xì)胞后6、12、18、24、30、36、42、48 h收集293 T細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基后用 PBS 洗2次，DEPC水洗1次，然后加入Trizol反復(fù)吹打細(xì)胞，提取細(xì)胞的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以SjTOR的熒光定量 PCR引物和人 GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參，以各轉(zhuǎn)染時(shí)期的細(xì)胞cDNA 為模板，按照SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑說明書進(jìn)行熒光定量 PCR 分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。GAPDH內(nèi)參基因的引物信息見表1。

表1 GAPDH內(nèi)參基因的引物Table 1 Primers for reference gene GAPDH

1.2.5 免疫熒光檢測（immunofluorescence assay，IFA）鑒定蛋白表達(dá) 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，移去培養(yǎng)基，用1×PBS清洗細(xì)胞2次，動(dòng)作要輕柔。固定、透化細(xì)胞后，用3%BSA室溫封閉2 h，加入1∶100稀釋的ED1血清，4℃孵育過夜，吸去一抗，用1×PBST清洗細(xì)胞3次。避光加入1∶2000稀釋的Goat anti-Mouse IgG (H+L) 二抗, Alexa Fluor? 488 conjugate，室溫避光孵育1h；吸去二抗，用1×PBST清洗細(xì)胞3次，動(dòng)作要輕柔，加入細(xì)胞核染色液DAPI避光作用5 min；用1×PBST清洗細(xì)胞3次后用Sigma抗熒光淬滅封片液封片。用倒置熒光顯微鏡觀察熒光情況，拍照保存。

1.2.6 Western blot檢測目的蛋白在不同時(shí)間的表達(dá)情況 分別收取未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以及轉(zhuǎn)染后9、12、15 h的細(xì)胞，加入強(qiáng)裂解液4℃裂解，離心取細(xì)胞裂解液上清進(jìn)行Western blot，分析SjTOR在293T細(xì)胞中的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 在線軟件預(yù)測氨基酸磷酸化和糖基化修飾位點(diǎn)

利用DISPHOS預(yù)測SjTOR蛋白中氨基酸的磷酸化修飾位點(diǎn)，結(jié)果可能存在8個(gè)絲氨酸修飾位點(diǎn)分別是126、127、132、138、140、142、146、155位絲氨酸，4個(gè)蘇氨酸修飾位點(diǎn)分別是148、318、326、405位蘇氨酸，3個(gè)酪氨酸修飾位點(diǎn)分別是129、327、336位酪氨酸。其中10個(gè)修飾位點(diǎn)位于SjTOR的第一個(gè)膜外區(qū)和C末端。應(yīng)用YinOYang預(yù)測氨基酸O型糖基化修飾位點(diǎn)，結(jié)果在138S、376T、379S、405T、407T等5個(gè)氨基酸可能存在O型糖基化修飾，分別位于SjTOR的第一個(gè)膜外區(qū)和C末端。應(yīng)用NetNGlyc 1.0 Server預(yù)測N型糖基化修飾位點(diǎn)，結(jié)果在305NLTG、314NESN、362NLTQ、372NTTS、377NVST、389NTTT、 393NVTS等7個(gè)基序區(qū)可能存在N型糖基化修飾。分析結(jié)果如圖1。

圖1 SjTOR氨基酸磷酸化和糖基化位點(diǎn)分析Fig. 1 Analysis of amino acid phosphorylation and glycosylation sites of SjTOR

2.2 成功構(gòu)建pXJ40-FLAG-TOR 以構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pXJ40-FLAG-TOR為模板進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切片段大小與插入片段大小一致（圖2），序列分析結(jié)果表明插入片段位點(diǎn)方向正確，pXJ40-FLAGTOR真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的SjTOR基因轉(zhuǎn)錄水平 pXJ40-FLAG-TOR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，分別于轉(zhuǎn)染細(xì)胞前和轉(zhuǎn)染細(xì)胞后6、12、18、24、30、36、42、48 h收集293T，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析SjTOR基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后6 h該基因已有轉(zhuǎn)錄，24 h轉(zhuǎn)錄水平達(dá)最高，隨后開始降低，符合瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基因轉(zhuǎn)錄的特征（圖3）。

圖2 重組質(zhì)粒PXJ40-FLAG-TOR酶切鑒定Fig.2 Identifi cation of the recombinant plasmid pXJ40-FLAG-TOR digested by Hind Ⅲ and Xho ⅠM∶ DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL5000); 1∶ pXJ40-FLAG-TORM∶ DNA Marker(DL5000); 1∶ pXJ40-FLAG-TOR

圖3 SjTOR在293T細(xì)胞中不同時(shí)間的轉(zhuǎn)錄水平Fig. 3 Transcription level of SjTOR in 293T cells at different times

2.4 IFA檢測293T細(xì)胞的表達(dá) 在轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色后在倒置熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染pXJ40-FLAG-TOR質(zhì)粒的293T細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光，主要分布于胞質(zhì)和細(xì)胞膜部分，陽性細(xì)胞占比大約為27%，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pXJ40-FLAG的293T細(xì)胞未見綠色熒光（圖4）。

圖4 TOR在293T細(xì)胞中表達(dá)的免疫熒光檢測結(jié)果Fig.4 IFA result of TOR expressed in 293T cells A∶ pXJ40-FLAG-TOR轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h; B∶ pXJ40-FLAG轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h

2.5 Western blot檢測TOR蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá) 分別收取未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后9、12、15 h的293T細(xì)胞，制備細(xì)胞蛋白裂解液，分別應(yīng)用FLAG單抗、抗SjTOR-ED1血清、小鼠正常血清和抗GAPDH單抗進(jìn)行進(jìn)行 Western blot 檢測，結(jié)果FLAG單抗和抗SjTOR-ED1血清均能識(shí)別特異性條帶，分子量大約在53 kDa，小鼠正常血清未識(shí)別任何條帶，GAPDH單抗識(shí)別的蛋白條帶大約在36 kDa，和GAPDH的理論分子量一致。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染9 h時(shí)可見有微量SjTOR蛋白表達(dá)，在轉(zhuǎn)染15 h時(shí)表達(dá)量較高（圖5）。

圖5 Western blot檢測TOR蛋白的表達(dá)情況Fig.5 Western blot analysis of TOR protein expression in 293T cellsA∶一抗為小鼠FLAG單抗; B∶一抗為小鼠SjTOR-ED1三免血清; C∶ 一抗為小鼠陰性血清; D∶ 一抗為GAPDH單抗. M∶ 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)A∶ Anti-FLAG mouse monoclonal antibody ; B∶ Probed by positive mouse serum; C∶ Probed by normal mouse serum; D∶ Anti-GAPDH mouse monoclonal antibody. M∶ Protein molecular weight Marker

3 討論

血吸蟲病嚴(yán)重危害著人畜健康，被認(rèn)為是僅次于瘧疾的全球第二大寄生蟲疾病[7]。吡喹酮藥物在我國血吸蟲病的防控中起到重要作用，但是實(shí)踐表明，由于血吸蟲中間宿主釘螺難以消滅，家畜傳染源未能得到有效控制，單獨(dú)以大規(guī)模吡喹酮治療為主的防治措施難以阻斷血吸蟲病的傳播，且難以解決預(yù)防和重復(fù)感染的難題。因此，加強(qiáng)血吸蟲病疫苗的研制與開發(fā)，將藥物治療的短效作用與疫苗的長效預(yù)防作用相結(jié)合，是血吸蟲病防治的重要發(fā)展方向[8]。

Inal等[9]首先在埃及血吸蟲、曼氏血吸蟲中鑒定到TOR。隨后研究人員發(fā)現(xiàn)TOR廣泛存在于包括早期的硬骨鱈魚以及大鼠和人類等多種生物中[10]。埃及血吸蟲和曼氏血吸蟲TOR的研究結(jié)果表明該分子是一個(gè)有潛力的血吸蟲疫苗候選抗原分子[9]。研究表明TOR可能通過結(jié)合補(bǔ)體C2分子從而干擾補(bǔ)體經(jīng)典途徑的激活[11-15]或者通過阻斷D因子介導(dǎo)的B因子的裂解從而干擾補(bǔ)體替代途徑的激活[16]。

馬帥等[6]研究結(jié)果表明日本血吸蟲TOR蛋白沒有信號(hào)肽，有4個(gè)跨膜區(qū)，SjTOR的ed1是其功能的主要載體。以日本血吸蟲TOR分子的第一個(gè)膜外區(qū)段制備的重組蛋白在小鼠中誘導(dǎo)了較高的免疫保護(hù)效果。本研究分析表明TOR具有多個(gè)潛在的磷酸化和糖基化位點(diǎn)，且多數(shù)位于第一個(gè)膜外區(qū)。重組蛋白在大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)，在純化過程中復(fù)性，由于重組蛋白中的凝血酶因素和重折疊過程中的不確定性有可能使其生物學(xué)功能受影響, 如能成功應(yīng)用真核系統(tǒng)表達(dá)則可以收獲經(jīng)過正確的體內(nèi)折疊的活性蛋白，對其生物學(xué)功能研究有較大的促進(jìn)[17]。本研究成功構(gòu)建了SjTOR的真核表達(dá)質(zhì)粒pXJ40-FLAG-TOR，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后經(jīng)檢測顯示該質(zhì)?？梢栽?93T細(xì)胞中表達(dá)，該研究結(jié)果為TOR功能研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。進(jìn)而可以制備吸血蟲DNA疫苗，在動(dòng)物體內(nèi)評價(jià)SjTOR作為候選疫苗分子的潛力。

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CONSTRUCTION OF EUKARYOTIC EXPRESSION VECTOR OF
SCHISTOSOMA JAPONICUM TOR AND ITS EXPRESSION IN 293T CELLS

ZAI Jin-li, MA Shuai, WANG Tao, JIA Bing-guang, CHAI Shu-mei, ZHANG Qian, LIN Jiao-jiao, FU Zhi-qiang

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The DNA fragment encoding Schistosoma japonicum TOR protein were amplifi ed from cDNA templates by PCR and cloned into pXJ40-FLAG through HindⅢ、XhoⅠto construct the eukaryotic expression plasmid pXJ40-FLAG-TOR. The recombinant plasmid was verifi ed by sequencing and transfected into 293T cells. The expression of the target protein in 293T cell was detected by indirect immunofl uorescence, Western blot and quantitative Real-time PCR. Successful expression of SjTOR protein was confi rmed by the specifi c green fl uorescence in 293T cells after transfection for 48 h and no green fl uorescence in the cell transfected with the control plasmid. Quantitative Real-time PCR results showed that the transcription of SjTOR gene in 293T cells could be detected at 6 h and came to a head at 24 h after trandfection, since then began to decline. Western blot results demonstrated that SjTOR with the molecular weight of 53 kDa was recognized by Anti-FLAG mouse monoclonal antibody and SjTOR-ED1 antiserum. Results showed that the SjTOR proteins could be expressed in 293 T cells, and laid a foundation for further research on SjTOR biological function and its DNA vaccine.

Schistosoma japonicum; TOR protein; gene clone; eukaryotic expression

S852.735

A

1674-6422（2017）01-0066-06

2016-08-16

國家自然科學(xué)基金（31472188）；國家科技支撐計(jì)劃（2015BAI09B04）；上海市領(lǐng)軍人才后備隊(duì)計(jì)劃（201442）

宰金麗，女，碩士研究生，獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

傅志強(qiáng)，E-mail:fuzhiqiang@shvri.ac.cn