趙月蓉 侯碧玉 柳晨歌 王曉波 杜冠華 張 莉* 管淑玉

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

·基礎(chǔ)研究 ·

依帕司他對(duì)2型糖尿病大鼠肝損傷的作用

趙月蓉1,2侯碧玉2柳晨歌2王曉波1,2杜冠華2張 莉2*管淑玉1*

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

目的 探討依帕司他對(duì)2型糖尿病大鼠肝損傷的作用及機(jī)制。方法 SD大鼠經(jīng)高糖高脂飲食喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射45 mg·kg-1鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)建立2型糖尿病大鼠模型，將造模成功的大鼠分為模型對(duì)照組，依帕司他組(100 mg·kg-1)。另取12只正常SD大鼠設(shè)為正常對(duì)照組。依帕司他組連續(xù)8周灌胃給藥，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組給予0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))羧甲基纖維素鈉。觀察依帕司他對(duì)2型糖尿病大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食飲水量、血糖、血脂、肝功能、肝臟組織學(xué)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，并采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝臟組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表達(dá)。結(jié)果 與模型對(duì)照組比較，給藥8周后，依帕司他組大鼠空腹血糖和血脂降低，氧化應(yīng)激反應(yīng)降低，肝功能明顯改善。病理學(xué)檢查結(jié)果表明伊帕司他組大鼠肝臟炎性反應(yīng)和纖維化病變較模型對(duì)照組減輕。免疫組織化學(xué)結(jié)果可見依帕司他組大鼠肝組織α-SMA和TGF-β1表達(dá)顯著低于模型對(duì)照組。結(jié)論 依帕司他能夠提高機(jī)體抗氧化能力，改善2型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激肝損傷，并且能夠通過抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活改善糖尿病大鼠肝纖維化。

依帕司他；2型糖尿??；氧化應(yīng)激；肝纖維化

糖尿病是目前嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一，世界衛(wèi)生組織最新研究報(bào)告[1]顯示，截至2014年，全球糖尿病病人高達(dá)4.22億。預(yù)測(cè)到2030年，糖尿病將成為第七大主要死亡原因。隨著糖尿病發(fā)病率的迅速上升，糖尿病肝損傷病人如非酒精性脂肪肝、肝纖維化、肝癌的病死率也在逐年上升[2]。研究[3]顯示，糖尿病病人中終末期肝病的病死率高于心血管疾病。目前臨床上還沒有專門針對(duì)糖尿病肝病的治療藥物，現(xiàn)在的治療主要是基于糖尿病本身，采用改善胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、糖脂代謝紊亂藥物和肝臟保護(hù)藥物等藥物治療，同時(shí)聯(lián)合高纖維低糖低脂飲食、控制體質(zhì)量等非藥物治療加以控制，但存在療效不確切等問題。

依帕司他為醛糖還原酶抑制劑，臨床上主要用于治療糖尿病神經(jīng)病變，可很好地控制糖尿病病人血糖[4]。近年來研究[5-6]表明依帕司他能有效治療早期糖尿病腎病，而且早期應(yīng)用依帕司他治療能預(yù)防糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。研究[7]顯示，治療劑量的依帕司他能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽合成，改善氧化應(yīng)激，阻止氧化應(yīng)激引起的相關(guān)疾病的發(fā)展。此外依帕司他還能抑制高糖所致的冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移和血管緊張素-Ⅱ(angiotensin, Ang-Ⅱ)刺激的系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的合成[8]。但依帕司他對(duì)糖尿病肝損傷的作用至今鮮見報(bào)道。因此，本研究就依帕司他對(duì)糖尿病肝損傷的作用及機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，160～190 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,清潔級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCKK(京)2014-0004。

1.1.2 藥品與試劑

依帕司他膠囊(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)南京海陵藥業(yè)有限公司)；鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ，Sigma公司，美國(guó))；總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；糖化血清蛋白、丙二醛、超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；8-羥基脫氧鳥苷測(cè)定試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；羅氏全活力型血糖儀、羅氏全活力型血糖試紙(德國(guó)羅氏診斷有限公司)；兔抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體，兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.3 儀器

光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)，全自動(dòng)生化分析儀(日本東芝公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(Control, 12只)和糖尿病造模組(38只)。造模方法參考文獻(xiàn)[9-10]，稍作調(diào)整。造模組大鼠經(jīng)高糖高脂飼料[77.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))基礎(chǔ)飼料，10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖，10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))豬油，2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膽固醇，0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膽酸鹽]喂養(yǎng)4周后，禁食12 h，一次性腹腔注射45 mg·kg-1STZ(以pH4.2的檸檬酸緩沖溶液配制)，正常對(duì)照組注射檸檬酸緩沖液。注射72 h后，動(dòng)物禁食4 h尾尖取血，測(cè)定空腹血糖值。7 d后再次測(cè)定，以空腹血糖值超過11.1 mmol·L-1的動(dòng)物為2型糖尿病大鼠模型。

1.2.2 分組與給藥

選取24只造模成功的糖尿病大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組(Model)和依帕司他組(100 mg·kg-1·d-1，Epal)，每組12只。模型對(duì)照組與依帕司他組持續(xù)飼喂清高脂飼料[87.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))基礎(chǔ)飼料，10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))豬油，2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膽固醇，0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膽酸鹽]。依帕司他組連續(xù)灌胃給藥8周，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌服等量0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium, CMC-Na)。

1.3 樣本收集及指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 一般指標(biāo)

給藥后每周監(jiān)測(cè)動(dòng)物體質(zhì)量。給藥第4周和第8周分別測(cè)定24 h進(jìn)食飲水量，以動(dòng)物初始食水量與24 h后剩余食水量之差為24 h進(jìn)食飲水量。每2周禁食4 h后尾尖取血，采用羅氏血糖儀測(cè)定空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)，測(cè)定當(dāng)天早7∶00禁食，10∶00給藥，11∶00檢測(cè)。

1.3.2 樣本收集

末次給藥后，動(dòng)物禁食過夜，自由飲水，處死取血，取肝組織稱質(zhì)量，計(jì)算肝臟系數(shù)(肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)，留樣用于病理檢測(cè)。

1.3.3 血清指標(biāo)檢測(cè)

全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、三酰甘油(triglyceride，TG)。試劑盒檢測(cè)糖化血清蛋白(glucosylated serum protein，GSP)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)以及8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG)。

1.3.4 肝組織檢查

1)HE染色：大鼠肝組織用組織固定液固定，石蠟包埋后切片脫蠟水化，Harris蘇木素染3～8 min，1%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸乙醇分化數(shù)秒，氨水返藍(lán)，伊紅染色3 min，二甲苯脫水至透明，晾干，中性樹膠封片。400倍光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理學(xué)變化。

2)Masson染色：大鼠肝組織石蠟包埋后切片脫蠟水化，Regaud蘇木精染色液染核5～10 min，先水洗后蒸餾水洗。Masson麗春紅酸性復(fù)紅液染色5～10 min，2%(體積分?jǐn)?shù))冰醋酸浸洗數(shù)秒，1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))磷鉬酸分化5 min。苯胺藍(lán)染色5 min，0.2%(體積分?jǐn)?shù))冰醋酸浸洗數(shù)秒。95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、無水乙醇、二甲苯逐級(jí)脫水至透明，晾干，中性樹膠封固。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維及紅細(xì)胞呈紅色。隨機(jī)選取5個(gè)視野，用Image-ProPlus 6.0軟件計(jì)算膠原纖維面積。

3)苦味酸-天狼星紅染色：大鼠肝組織石蠟包埋后切片脫蠟水化，苦味酸-天狼星紅染液染色8 min；無水乙醇分化，鏡下控制顯色；切片于60 ℃烘箱烤干，二甲苯5 min至透明，中性樹膠封片，膠原纖維著色，其中Ⅰ型膠原纖維為黃色或紅色，Ⅲ型膠原纖維為綠色。隨機(jī)選取5個(gè)視野用偏振光顯微鏡拍照，對(duì)Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維束用Image-ProPlus 6.0軟件分別分析吸光度。

4)免疫組織化學(xué)染色：大鼠肝組織石蠟包埋后切片脫蠟水化，室溫條件下3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2溶液避光孵育25 min；PBS沖洗3次，每次5 min；3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA室溫封閉30 min；加兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體(1∶1 000)或兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min。加酶標(biāo)羊抗兔二抗，室溫孵育50 min，PBS沖洗，0.02%(體積分?jǐn)?shù))DAB顯色10 min；自來水沖洗終止染色。Harris蘇木素復(fù)染色3 min，自來水洗，1%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸乙醇分化數(shù)秒，氨水返藍(lán)，流水沖洗。二甲苯脫水15 min至透明，晾干，中性樹膠封片。每組隨機(jī)選取5例，每例選取5個(gè)視野在400倍光學(xué)顯微鏡下拍照，并用Image-Pro Plus 6.0軟件分析陽(yáng)性區(qū)域吸光度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 依帕司他對(duì)糖尿病大鼠體質(zhì)量、肝臟系數(shù)和24 h進(jìn)食飲水量的影響

如表1所示，與正常對(duì)照組相比，2型糖尿病大鼠體質(zhì)量明顯減輕，肝臟系數(shù)顯著增加(P<0.01)，依帕司他連續(xù)給藥8周對(duì)2型糖尿病大鼠體質(zhì)量和肝臟系數(shù)沒有顯著影響。模型對(duì)照組大鼠進(jìn)食進(jìn)水量相較正常組明顯增多(P<0.01)。依帕司他組大鼠進(jìn)食量和進(jìn)水量均有降低，其中進(jìn)水量改善作用明顯，與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示依帕司他能改善糖尿病大鼠多飲多食的癥狀。

表1 依帕司他對(duì)糖尿病大鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)、進(jìn)食和飲水量的影響

ItemBodyweight/gLivercoefficient/%Foodintake/gWaterintake/gControl452．5±39．070．028±0．00325．51±8．7045．01±18．44Model267．5±52．22??0．070±0．012??33．41±4．89132．30±24．55??Epalrestat251．1±34．770．065±0．01524．04±7．8598．18±15．19#F33．31052．5601．41619．790P0．4690．3920．1520．037

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

2.2 依帕司他對(duì)糖尿病大鼠空腹血糖、糖化血清蛋白及血脂的影響

與正常對(duì)照組比，2型糖尿病大鼠空腹血糖顯著升高(P<0.01)。給藥2周依帕司他開始出現(xiàn)降糖作用，空腹血糖較模型對(duì)照組降低(圖1A)，給藥8周差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。如圖1B所示，給藥8周依帕司他組GSP的量較模型對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，提示依帕司他可良好控制糖尿病大鼠血糖。

如圖1C～1E所示，模型對(duì)照組TC、TG、LDL濃度與正常對(duì)照組相比明顯升高(P<0.01)，模型動(dòng)物出現(xiàn)血脂代謝異常。依帕司他組上述指標(biāo)較模型對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，提示依帕司他能降低糖尿病大鼠血脂，改善脂代謝。

2.3 依帕司他對(duì)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激水平的影響

如圖2所示，模型對(duì)照組動(dòng)物SOD活力較正常對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，MDA和8-OHdG的量明顯升高(P<0.01)。依帕司他組SOD活力與模型對(duì)照組相比升高顯著、MDA的量降低明顯(P<0.01)，8-OHdG的量有降低趨勢(shì)，但較模型對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示依帕司他可提高機(jī)體抗氧化能力，減輕糖尿病大鼠氧化應(yīng)激損傷。

2.4 依帕司他對(duì)糖尿病大鼠肝功能的影響

如圖3所示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組血清ALT、AST濃度明顯升高(P<0.05)，說明動(dòng)物肝臟受損。依帕司他給藥8周，AST、ALT與模型對(duì)照組相比分別降低了15.47%和42.95%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示依帕司他能改善2型糖尿病大鼠肝功能。

圖1 依帕司他對(duì)糖尿病大鼠空腹血糖、糖化血清蛋白及血脂的影響

圖2 依帕司他對(duì)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激的影響

圖3 依帕司他給藥8周對(duì)糖尿病大鼠肝功能的影響

2.5 依帕司他對(duì)糖尿病大鼠肝組織病理學(xué)改變的影響

HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4A)；模型對(duì)照組肝臟出現(xiàn)細(xì)胞腫脹，匯管周圍出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維結(jié)締組織明顯增多(圖4B)；依帕司他組可見部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但較模型對(duì)照組少，纖維結(jié)締組織有所減少(圖4C)。

圖4 依帕司他對(duì)糖尿病大鼠肝臟病理學(xué)改變的影響

2.6 依帕司他對(duì)糖尿病大鼠肝臟組織纖維化的影響

Masson染色結(jié)果(圖5A)表明正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，基本沒有發(fā)生纖維化改變。而模型對(duì)照組肝組織出現(xiàn)空泡，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，匯管區(qū)有大面積纖維結(jié)締組織增生和纖維膠原沉積，部分細(xì)胞明顯變性或壞死，顯示為早期纖維化。經(jīng)苦味酸-天狼星紅染色的肝組織可在偏振光顯微鏡下顯示不同類型的嗜酸性膠原蛋白纖維束。其中I型膠原纖維為黃色或紅色，排列緊密，折光性很強(qiáng)；Ⅲ型膠原纖維為綠色，呈疏松網(wǎng)狀，折光性較弱。如圖5B所示，正常對(duì)照組只有極少量膠原纖維，而模型對(duì)照組Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維明顯增加。依帕司他組與模型對(duì)照組相比，Ⅲ型膠原纖維明顯減少(P<0.05，圖5C)，Ⅰ型膠原纖維稍有減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5D)。結(jié)果表明依帕司他具有改善糖尿病大鼠肝纖維化的作用。

2.7 依帕司他對(duì)糖尿病大鼠肝臟組織TGF-β1表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示(圖6A)，正常對(duì)照組肝組織有極少量棕黃色TGF-β1在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，著色較淺，僅見于匯管區(qū)周圍。模型對(duì)照組TGF-β1表達(dá)明顯增加，肝組織大面積深染，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加明顯。依帕司他組肝臟組織陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，TGF-β1表達(dá)明顯降低，與模型對(duì)照組相比具有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖6B)。

2.8 依帕司他對(duì)糖尿病大鼠肝臟組織α-SMA表達(dá)的影響

α-SMA是肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示(圖7A)，正常對(duì)照組肝組織僅有極少量α-SMA表達(dá)。模型對(duì)照組α-SMA表達(dá)顯著增加，呈棕黃色，著色較深，以匯管區(qū)和纖維間隔較為突出，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有所增加，說明肝星狀細(xì)胞被激活。依帕司他組α-SMA表達(dá)量和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，與模型對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖7B)。提示依帕司他可能是通過抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活，從而降低α-SMA表達(dá)，改善糖尿病大鼠肝纖維化。

圖5 依帕司他對(duì)糖尿病大鼠肝組織纖維化的影響

圖6 依帕司他對(duì)糖尿病大鼠肝組織TGF-β1表達(dá)的影響

圖7 依帕司他對(duì)糖尿病大鼠肝組織α-SMA表達(dá)的影響

3 討論

胰島素抵抗和由此所致的糖脂代謝異常是2型糖尿病的重要病理特征，可引起肝臟多方面的損傷，包括脂肪肝、脂肪性肝炎、肝硬化和肝癌等。其確切發(fā)病機(jī)制目前并未完全闡明，但脂代謝紊亂被認(rèn)為是誘發(fā)脂肪肝的重要機(jī)制之一。本研究采用高糖高脂飲食聯(lián)合腹腔注射小劑量STZ誘導(dǎo)建立2型糖尿病大鼠模型，肝功能檢查及肝臟病理結(jié)果顯示糖尿病大鼠肝臟出現(xiàn)炎性反應(yīng)及纖維化損傷。依帕司他治療8周能夠改善糖尿病大鼠多食多飲癥狀，降低糖尿病大鼠空腹血糖及血脂濃度，改善糖脂代謝紊亂。

糖尿病病人的持續(xù)高血糖狀態(tài)可引起機(jī)體產(chǎn)生糖化氧化或自氧化作用從而導(dǎo)致糖尿病病人體內(nèi)產(chǎn)生過量的活性氧，引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激[11]。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是影響糖尿病合并癥發(fā)展的重要因素之一。研究[12-13]表明，氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化在肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用。游離膽固醇的增加會(huì)上調(diào)引起活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的相關(guān)酶的活性，下調(diào)抗氧化酶活性，從而使氧化應(yīng)激加劇[14]，促進(jìn)肝纖維化小鼠病情的發(fā)展。MDA的量升高是機(jī)體細(xì)胞受自由基損傷的表現(xiàn)，而SOD活力則是機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)[15]。已有研究[16]表明，依帕司他能夠減少2型糖尿病病人紅細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化物的量，增強(qiáng)糖尿病大鼠抗氧化酶SOD活力，減輕氧化應(yīng)激對(duì)其造成的組織損傷[17]。本研究顯示，糖尿病大鼠血脂升高，機(jī)體脂代謝嚴(yán)重紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物MDA大量積累，抗氧化酶SOD活性降低，機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激標(biāo)志物8-OHdG釋放增加，加重肝損傷。依帕司他治療8周，糖尿病大鼠血脂濃度和脂質(zhì)過氧化物的量顯著降低，抗氧化酶活性升高，氧化應(yīng)激得到明顯改善，肝功能指標(biāo)ALT和AST降低，肝組織病理學(xué)檢查顯示肝臟炎性病變有所緩解，表明依帕司他可通過改善脂代謝紊亂，減少脂質(zhì)過氧化物的積累，提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力從而減輕糖尿病大鼠肝損傷。

肝纖維化是肝硬化的前期階段，也是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)途徑，其病理改變可以逆轉(zhuǎn)。但如若治療不及時(shí)，嚴(yán)重者可能會(huì)發(fā)展成肝硬化甚至肝癌[18-19]。本研究中Masson染色和天狼星紅染色顯示糖尿病大鼠肝臟出現(xiàn)大面積膠原纖維沉積和嗜酸性膠原纖維束積累，表現(xiàn)為早期肝纖維化病變。TGF-β1是重要的致纖維化因子，當(dāng)肝實(shí)質(zhì)受損后，肝細(xì)胞釋放大量TGF-β1。TGF-β1可以促進(jìn)各種膠原成分和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的積累，進(jìn)而導(dǎo)致HSC的活化和增生，引起肝纖維化的發(fā)生[20]。同時(shí)活化的HSC又能自分泌TGF-β1，自分泌的TGF-β1又作用于HSC，形成惡性循環(huán)，并導(dǎo)致ECM不斷產(chǎn)生和沉積，進(jìn)一步促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展[21]。肝纖維化模型研究[22]證實(shí), 通過阻斷TGF-β相關(guān)信號(hào)通路或RNA干涉等技術(shù)抑制TGF-β的表達(dá)可阻止肝纖維化。本研究顯示依帕司他治療8周可明顯改善糖尿病大鼠肝組織結(jié)構(gòu)病變程度，減輕肝臟膠原組織增生，降低肝組織TGF-β1表達(dá)，說明依帕司他可能通過抑制HSC的激活，減輕糖尿病大鼠肝纖維化病變。另有研究[23]表明，依帕司他能夠降低TGF-β1所致的肺纖維母細(xì)胞中醛糖還原酶的表達(dá)，通過抑制醛糖還原酶的活性改善博萊霉素引起的大鼠肺纖維化；而且能夠減少大鼠腎小球系膜細(xì)胞的膠原沉積[24]。關(guān)于本研究中依帕司他是否能通過抑制醛糖還原酶的活性反饋抑制TGF-β1的增加從而對(duì)肝纖維化大鼠發(fā)揮作用尚需研究證實(shí)。

α-SMA作為肝星狀細(xì)胞激活的標(biāo)志，在HSC活化程度和肝纖維化進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。被激活的HSC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化成為肌成纖維細(xì)胞，并導(dǎo)致α-SMA表達(dá)增加，從而大量合成ECM，使活化得以持續(xù)，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展[25-26]。據(jù)報(bào)道[27]肝纖維化大鼠α-SMA的蛋白表達(dá)明顯增加，且與肝纖維化程度呈正相關(guān)。本研究顯示，糖尿病大鼠肝臟纖維化病變明顯，Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維以及肝組織α-SMA表達(dá)顯著增加。依帕司他治療8周能夠減少糖尿病大鼠肝臟膠原纖維的產(chǎn)生，下調(diào)肝組織α-SMA的表達(dá)，提示依帕司他可能是抑制了HSC的激活，從而減少了ECM的合成和分泌，改善肝纖維化。

糖尿病肝損傷的早期癥狀并不明顯，病人往往是在肝臟受損比較嚴(yán)重的時(shí)候才被發(fā)現(xiàn)，因此導(dǎo)致治療難度增加。而且由于國(guó)內(nèi)臨床上對(duì)糖尿病與肝損傷的關(guān)系重視度不夠，使得現(xiàn)在對(duì)于糖尿病肝損傷病人仍然沒有確切的治療藥物。本研究發(fā)現(xiàn)依帕司他能夠改善糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂，提高機(jī)體抗氧化能力，減輕糖尿病大鼠氧化應(yīng)激和肝臟炎性反應(yīng)。依帕司他能夠下調(diào)糖尿病大鼠肝組織TGF-β1和α-SMA的表達(dá)，緩解糖尿病大鼠肝纖維化的發(fā)展，其作用機(jī)制可能和抑制HSC的激活有關(guān)，但其確切的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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編輯 孫超淵

Effect of epalrestat on liver injury in type 2 diabetic rats

Zhao Yuerong1,2,Hou Biyu2,Liu Chenge2, Wang Xiaobo1,2, Du Guanhua2, Zhang Li2*, Guan Shuyu1*

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.BeijingKeyLaboratoryofDrugTargetResearchandDrugScreening,InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100050,China)

Objective This study investigated the effect of epalrestat on liver injury in rats with type 2 diabetic mellitus (T2DM). Methods SD rats were fed with high-fat and high-sucrose diet for four weeks, then 45 mg·kg-1Streptozotocin (STZ) was injected intraperitoneally to make the animal model of type 2 diabetes. Diabetic rats were divided into two groups as the model group and the epalrestat group (100 mg·kg-1), another 12 normal SD rats were served as the control group. The diabetic rats were treated with or without epalrestat by gavaging for 8 weeks. Body weight, food and water intake, blood glucose level, blood lipids were measured; liver function, liver pathological changes and oxidative stress were examined. Immunohistochemistry of α-smooth muscle actin (α-SMA)and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) were conducted. Results Compared with the model group, epalrestat could reduce the concentration of fasting plasma glucose and blood lipids. The index for liver condition and oxidative stress were down regulated. Pathological examination showed that lesions of hepatic inflammation and fibrosis were significantly alleviated. The expressions of α-SMA and TGF-β1 were markedly reduced in liver tissues of type 2 diabetic rats with the treatment of epalrestat. Conclusion Epalrestat could alleviate liver inflammation and hepatic fibrosis of rats with T2DM via anti-oxidative stress and inhibiting the activation of hepatic stellate cell.

epalrestat;type 2 diabetic mellitus;oxidative stress;hepatic fibrosis

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2013ZX09508104)。This study was supported by National Science and Technology Major Projects for “Major New Drugs Innovation and Development” (2013ZX09508104).

時(shí)間：2017-04-13 19∶39

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.1939.014.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.021]

R96

2016-12-15)

*Corresponding authors， E-mail：guanshy3@163.com; zhangli@imm.ac.cn