冷東澤 ， 張培軍 ， 焦 雪 ， 巴翠玉 ， 李月紅

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院， 長春130118 ; 2.吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心, 吉林長春1300001)

1株鯽源維氏氣單胞菌的分離鑒定

冷東澤1， 張培軍2， 焦 雪1， 巴翠玉1， 李月紅1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院， 長春130118 ; 2.吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心, 吉林長春1300001)

為快速分離鑒定鯽魚出血性敗血癥致病因子，從病死鯽魚肝臟分離細菌，經(jīng)LB固體培養(yǎng)基劃線分離，28 ℃，24 h培養(yǎng)后，見圓潤光滑、表面微凸的菌株呈優(yōu)勢生長，挑取單菌落命名為AX002。觀察該菌在RYAN培養(yǎng)基28 ℃，24 h后生長成深綠色有深核菌落，同條件在RS培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后長成黃色菌落，后逐步由內(nèi)向外變?yōu)榫G色菌落，通過全自動細菌鑒定系統(tǒng)，檢測AX002對蔗糖等23種指標呈陽性反應(yīng)，對山梨醇等22種指標呈陰性反應(yīng)。設(shè)計引物擴增16S rDNA和促旋酶亞基(gyrB)基因并測序。測序結(jié)果與NCBI中其他菌株序列進行比對，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，確定AX002為維氏氣單胞菌。同時該系統(tǒng)顯示該菌對阿米卡星、頭孢唑啉、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星等15種抗生素敏感。該菌對頭孢唑啉、氨芐西林和氨芐西林舒巴坦鈉三中抗生素藥物最低抑菌濃度>16 μg/mL，對四環(huán)素最低抑菌濃度>8 μg/mL，結(jié)果判定AX002對頭孢唑啉、氨芐西林、氨芐西林舒巴坦鈉和四環(huán)素具有耐藥性。該菌對體長5～15 cm，體重30～50 g鯽魚腹腔注射，測定半致死濃度(LD50)為2.38×107CFU/mL。本研究有利于進一步研究維氏氣單胞菌。

鯽魚； 分離鑒定； 維氏氣單胞菌

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)，又稱維隆氣單胞菌、維羅納氣單胞菌和凡隆氣單胞菌，是廣泛存在江河、湖泊、淤泥等自然環(huán)境中的革蘭陰性菌。該菌較嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)等氣單胞菌間檢出概率最高，可達到70%以上[1]，其為動物體內(nèi)正常微生態(tài)細菌，當環(huán)境改變或者動物機體免疫力下降時，可變成致病性細菌[2]。維氏氣單胞菌是對人-獸-魚的條件性致病菌。近年有文獻報道，該菌對錦鯉、斑點叉尾鮰、西伯利亞鱘和泥鰍等水產(chǎn)魚類具有致病性[3-6]。國內(nèi)報道中，維氏氣單胞菌對多種水產(chǎn)魚類具有感染致病性，如白緣、團頭魴、黃顙等[7-10]。該菌一旦暴發(fā)，可引起水產(chǎn)動物出血性敗血癥而大量死亡。本研究通過生化和分子鑒定方法，確定分離株為維氏氣單胞菌。

1 試驗材料

1.1 樣品來源 患出血性敗血疾病病魚體長5～15 cm，體重30～50 g,病魚樣品主要表現(xiàn)為腹部充血、滲血，部分泄殖腔、眼底充血。

1.2 試驗動物 鯽魚140尾，體長5～15 cm，體重30～50 g，體表健康，連續(xù)飼養(yǎng)兩周確定生命狀態(tài)穩(wěn)定無發(fā)病死亡。

1.3 主要試劑 RYAN和RS培養(yǎng)基基礎(chǔ)和微生物培養(yǎng)基添加劑，購自海博生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；DL-2 000 Marker、TaqDNA聚合酶，購自Invitrogen公司；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 細菌的分離 取病魚肝臟磨碎，生理鹽水稀釋后，28 ℃ 經(jīng)LB培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落移接到LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)12 h，制成菌懸液，命名AX002。

2.2 細菌的鑒定

2.2.1 鑒別培養(yǎng)基鑒定 參照說明書配置RYAN和RS培養(yǎng)基。

2.2.2 生化鑒定 使用鳳凰全自動細菌鑒定生化試驗檢測系統(tǒng)，革蘭陰性菌鑒定板51孔槽，15 h后觀察生化試驗結(jié)果及其分析。并與維氏氣單胞菌生化試驗對比。

2.2.3 分子鑒定 (1)16S rDNA PCR鑒定：根據(jù)氣單胞菌特異基因16S rDNA保守片段(模板X74677)，利用Primier 5.0軟件設(shè)計一對16S rDNA特異性引物并分析特異性，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。使用蒸餾水將引物稀釋至10 μmol/L，分裝-20 ℃保存。引物分別是16sw 5′-CTAATACCGCATACGCCCTAC-3′、16sx 5′-TAGCGATTCCGACTTCACG-3′，目的長度1 179 bp，反應(yīng)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取2 μL PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖膠電泳20 min，膠電泳圖像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并保存，將檢出目標長度1 179 bp的PCR產(chǎn)物未純化狀態(tài)送至博仕生物公司測序；(2)gyrB PCR鑒定：保守基因序列促旋酶亞基(gyrB)引物來源于Yanez，M[11]等人設(shè)計，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，使用蒸餾水將引物稀釋至10 μmol/L，分裝-20 ℃保存。引物名稱分別是gyrBw 5＇-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′、gyrBx 5＇-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3＇，目標長度1 100 bp，反應(yīng)參數(shù)為 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min,59 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取2 μL PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖膠電泳20 min，膠電泳圖像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并保存。將PCR產(chǎn)物未純化狀態(tài)送至博仕生物公司測序；(3)序列分析：利用Chromas軟件翻譯測序后的堿基序列，將得到的16S rDNA和gyrB序列同NCBI已被上傳的基因序列比對，得出檢測結(jié)果。MEGA6軟件根據(jù)近鄰結(jié)合法建立基因系統(tǒng)發(fā)育樹，為進一步確定AX002發(fā)育淵源。

2.3 藥物敏感性 根據(jù)鳳凰全自動細菌鑒定藥敏檢測系統(tǒng)，藥敏試驗鑒定板為革蘭陰性菌藥敏板85孔槽，15 h候觀察結(jié)果及分析。

2.4 動物回歸感染試驗 (1)活菌計數(shù)：搖菌12 h后的菌懸液按10倍梯度稀釋，第4次、第5次、第6次10倍稀釋后的懸液各3組，取1 mL稀釋懸液均勻涂布在LB瓊脂培養(yǎng)基上，待長出單個菌落后，計算懸液中菌株存在數(shù)量；(2)動物回歸感染：7組健康鯽魚共140尾，每尾腹腔注射0.3 mL各菌株濃度為1×103CFU/mL、1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107CFU/mL、1×108CFU/mL劑量的菌懸液，組7為生理鹽水對照組。攻毒后截止72 h統(tǒng)計各組死亡魚數(shù)量，并做記錄。根據(jù)寇氏法[12]計算半致死濃度。

3 結(jié)果

3.1 分離結(jié)果 從病死魚肝胰臟部位分離得到的優(yōu)勢生長的圓潤、光滑、黃色細菌菌株。

3.1.1 鑒別培養(yǎng)基結(jié)果 AX002在RYAN固體培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)24 h后，生長呈深綠色有深核圓潤微凸光滑菌落，與張碧波[13]等研究報道的氣單胞菌在RYAN生長狀態(tài)相符。在RS培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)24 h后生長呈黃色菌落，之后逐漸由內(nèi)向外變色，直至全部變?yōu)榫G色，即同培養(yǎng)基相同顏色。根據(jù)以上試驗結(jié)果觀察，初步確定AX002為氣單胞菌。

3.1.2 生化鑒定結(jié)果 如表1所示，維氏氣單胞菌AX002與葡萄糖、蔗糖、核糖醇、4MU-N-乙酰-BD-氨基葡萄苷等呈陽性反應(yīng)，表明該菌能夠發(fā)酵或利用以上物質(zhì)，而與山梨醇、L - 阿拉伯糖、麥芽酮糖、鳥氨酸等物質(zhì)呈陰性反應(yīng)。參照Nicky B.Buller[14]所著，徐高蓉等人所譯的《魚類及其他水生動物細菌使用鑒定指南》得出該生化試驗結(jié)果與維氏氣單胞菌溫和亞種(A.veroniispp.spnroa)生化反應(yīng)結(jié)果[15-19]最為相近。

表1 AX002生化試驗結(jié)果

+：生化反應(yīng)陽性;-：生化反應(yīng)陰性

3.1.3 分子鑒定結(jié)果 經(jīng)細菌DNA模板提取，16S rDNA與gyrB在PCR反應(yīng)后分別得出1 179 bp和 1 100 bp 目的基因條帶(圖1)，將PCR未純化產(chǎn)物送至博仕生物公司測序后得到兩段目的基因序列結(jié)果，將兩段基因的測序結(jié)果與GANBANK已上傳了的序列相比對，其中16S rDNA比對結(jié)果顯示，AX002與維氏氣單胞菌WX153415(KT964297.1)100%高度同源，gyrB比對結(jié)果顯示與維氏氣單胞菌XX-60(JX025938.1)99%高度同源。從16S rDNA所建立的基因系統(tǒng)發(fā)育樹上(圖2)觀察可見,AX002與維氏氣單胞菌菌株WX153415、G18、x-n-602聚為一支，而與其他氣單胞菌不能聚類。gyrB系統(tǒng)發(fā)育樹上(圖3)可見，與維氏氣單胞菌菌株XX-60聚為一支，而與其他氣單胞菌不能聚類。由此可鑒定AX002為維氏氣單胞菌。通過系統(tǒng)發(fā)育樹還可以觀察到維氏氣單胞菌與溫和氣單胞菌具有一定近緣關(guān)系。如溫和氣單胞菌菌株14H11和溫和氣單胞菌菌株S8。

圖1 16S rDNA和gyrB PCR結(jié)果

M：DL-2 000，1：16S rDNA PCR結(jié)果，2：gyrB PCR結(jié)果

圖2 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 gyrB系統(tǒng)發(fā)育樹

3.2 藥敏結(jié)果 根據(jù)19種抗生素對維氏氣單胞菌AX002進行耐藥性試驗結(jié)果顯示，該菌對阿米卡星、頭孢唑啉、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星等15種抗生素敏感；對頭孢唑啉、氨芐西林、氨芐西林舒巴坦鈉、四環(huán)素4種抗生素表現(xiàn)出具有耐藥性(具體見表1～2)。

表2 藥敏結(jié)果

注：“S”表示敏感;“R”表示耐藥(判定標準為:2012 CLSI M100-S22 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing;TwentySecond Informational Supplement)

3.3 動物回歸感染試驗結(jié)果 將菌懸液分組注射到健康鯽魚腹腔，觀察發(fā)病死亡情況(表2)，腹腔注射菌懸液后，魚開始停止攝食，24 h開始大批發(fā)病并且出現(xiàn)個別死亡現(xiàn)象，發(fā)病魚游動緩慢，神經(jīng)麻痹，幾乎對外界的刺激沒有反應(yīng)，腹部表面嚴重充血，泄殖腔紅腫、充血，腹部腫大。48 h后死亡魚條數(shù)開始增多，72 h后開始大批死亡達到高峰，繼而停止死亡，而對照組無發(fā)病和死亡現(xiàn)象。根據(jù)寇氏法得出菌AX002對體長5～15 cm，體重30～50 g鯽魚半致死濃度(LD50)為2.38×107CFU/mL。

表3 動物回歸感染試驗結(jié)果

注：組1細菌劑量為3×103CFU、組2細菌劑量為3×104CFU、組3細菌劑量為3×105CFU、組4細菌劑量為3×106CFU、組5細菌劑量為3×107CFU、組6細菌劑量為3×108CFU、組7為生理鹽水對照組

4 討論

氣單胞菌廣泛存在在水自然環(huán)境，同時也是人和動物、魚腸道內(nèi)正常存在的菌群，而如嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌等也是多種水產(chǎn)動物的條件致病菌[20]，常給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶了較大的經(jīng)濟損失。

AX002的16S rDNA測序結(jié)果在NCBI BLAST過程中，同溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等氣單胞菌種，該段基因同樣具有高度相似性，難以具體區(qū)分，相比之下gyrB的BLAST便可一目了然確定同維氏氣單胞菌最高相似。但是在做出系統(tǒng)進化樹結(jié)果后不難發(fā)現(xiàn)，16S rDNA測序方法同樣可以鑒定維氏氣單胞菌，具體結(jié)果可以看出，該菌和維氏氣單胞菌聚為一支，與溫和氣單胞菌雖然發(fā)育較近卻不在同一分支上，所以16S rDNA和gyrB兩段保守基因都可以鑒定氣單胞菌。由于氣單胞菌是在近年被獨立確定到氣單胞菌科中，本試驗通過兩段保守基因序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，可進一步確定維氏氣單胞菌的發(fā)育地位。

細菌生化鑒定這種方法能夠較為準確的鑒別氣單胞菌，但是有時結(jié)果可能會出現(xiàn)偏差[1]，常常錯誤鑒定為弧菌。僅可作為氣單胞菌分離鑒定中的初篩選，目前通過生化試驗鑒定氣單胞菌種屬研究尚無明確結(jié)論。凌紅麗[20]創(chuàng)建RS和AHM鑒別培養(yǎng)基的組合應(yīng)用，該應(yīng)用成功區(qū)分氣單胞菌與其他菌種，但是該組合還是不能完成氣單胞菌間的鑒別。如溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、中間氣單胞菌在該組合中均呈陽性反應(yīng)，即24 h內(nèi)菌落呈黃色，繼而變色為培養(yǎng)基同種顏綠色。近年來16S rDNA基因測序鑒定氣單胞菌成為熱門，該段基因是氣單胞菌的看家基因，被稱為細菌的活化石，具有非常高的保守性。氣單胞菌的另一段看家基因促旋酶亞基(gyrB),該段基因堿基的替換率為每百萬年出現(xiàn)0.7%～0.8%變異率，相對16S rDNA在每千萬年進化1%要快出來許多，可彌補16S rDNA無法區(qū)分的細菌近親近緣種屬。促旋酶亞基在維持DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)中起到關(guān)鍵作用。在促旋酶亞基上設(shè)計一段引物，經(jīng)過PCR基因測序后，在NCBI上BLAST，根據(jù)已公布的該基因片段比對，同源性一致的可做氣單胞菌種屬鑒定。由于該基因不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，可以作為系統(tǒng)發(fā)育分析的靶基因，同時16S rDNA和gyrB兩段基因互補分析，能夠更好的鑒別氣單胞菌并建立復(fù)雜的系統(tǒng)發(fā)育基因樹[21]，目前氣單胞菌的這兩段基因在NCBI上已被大量上傳，為該菌的進一步研究提供有力基礎(chǔ)。維氏氣單胞菌在進化樹上可見與溫和氣單胞菌相近，卻不同分枝上，這兩種菌具體區(qū)別與比較還有待更多的研究與發(fā)現(xiàn)。

動物回歸感染試驗測定該菌對鯽魚具有一定弱毒性，并且攻毒后72 h出現(xiàn)病死高峰，可見維氏氣單胞菌致鯽魚出血性敗血癥發(fā)病之急，應(yīng)予以重視。

[1] 胡萌.江蘇地區(qū)氣單胞菌分離鑒定及強毒株生物學特性分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2012.

[2] Fraisse T,Lechiche C,Sotto A,etal.Aeromonasspp.Infections:retrospective study in Nmes University Hospital，1997-2004[J].PathologieBiologie,2008,56:70-76.

[3] 潘曉藝，沈錦玉，李建應(yīng)，等.青蝦“軟殼綜合癥”病原及其特性[J].微生物學通報，2009，36(10):1571-1576.

[4] 秦蕾，徐靜，張曉君.泥鰍的凡隆氣單胞菌感染[J].中國人獸共患病雜志，2008，24(12):1100-1102.

[5] 馬志宏，楊慧，李鐵梁，等.西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定[J].微生物學報，2009，49(1):1289-1294.

[6] Gonzalez-Serrano C J，Santos J A，Garcia-Lopez M L，etal.Virulence markers inAeromonashydrophilaandAeromonasveroniibiovar sobria isolates from freshwater fish and from a diarrhoea case[J].Journal of Applied Microbiology，2002,93(3):414-419.

[7] 馬志宏，楊慧，李鐵梁，等.西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定[J].微生物學報，2009，49(10):1289-1294.

[8] 楊澤曉，周亞，任冉陽，等.白緣(魚央)維氏氣單胞菌的分離鑒定與藥敏試驗[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012,39(2):92-95.

[9] 周光.團頭魴池塘維氏氣單胞菌的致病性、耐藥性、基因分型及其分布研究[D].上海：上海海洋大學，2012.

[10] 朱成科，向楨，葉華，等.黃顙魚致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定[J].西南大學學報(自然科學版)，2013,35(5):37-41.

[11] Yanez M A，Catalan V，Apraiz D,etal.Phylogenetic analysis of members of the genusAeromonasbased ongyrBgene sequences[J].Int J Syst EvolMicrobiol，2003,53:875-883.

[12] 譚蘋.應(yīng)用Excel軟件計算半數(shù)致死量[J].山西醫(yī)科大學學報，2010，41(10):914-916.

[13] 張碧波，張立懷，秦貞奎，等.運動性氣單胞菌分離和鑒定方法的研究[J].天津輕工業(yè)學院學報，2000，4:40-44.

[14] Nicky B.Buller,徐高蓉，常亞青，等.魚類及其他水生動物細菌實用鑒定指南[M].北京:海軍出版社，2013.

[15] Altwegg M,Steigerwalt A.G,Altwegg bissig,etal.Biochemical identification ofAeromonasgenospecies isolated from humans[J].Journal of Clinical Microbiology，1990,28:258-264.

[16] Carnahan A.Chakraborty T.Fanning G,atal.Aeromonastrotasp.nov.an ampicillinsusceptible species isolatedfromclinical specimens[J].Journal of Clinical Microbiology，1991,29:1206-1210.

[17] Kaznowski A.Identification ofAeromonasstrains of different origin to the genomic species level[J].Journal of Applied Microbiology，1998,84：423-430.

[18] Kuijper E J,Steigerwalt A G,Schoenmakers B S C I M,etal.Phenotypiccharacterization and DNA relatedness in human fecal isolates of Aeromonas spp[J].Journal of Clinical Microbiology，1989,27:132-138.

[19] 黎炯，葉星，盧邁新，等.羅非魚維氏氣單胞菌的分離鑒定和藥敏試驗[J].水生態(tài)學雜志，2011，32(3):132-136.

[20] 凌紅麗，陸承平,陳懷青,等.嗜水氣單胞菌選擇培養(yǎng)基鑒別效果的比較[J].中國獸藥雜志，1998，32(4):6-9.

[21] Mara kupfer,Peter Kuhnert,Bozena M.Genetic relationships ofAeromonasstrainsidferred from 16S-rRNA gyrB and rpoB gene sequences[J].Interational journal of systematic and evolutionary microbiology,2006,56:2743-2751.

2016-04-13

國家自然科學基金(30972191)；吉林省留學人員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(201523)；長春市農(nóng)業(yè)先進實用技術(shù)的示范推廣項目(20130215)

冷東澤(1988- )，男，碩士生，研究方向為動物疾病與免疫，E-mail：174542602@qq.com

李月紅，E-mail：liyhong@sina.com

S855.1+2

B

0529-6005(2017)03-0091-05