吳 雪，周 游，李佳麗，劉 蕊，趙 瑛

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠新物體識別能力的動態(tài)監(jiān)測

吳 雪，周 游，李佳麗，劉 蕊，趙 瑛

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

研究鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病(DM)大鼠模型在造模80 d內(nèi)，新物體識別能力的動態(tài)變化.60 mg/kg腹腔注射STZ，72 h后檢測空腹血糖≥16.7 mmol/L為模型復(fù)制成功，記錄DM模型的成模率；模型制備第40、55、70天采用大鼠行為儀以接觸次數(shù)、相對識別指數(shù)為指標(biāo)，檢測大鼠新物體識別行為的變化并記錄空腹血糖變化及整個實(shí)驗(yàn)期間的死亡率.結(jié)果表明, 造模72 h后DM的成模率為90%，整個實(shí)驗(yàn)期間的死亡率為21.7%；模型組的空腹血糖在造模第3、30、60、80天顯著高于對照組(P<0.01)；模型組大鼠在造模第40d對新物體的相對識別指數(shù)與對照組無顯著性差異(P>0.05)，在造模第55、70天顯著低于對照組(P<0.05)，模型組大鼠在造模第40、55、70天對新物體的探究次數(shù)均顯著低于對照組(P<0.05). 以60 mg/kg的劑量腹腔注射STZ造模的DM大鼠在造模第55天開始出現(xiàn)新物體識別障礙，持續(xù)至70 d.

糖尿病；認(rèn)知損害；新物體識別

DM致認(rèn)知損害的發(fā)病過程隱秘，進(jìn)一步發(fā)展就會形成癡呆，因此DM所致的認(rèn)知功能障礙引起越來越多人的關(guān)注[1]，在癡呆發(fā)生之前認(rèn)知損害常常是被忽略的，如果在認(rèn)知障礙的初級階段加以干預(yù)，可以有效延緩癡呆的發(fā)生.由于目前多采用Morris水迷宮檢測學(xué)習(xí)記憶能力，但其記憶保持時間長的特殊性，不能對動物學(xué)習(xí)記憶行為進(jìn)行連續(xù)的動態(tài)監(jiān)測，因此我們嘗試選用新物體識別方法動態(tài)觀察認(rèn)知損害的發(fā)病過程 .新物體識別方法是在自然狀態(tài)下測量動物非空間工作記憶的行為模型[2].目前通過新物體識別方法研究DM致認(rèn)知損害的發(fā)病過程未見報道[3-4].因此本實(shí)驗(yàn)通過60 mg/kg腹腔注射STZ復(fù)制DM大鼠模型，采用新物體識別方法動態(tài)監(jiān)測DM致認(rèn)知損害的發(fā)病過程.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)條件

雄性Wistar大鼠46只，8～11周齡，體重(250±20)g由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，合格證號201600013063.實(shí)驗(yàn)動物采用獨(dú)立通氣籠飼養(yǎng)，溫度(20～22) ℃，濕度45%～55%，換氣次數(shù)34次/h，每籠4只，實(shí)驗(yàn)動物采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間可自由攝食、飲水.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

STZ(北京博愛科貿(mào)有限公司，Sidma-S0130)，葡萄糖測定試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，20141105147)，血糖儀(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，悅準(zhǔn)血糖儀11型)，獨(dú)立通氣籠(S8蘇州市蘇杭科技器材有限公司)，精密pH計(jì)(上海虹益儀器儀表有限公司，PHS0-3C)，分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司，F(xiàn)A1004)，酶標(biāo)分析儀(RAYTO公司，RT-6000)，新物體識別裝置箱(64cm*43cm*30cm)，三套新物體(每套分別含兩種物體，自制)，計(jì)時器.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 STZ溶液配制

檸檬酸(A)：2.10 g檸檬酸溶于100 mL蒸餾水；檸檬酸鈉(B)：2.94 g檸檬酸鈉溶于100 mL蒸餾水；A液、B液按1∶1.32比例混合，測定pH值，調(diào)節(jié)pH值為4.2～4.5，微孔濾膜(Φ=0.22 μm)過濾除菌，置于4 ℃冰箱備用.STZ粉末以上述緩沖溶液配成1%的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光冰浴，溶解后立即注射，在10 min內(nèi)注射完畢.

2.2 動物分組及模型復(fù)制

動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為對照組(n=16)，模型組(n=30).實(shí)驗(yàn)動物禁食不禁水12 h，模型組以“2.1”項(xiàng)下配制的STZ按60 mg/kg的劑量腹腔注射，對照組注射同等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，注射2 h后給食.以72 h后空腹血糖≥16.7 mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)[5-6]，達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)的動物納入實(shí)驗(yàn).

2.3 血糖測定

取造模72 h時的空腹血，3 500 r/min離心10 min取上清，采用葡萄糖氧化酶法進(jìn)行血糖測定，空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L為造模成功.且分別在造模后的第30、60、80天用血糖儀對大鼠進(jìn)行空腹血糖測定，超出血糖儀檢測限的記為33.3 mmol/L.

2.4 新物體識別能力檢測

2.4.1 大鼠新物體興趣測試

將3套(每套均含1號物體和2號物體)新物體同時置于箱內(nèi)，用秒表記錄大鼠對幾個不同物體的探究次數(shù)及探究時間，結(jié)果顯示同一只鼠對三套物體的探究次數(shù)及探究時間無顯著性差異(P>0.05).因此在正式試驗(yàn)中選用這三套物體進(jìn)行新物體識別能力測試.

2.4.2 新物體識別方法

新物體識別實(shí)驗(yàn)過程分為3個階段：適應(yīng)期、熟悉期和測試期[7].適應(yīng)期為2 d，每天上下午分別將動物依次放入沒有任何物體的實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境5 min.第3天，熟悉期實(shí)驗(yàn)，將兩個完全相同的物體放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)對稱的位置處，兩物體距離側(cè)箱壁、箱后壁的距離均為10 cm.讓大鼠在試驗(yàn)箱內(nèi)自由探索5 min[8].24 h之后進(jìn)行測試期實(shí)驗(yàn)，將其中一個熟悉期使用的物體換為另一個大小相近但形狀和顏色不同的新物體，分別記錄動物對新物體探究的平均速度、路程、探究次數(shù)及對兩個不同物體的探究時間.用相對識別指數(shù)(relative discrimination index)來評價動物的學(xué)習(xí)記憶能力[9].相對識別指數(shù)的計(jì)算為N/(N+F)×100%，其中N(new)為新物體探索時間，F(xiàn)(familiar)為熟悉物體探索時間.在每次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時，需清理上次實(shí)驗(yàn)時大鼠在活動箱內(nèi)的排泄物，并用酒精擦拭活動箱，以消除對下只鼠實(shí)驗(yàn)的影響[10].

2.5 代謝情況考察

代謝籠中放入定量的食、水，動物放入代謝籠中自由攝食、飲水，12 h后計(jì)算大鼠的食量、水量、尿量及體重.分別在模型成立后第6、30、60、80天對以上指標(biāo)進(jìn)行檢測[11].

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用SPSS 17.0 For Windows統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)分布采用方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)資料處理，作方差齊性檢驗(yàn)，P>0.05為方差齊性，P<0.05為方差不齊.方差齊性時，組間比較采用LSD檢驗(yàn).方差不齊時，采用多重比較Tamhane檢驗(yàn).結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示.P<0.05為有顯著性差異；P<0.01為有非常顯著性差異.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 成模率、死亡率及代謝情況

本次實(shí)驗(yàn)以造模72 h空腹血糖≥16.7 mmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)，有27只大鼠成模，成模率為90%，80 d時兩組大鼠共死亡10只(對照組死亡2只，模型組死亡8只)，死亡率為21.7%，且模型組大鼠在成模第3、30、60、80天，空腹血糖與對照組均有非常顯著差異(P<0.01).模型組的食量與體重，在造模第6天與對照組無顯著性差異(P>0.05)，在造模第30、60、80天均與對照組有顯著性差異(P<0.05)，模型組的水量與尿量在造模第6、30、60、80天顯著高于對照組(P<0.05)見表1,2.

表1 空腹血糖變化(FBG/(mmol·L-1))

注：與對照組相比，**P<0.01說明有非常顯著性差異

表2 大鼠食量、水量、尿量、體重變化

注：與對照組相比，*P<0.05說明有顯著性差異，**P<0.01說明有非常顯著差異

3.2 新物體識別能力

與對照組相比，模型組大鼠對新物體探究路程與平均速度在造模第40、55、70天無顯著性差異(P>0.05)，故可排除運(yùn)動能力的影響，對新物體的探究次數(shù)在造模第40、55、70天顯著降低(P<0.01)，相對辨別指數(shù)在造模第40天無顯著性差異(P>0.05)，在造模第55、70天顯著降低(P<0.05).見表3.

表3 測試期兩組大鼠對新物體的探究次數(shù)與相對辨別指數(shù)

注：與對照組相比，*P<0.05說明有顯著性差異，**P<0.01說明有非常顯著性差異

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)前期根據(jù)動物體重范圍，通過腹腔注射STZ以55、60、65 mg/kg的劑量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明60 mg/kg的劑量成模率高，故正式實(shí)驗(yàn)以60 mg/kg劑量一次性腹腔注射復(fù)制DM模型.空腹血糖顯示，全部造模動物一直維持高血糖狀態(tài)，且模型組大鼠一直維持“三多一少”癥狀，可以看出本實(shí)驗(yàn)所建立的DM模型在80 d內(nèi)穩(wěn)定.

新物體識別實(shí)驗(yàn)在近些年應(yīng)用廣泛，在國內(nèi)外的研究日趨增多.它主要用于嚙齒類動物非空間及短期對物體的辨別記憶能力的檢測.整個實(shí)驗(yàn)過程分為：適應(yīng)期，熟悉期及測試期，由于熟悉期與測試期之間的間隔時間文獻(xiàn)中不盡相同，大多以間隔2h和24h居多，因此本實(shí)驗(yàn)前期通過設(shè)置間隔2h和24h分別進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明間隔24h時，模型組與對照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異性更加明顯，故正式實(shí)驗(yàn)采用熟悉期與測試期間隔24h.

綜上所述，以60mg/kg腹腔注射STZ造模的DM大鼠在造模第40d，模型組大鼠的相對辨別指數(shù)與對照組無顯著性差異，而在第55、70天顯著減少，說明DM大鼠在造模第55天開始出現(xiàn)新物體識別障礙，并持續(xù)至70d.本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，為DM認(rèn)知損害的早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)防及藥物干預(yù)的研究提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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Dynamic monitoring of new object recognition ability of STZ induced diabetic rats

WU Xue, ZHOU You, LI Jia-li, LIU Rui, ZHAO Ying

(School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

To study the dynamic change of new object recognition ability of streptozotocin(STZ)-induced diabetic rat model in 80 days. Normal rats were treated with intraperitoneal injection of STZ of 60 mg/kg to establish model. On the 3rd day, fasting plasma glucose levels was detected, when the value was over 16.7 mmol/L the modeling was successful. The success rate of MD model was recorded. Preparation model 40 d, 55 d, 70 d with large mouse behavior to contact the instrument number, relative identification index as an indicator to detect changes in rat new object recognition behavior, in addition, record the mortality rate and fasting glucose during the experiment. The mold forming rate was 90% in third days, the mortality rate during the experiment was 21.7%; The model group of fasting blood glucose in third days, 30 days, 60 days, 80 days were significantly higher than control group (P<0.01)；control group and model group there was no significant difference in 40 days of relative recognition index(P>0.05), the model group, in 55 days，70 days was significantly lower than control group (P<0.05)；the model group, in 40 days，55 days，and 70 days of the new object exploring times were significantly lower than control group (P<0.05). The diabetic rat model established by intraperitoneal injection with the dose of 60 mg/kg in 55 days began to appear new object recognition obstacle, and continued to 70 days.

diabetes mellitus; cognitive impairment; new object recognition

2016-11-17.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373548)

吳 雪(1990-)，女，碩士，研究方向：中藥防治重大疾病

趙 瑛(1960-)，女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥防治重大疾病

R285

A

1672-0946(2017)02-0135-03