俞靜波，徐 艷，吳 暉，蘇為科(.浙江工業(yè)大學(xué) 綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 3004；.杭州中美華東制藥有限公司，浙江 杭州 300)

響應(yīng)面法優(yōu)化機(jī)械輔助提取放線菌肽聚糖

俞靜波1，徐 艷1，吳 暉2，蘇為科1
(1.浙江工業(yè)大學(xué) 綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310014；2.杭州中美華東制藥有限公司，浙江 杭州 310011)

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法對機(jī)械球磨輔助提取放線菌發(fā)酵菌泥肽聚糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化.實驗結(jié)果表明：在NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%、球料比為15、轉(zhuǎn)速為300 r/min的條件下作用5 min能夠有效去除細(xì)胞壁表層磷壁酸，并維持其骨架相對完整.與傳統(tǒng)方法相比，機(jī)械研磨具有時間短、效率高和經(jīng)濟(jì)環(huán)保的特點(diǎn).混合物經(jīng)過十二烷基磺酸鈉(SDS)沸水浴30 min和37 ℃胰蛋白酶處理6 h后得到類白色提取物.經(jīng)溶菌酶酶解實驗和紅外光譜分析，初步證明該提取物主要成分為肽聚糖.

肽聚糖；球磨；磷壁酸

游動放線菌Actinoplanessp. SE50/110是革蘭氏陽性菌，是放線菌中的重要成員，其次級代謝產(chǎn)物阿卡波糖具有很好的降血糖作用[1].肽聚糖為G+菌細(xì)胞壁的主要成分，多達(dá)30～40層[2].研究表明肽聚糖具有多種生物學(xué)活性如抗免疫活性、抗腫瘤及其他活性[3]，在調(diào)節(jié)宿主免疫功能方面發(fā)揮著重要作用.提取菌體細(xì)胞壁肽聚糖方法主要包括機(jī)械破碎、化學(xué)和生物化學(xué)滲透及物理滲透[4]等方法.傳統(tǒng)化學(xué)法常采用三氯乙酸高溫處理，破壁效果較好，肽聚糖完整性高，但處理時間長、試劑用量多，且會產(chǎn)生大量廢酸.生物化學(xué)法利用生物酶破壞細(xì)胞壁成分，處理成本相對較高，且效率較低[5].因此，尋找一種高效、低成本，且環(huán)境友好的細(xì)菌肽聚糖提取方法，不但能夠合理獲得生物肽聚糖產(chǎn)品，還能降低相關(guān)醫(yī)藥生產(chǎn)企業(yè)廢棄菌泥處理壓力，實現(xiàn)高值化利用.

機(jī)械球磨具有強(qiáng)烈震動空化效應(yīng)以及高速攪拌的作用[6]，通過菌體與試劑間的迅速研磨反應(yīng)，有望達(dá)到破壞細(xì)胞壁表層磷壁酸，增加細(xì)胞通透性的目的，從而獲取肽聚糖骨架.采用機(jī)械球磨法輔助提取游離放線菌細(xì)胞壁肽聚糖，對比化學(xué)法確定最佳提取工藝，具有操作簡單、效率高、周期短和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供新思路.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

游動放線菌Actinoplanessp. SE50/110發(fā)酵菌泥，由杭州中美華東制藥有限公司提供，胰蛋白酶(Sigma公司)，溶菌酶(Sigma公司)，NaOH、KOH、苯酚、硫酸、三氯乙酸、N-乙酰氨基葡萄糖、對二甲氨基苯甲醛及十二烷基硫酸鈉(SDS)等均為國產(chǎn)分析純試劑.

行星式球磨儀(Restch，PM 200)，低溫高速離心機(jī)(Sigma，3-18KS)，紫外分光光度計(SHIMADZU，UV1800)，恒溫水浴搖床(Julabo，SW22).

1.2 實驗方法

1.2.1 放線菌肽聚糖(PG)的提取

菌泥用蒸餾水洗滌至發(fā)白，除磷壁酸后收集沉淀，蒸餾水清洗3次.加入8 g/L的SDS沸水浴30 min，離心洗滌沉淀.37 ℃下，加入2 mg/mL胰蛋白酶溶液，于140 r/min下保溫6 h.沉淀為PG提取物，用蒸餾水沖洗并于-20 ℃下冷凍保存.

1.2.2 三氯乙酸(TCA)法除去磷壁酸

參照丁喜順等TCA法[7].不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的TCA溶液(CTCA)按料液比(質(zhì)量比)10︰1溶解菌泥(mTCA/m菌泥=CTCA×10)，搖勻后分為3組(20，50，70 ℃)；分別在1，2，3，4，6，8 h取樣.每個取樣點(diǎn)取樣1.5 mL，放入10 mL離心管中，立即離心(8 000 g，20 min，4 ℃)，將上清液放入另一離心管中保存，用于微量磷的測定；沉淀收集物保存用于后續(xù)實驗.

1.2.3 機(jī)械球磨法除去磷壁酸

菌泥與不同質(zhì)量比(m堿/m菌泥)的堿性試劑置于行星式球磨儀中，在一定轉(zhuǎn)速下反應(yīng)一定時間后，取菌泥用水溶解，立即離心(8 000 g，20 min，4 ℃)，上清液用于微量磷的測定[8].

1.2.4 上清液中P質(zhì)量濃度測定

采用磷鉬酸法測P質(zhì)量濃度[9].

1.2.5 N-乙酰氨基葡糖胺(NAG)檢測

采用對二甲氨基苯甲醛(PDABA)法檢測NGAP[10].肽聚糖是由NAG和N-乙酰胞壁酸(NAM)交替連接的雜多糖與不同組成的肽交叉連接形成的大分子.當(dāng)肽聚糖結(jié)構(gòu)被破壞時，釋放出的NAG.上清液中測得的NAG含量越少，說明細(xì)菌細(xì)胞壁骨架-肽聚糖結(jié)構(gòu)越完整[11].

1.3 放線菌肽聚糖成分分析

1.3.1 溶菌酶溶解實驗

稱取一定質(zhì)量的1.2.1處理后的PG提取物，加入0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH=6.2)中，配制成1 mg/mL的溶液，加入適量蛋清溶菌酶，質(zhì)量濃度為200 μg/mL.樣品于37 ℃，120 r/min恒溫?fù)u床振蕩處理24 h，于450 nm下檢測吸光值隨時間變化的情況[11].

1.3.2 紅外光譜分析

取適量肽聚糖提取物用KBr壓片，傅利葉變換紅外光譜分析儀進(jìn)行紅外光譜分析[12]，掃描范圍4 000～800 cm-1.

2 結(jié)果與討論

2.1 TCA法除磷壁酸實驗考察

2.1.1 TCA用量對磷壁酸去除效果考察

分別選擇5%，10%，15%的TCA溶液，與菌泥以10∶1混勻，70 ℃下水浴2 h，上清液進(jìn)行P質(zhì)量濃度測定.

由圖1(a)可知：TCA質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，上清液中P質(zhì)量濃度越高，10%與15%的TCA溶液相比，測得P質(zhì)量濃度相差較小，故選擇10%的TCA質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mTCA/m菌泥=1)進(jìn)行溫度和時間的考察.

2.1.2 TCA作用不同溫度、時間對磷壁酸去除效果考察

10%的TCA溶液與菌泥以10∶1混勻后，分別在20，50，70 ℃下作用1，2，3，4，6，8 h，觀察其P質(zhì)量濃度的變化.

由圖1(b)所示，在不同溫度下隨著作用時間的增加所釋放的P質(zhì)量濃度均隨之增加，70 ℃下作用4 h后進(jìn)入平臺期，P質(zhì)量濃度達(dá)到405.24 mg/L；50 ℃下同樣作用4 h后進(jìn)入平臺期，但P質(zhì)量濃度較70 ℃低，P質(zhì)量濃度達(dá)到356.42 mg/L；20 ℃下進(jìn)入平臺期時間相對較早，僅需2 h，但釋放的P質(zhì)量濃度遠(yuǎn)低于其他溫度，只有265.58 mg/L.因此，優(yōu)選的TCA作用溫度為70 ℃，作用時間為4 h.在此條件下測得NAG的質(zhì)量濃度為125.91 mg/L.

圖1 TCA不同用量及作用時間、溫度對磷壁酸去除效果考察Fig.1 Influence of the amount of TCA, time and temperature on the removal of Teichoic acid

2.2 機(jī)械球磨輔助提取單因素實驗結(jié)果

2.2.1 堿類別對磷壁酸去除及肽聚糖的破壞作用考察

取4 g菌泥分別與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，3%，6%的NaOH、KOH固體混合均勻，在球料比為15，250 r/min條件下，球磨15 min.球磨混合物用等體積水溶解后取樣1.5 mL，放入10 mL離心管中，立即離心(8 000 g，20 min，4 ℃)，將上清液放入另一離心管中保存，用于微量磷、NAG的測定.結(jié)果如圖2(a)所示，三種固料比下，NaOH作用效果均優(yōu)于KOH，兩者對肽聚糖完整性破壞效果相差不大(圖2b)，故選擇NaOH作為反應(yīng)試劑.

圖2 機(jī)械球磨時堿類別對磷壁酸去除及肽聚糖破壞作用考察Fig.2 Influence of base type on the removal of Teichoic acid and PG breaking

2.2.2 堿用量對磷壁酸去除及肽聚糖破壞作用考察

取4 g菌泥分別與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，3%，6%，9%，12%，15%的NaOH固體混合均勻，在球料比為15，250 r/min條件下，球磨15 min.球磨混合物用等體積水溶解后取樣1.5 mL，放入10 mL離心管中，立即離心(8 000 g，20 min，4 ℃)，將上清液放入另一離心管中保存，用于微量磷、NAG的測定.結(jié)果如圖3(a)所示，隨著NaOH用量增加，P質(zhì)量濃度也相應(yīng)提高，堿用量超過9%時P釋放趨于平緩，而NAG的釋放則隨堿用量的增加呈上升趨勢.

圖3 機(jī)械球磨時堿用量及球磨時間對磷壁酸去除及肽聚糖破壞作用考察Fig.3 Influence of amount of NaOH on the removal of Teichoic acid and PG breaking

2.2.3 球磨時間對磷壁酸去除及肽聚糖破壞作用考察

取4 g菌泥與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%的NaOH固體混合均勻，在球料比15，及250 r/min轉(zhuǎn)速下，分別球磨5，10，15，20，25 min.球磨混合物用等體積水溶解后取樣1.5 mL，放入10 mL離心管中，立即離心(8 000 g，20 min，4 ℃)，將上清液放入另一離心管中保存，用于微量磷、NAG的測定.結(jié)果如圖3(b)所示，球磨時間對P質(zhì)量濃度的影響不大，總體呈平緩趨勢；對于NAG含量影響較明顯，時間越長，NAG釋放量增多.因此選擇球磨時間為5 min.

2.2.4 球磨轉(zhuǎn)速對磷壁酸去除及肽聚糖的破壞作用考察

取4 g菌泥與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%的NaOH固體混合均勻，在球料比為15，轉(zhuǎn)速為100，150，200，250，300 r/min下分別球磨5 min.球磨混合物用等體積水溶解后取樣1.5 mL，放入10 mL離心管中，立即離心(8 000 g，20 min，4 ℃)，將上清液放入另一離心管中保存，用于微量磷、NAG的測定.結(jié)果如圖4(a)可知：P和NAG質(zhì)量濃度均隨轉(zhuǎn)速的提升而增加.當(dāng)轉(zhuǎn)速大于250 r/min時，P質(zhì)量濃度上升趨于平緩，但NAG質(zhì)量濃度顯著增加.

圖4 機(jī)械球磨時轉(zhuǎn)速及球料比對磷壁酸去除及肽聚糖破壞作用考察Fig.4 Influence of rotating speed on the removal of Teichoic acid and PG breaking

2.2.5 球料比對磷壁酸去除及肽聚糖破壞作用考察

取4 g菌泥與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%的NaOH固體混合均勻，在球料比為9，12，15，18，21，轉(zhuǎn)速為250 r/min下分別球磨5 min.球磨混合物用等體積水溶解后取樣1.5 mL，放入10 mL離心管中，立即離心(8 000 g，20 min，4 ℃)，將上清液放入另一離心管中保存，用于微量磷、NAG的測定.結(jié)果如圖4(b)所示，P及NAG質(zhì)量濃度均隨著球料比的提升而增加，在18時達(dá)到峰值，繼續(xù)提升球料比則兩者均明顯下降.

2.3 響應(yīng)面結(jié)果和分析

2.3.1 建立與分析回歸模型

根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，再結(jié)合單因素實驗結(jié)果，選擇加堿量、球磨轉(zhuǎn)速和球料比進(jìn)行三因素三水平中心組合實驗(表1)，P質(zhì)量濃度及NAG釋放量為響應(yīng)值，利用Design-expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析[13]，確定機(jī)械球磨法去除菌渣磷壁酸獲取肽聚糖的最佳工藝參數(shù)，實驗結(jié)果見表2.

表1 響應(yīng)面三因素三水平實驗設(shè)計

Table 1 The experimental design of 3 factor and 3 level of response surface method

水平因素A球磨轉(zhuǎn)速X1/(r·min-1)因素B加堿量X2/%因素C球料比/(g·g-1)-1200615025091813001221

對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得P質(zhì)量濃度Y1，NAG質(zhì)量濃度Y2對于因素A，B，C的回歸方程如下：

Y1=772.25+71.00X1+34.83X2+5.77X3- 43.17X1X2-10.20X1X3-3.57X2X3- 82.25X1X1-59.51X2X2-31.94X3X3

(1)

Y2=3.81+0.36X1+0.19X2+0.36X3+ 0.27X1X2+0.19X1X3-0.020X2X3- 0.24X1X1-0.41X2X2+0.053X3X3

(2)

利用F檢驗和P值對該模型的方差分析見表3.由表3中各模型的P值可知：式(1)中一次項轉(zhuǎn)速為極顯著因素，加堿量為顯著因素，球料比為不顯著因素；式(1)中大部分二次項是顯著因素，表明P質(zhì)量濃度對各影響因素不是簡單的線性關(guān)系[14-15].式(2)中一次項轉(zhuǎn)速和球料比是極顯著因素，二次項中大部分都不是顯著因素.F值檢驗表明：該模型為極顯著(P<0.001).表明可以用該數(shù)學(xué)模型對機(jī)械球磨去除磷壁酸實驗結(jié)果及最優(yōu)條件進(jìn)行分析預(yù)測.

表2 響應(yīng)面分析實驗及結(jié)果1)Table 2 Program and experimental results of RSA

注：1) 表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗的平均值.

表3 回歸方程各項的方差分析表1)Table 3 Variance analysis of regression equation

注：1)*表示顯著；**表示極顯著.

2.3.2 磷壁酸去除工藝響應(yīng)面分析與優(yōu)化

圖5為P質(zhì)量濃度響應(yīng)面曲面圖，圖6為NAG質(zhì)量濃度響應(yīng)面曲面圖.曲面越陡，其影響更顯著.從圖5(a～c)可看出：對P質(zhì)量濃度影響程度由高到低依次為轉(zhuǎn)速、堿量及球料比；從圖6(a～c)可看出：對NAG質(zhì)量濃度影響程度由高到低依次為轉(zhuǎn)速、球料比及加堿量[16].從立體圖看：存在極值的條件應(yīng)該在圓心處.為了進(jìn)一步確定最佳值，根據(jù)對響應(yīng)面圖的分析及Design-Expert軟件的優(yōu)化分析，選擇P質(zhì)量濃度最大化、NAG質(zhì)量濃度最小化，得到最佳提取條件：轉(zhuǎn)速300 r/min，加堿量6%，球料比15.707.在該條件下P質(zhì)量濃度理論值為432.39 mg/L，NAG質(zhì)量濃度為118.96 mg/L.考慮到實際操作將最佳工藝參數(shù)修改為：轉(zhuǎn)速為300 r/min，加堿量為6%，球料比為15.以上述條件進(jìn)行磷壁酸去除試驗驗證，取三次平行試驗，實際P質(zhì)量濃度為433.72 mg/L，NAG釋放量為120.07 mg/L，實驗結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能夠較好的模擬和預(yù)測磷壁酸的去除量.

圖5 各因素對磷壁酸去除效果的交互影響曲面圖Fig.5 Responsive surfaces of interactive effects on removal of Teichoic acid

圖6 各因素對肽聚糖破壞效果的交互影響曲面圖Fig.6 Responsive surfaces of interactive effects on PG breaking

2.4 傳統(tǒng)法與球磨法比較

傳統(tǒng)法與球磨法比較如表4所示.

表4 傳統(tǒng)法與機(jī)械球磨法對放線菌磷璧酸去除及肽聚糖破壞作用的比較

Table 4 Comparison between conventional methordandmechanochemical extraction on the removal of Teichoic acid and PG breaking

項目傳統(tǒng)法機(jī)械球磨法反應(yīng)劑用量與菌料質(zhì)量比/(g·g-1)1∶10.06∶1.00反應(yīng)時間/min2405反應(yīng)溫度/℃7025上清液P質(zhì)量濃度/(mg·L-1)405.24433.72上清液NAG質(zhì)量濃度/(mg·L-1)125.91120.07

2.5 放線菌肽聚糖的鑒定

2.5.1 溶菌酶溶解實驗

溶菌酶是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，它能專一切斷肽聚糖中NAG和NAM之間β-1,4糖苷鍵，通過破壞肽聚糖骨架使肽聚糖溶解.溶菌酶酶解實驗常用于肽聚糖的定性鑒定，如圖7所示.

圖7 溶菌酶處理對肽聚糖提取物溶解性的影響Fig.7 Influence of lysozyme on the solubility of PG extracts

由圖7可以看出：隨著溶菌酶酶解時間的增加，溶液吸光值逐漸降低，在消化過程中的最初10 h內(nèi)吸光值呈現(xiàn)下降趨勢，隨后平穩(wěn)，而未加溶菌酶的對照組吸光值一直呈平穩(wěn)趨勢，說明提取物可以被溶菌酶消化降解，證明提取物主要成分為肽聚糖.

2.5.2 紅外光譜圖

肽聚糖提取物的紅外光譜(圖8)與文獻(xiàn)[12]報道符合.放線菌肽聚糖提取物在1 200～1 000 cm-1的兩個峰為吡喃糖環(huán)C—O—C的伸縮振動峰和O—H的變角振動峰.1 539.46 cm-1處為N—H的變角振動峰.1 652.16 cm-1處為CH3CONH-的特征吸收峰.此外，3 500～3 200，3 000～2 800，1 400～1 200 cm-1這幾處均含有糖類物質(zhì)的特征吸收峰.

圖8 肽聚糖提取物紅外光譜分析Fig.8 FTTR analysis of peptidoglycan

3 結(jié) 論

采用的機(jī)械球磨輔助提取游離放線菌發(fā)酵菌泥肽聚糖方法與傳統(tǒng)三氯乙酸法相比，僅用少量的無機(jī)堿替代具有刺激性的有機(jī)酸(TCA，mTCA/m菌泥=1)，實現(xiàn)磷壁酸的高效去除，大大降低成本，縮短處理時間，減少廢酸排放.通過響應(yīng)面優(yōu)化研究，得到肽聚糖提取的最優(yōu)工藝參數(shù)：加堿量(m堿/m菌泥=0.06)，球料比為15，轉(zhuǎn)速為300 r/min；在此條件下反應(yīng)5 min，磷壁酸去除率(以P質(zhì)量濃度計)為433.72 mg/L，細(xì)胞壁骨架破壞率(以NAG質(zhì)量濃度計)為120.07 mg/L.溶菌酶酶解實驗和紅外光譜分析初步確認(rèn)提取物的主要成分為肽聚糖.

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(責(zé)任編輯：陳石平)

Study on optimizing mechanochemical extraction of peptidoglycan fromActinoplanessp.by RSM

YU Jingbo1, XU Yan1, WU Hui2, SU Weike1
(1.Collaborative Innovation Center of Green Pharmaceuticals, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 2.Hangzhou ZhongmeiHuadong Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou 310011, China)

Based on the single factor tests, the response surface methodology(RSM) was used for optimizing mechanochemical extraction processing of peptidoglycan fromActinoplanessp. SE50/110. The results showed that the optimum millingcondition was as follows: NaOH(6%), ball to power weight ratio(15), rotating speed(300 r/min). After treated for 5 minutes under the above condition, most of the lipoteichoic acid was removed to release large amount of P with relatively intact cell wall skeleton.Compared to conventional method, the mechanochemical extraction wasmore efficient,economic and environmentally friendly.After the boiling bath with 8 g/dL SDS for 30 min, the residues were incubated in PBS(50 mmol/L, pH 6.8)containing 2 000 U trypsin at 37 ℃ for 6 h to afford off-white solid. The main content of the extract was preliminary confirmed to be peptidoglycan by lysozyme hydrolysis and FTTR analysis.

peptidoglycan; ball milling; Teichoic acid

2016-06-15

國家自然科學(xué)基金資助項目(21406201)；2015浙江省博士后科研項目擇優(yōu)資助(BSH1502012)

俞靜波(1985—)，女，浙江杭州人，講師，研究方向為藥物綠色制備技術(shù)及機(jī)械化學(xué)反應(yīng)技術(shù)，E-mail：yjb@zjut.edu.cn.

TQ033

A

1006-4303(2017)02-0210-07