黃鑫 李帥坪 張勇 劉淑瑩

摘要 建立了超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法檢測(cè)大鼠海馬和大腦皮層中生物胺類及氨基酸類神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)含量的方法。選用Hypercarb（100mm×2.1mm，5μm）色譜柱，以0.1%甲酸甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫。電噴霧離子源（ESI）在正離子模式下，選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）掃描，對(duì)檢測(cè)的6種生物胺類和11種氨基酸類神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)分別選擇一個(gè)定性離子對(duì)和一個(gè)定量離子對(duì)。測(cè)定Wistar大鼠海馬和大腦皮層中6種生物胺類和11種氨基酸類神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的含量，對(duì)比兩種不同腦組織樣品前處理方法對(duì)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果的影響。17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在10min內(nèi)即可完成同時(shí)測(cè)定，檢測(cè)方法線性關(guān)系良好，日內(nèi)和日間精密度、加標(biāo)回收率和重復(fù)性滿足分析要求。本方法準(zhǔn)確、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，適用于腦組織中生物胺類及氨基酸類神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的含量測(cè)定，可為生物胺類及氨基酸類神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)提供有效的樣品前處理方法和檢測(cè)手段。

關(guān)鍵詞超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法；生物胺類神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)；氨基酸類神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)；腦組織

1引言

神經(jīng)遞質(zhì)（Neurotransmitter）在神經(jīng)化學(xué)傳遞中是充當(dāng)“信使”的特定化學(xué)物質(zhì)。腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)分為4類，即生物胺類、氨基酸類、肽類和其它類。隨著神經(jīng)生物學(xué)的發(fā)展，陸續(xù)在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了大量具有神經(jīng)活性的物質(zhì)。生物胺類遞質(zhì)是最先發(fā)現(xiàn)的一類神經(jīng)遞質(zhì)，包括多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）、腎上腺素（E）、5羥色胺（5HT）。酪氨酸（Tyr）是DA、NE和E的前體，色氨酸（Try）是5HT的前體，在多種應(yīng)激情況下，維持正常的生物胺類遞質(zhì)代謝和腦功能的發(fā)揮。5羥吲哚乙酸（5HIAA）是5HT代謝的產(chǎn)物，5HIAA的變化也可間接反應(yīng)5HT的變化。褪黑激素（Melatonin）主要是由哺乳動(dòng)物和人類的松果體產(chǎn)生的一種胺類激素，5HT在N乙?；D(zhuǎn)移酶的作用下，轉(zhuǎn)化成N乙?；?羥色胺，最后合成Melatonin。生物胺類神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在人體和哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)、心血管和內(nèi)分泌等組織系統(tǒng)中發(fā)揮著廣泛的調(diào)節(jié)作用，參與情緒、情感、應(yīng)激行為和睡眠覺醒等多種生理過程[1＼]，含量的變化與人類多種疾病密切相關(guān)，是診斷阿爾茨海默癥、唐氏綜合征、抑郁癥和帕金森等疾病的重要依據(jù)[2～5＼]。組胺（Histamine）是一種活性胺化合物，作為身體內(nèi)的一種化學(xué)傳導(dǎo)物質(zhì)，可以影響許多細(xì)胞的反應(yīng)，中樞組胺能神經(jīng)系統(tǒng)影響腦部神經(jīng)傳導(dǎo)，參與睡眠、荷爾蒙的分泌、體溫調(diào)節(jié)、食欲與記憶形成等功能[6＼]。乙酰膽堿（Ach）是中樞膽堿能系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，其主要功能是維持意識(shí)的清醒，在學(xué)習(xí)記憶中起重要作用。被確定為神經(jīng)遞質(zhì)的氨基酸有γ氨基丁酸（GABA）、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、?；撬幔═au）和絲氨酸（Ser）[7＼]。谷氨酰胺（Gln）作為大腦的一種能量來源，具有保護(hù)大腦的功能，能改善心情、增強(qiáng)智力，并有益于長期與短期記憶[8，9＼]。氨基酸類神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)對(duì)于調(diào)節(jié)機(jī)體生理活動(dòng)具有重要作用，其含量及比例的變化與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[2～5，10＼]。因此，生物樣品中生物胺類及氨基酸類神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)于某些疾病的篩查、診斷和治療以及藥物在體內(nèi)的作用具有重要意義。

神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在生物樣品中的含量很低，而生物樣品本身基體復(fù)雜，內(nèi)源性干擾物質(zhì)較多，因此高效快速的樣品前處理方法和高靈敏度的檢測(cè)手段是開展神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)研究的難點(diǎn)。采用高效液相色譜分離，再以紫外、熒光、電化學(xué)和質(zhì)譜方法檢測(cè)，是測(cè)定神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)較常用的方法[11～21＼]。由于氨基酸無紫外吸收，用液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)需對(duì)氨基酸進(jìn)行柱前或柱后衍生[16～20＼]。生物胺類神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)為強(qiáng)極性化合物，在反相色譜柱上保留極弱，對(duì)熒光和質(zhì)譜的響應(yīng)信號(hào)較弱，可通過衍生化處理改善色譜保留行為和離子化效率[16～19，21＼]。但衍生操作步驟繁瑣，耗時(shí)耗力，而且衍生程度也難以保證，JP衍生反應(yīng)還可能生成非目標(biāo)衍生物，這些對(duì)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的準(zhǔn)確測(cè)定都會(huì)產(chǎn)生影響。目前，HPLCMS/MS兼具分離能力強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，已逐漸發(fā)展成為復(fù)雜生物體系中痕量生物活性物質(zhì)分析的強(qiáng)有力手段[22～26＼]。

本研究采用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法建立了對(duì)大鼠海馬和大腦皮層中生物胺類及氨基酸類共17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)同時(shí)快速分析的方法。本方法的選擇性和重現(xiàn)性好，靈敏度高，并且無需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化和固相萃取等復(fù)雜的前處理，簡化了分析步驟，提高了分析效率。對(duì)比了兩種不同腦組織樣品前處理方法對(duì)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果的影響。本方法可應(yīng)用于腦組織中生物胺類及氨基酸類神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的分析測(cè)定，為臨床檢測(cè)提供了有效的樣品前處理方法和檢測(cè)手段。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

DionexUltimate3000超高效液相色譜儀TSQEndura三重四極桿質(zhì)譜儀，Hypercarb色譜柱（100mm×2.1mm，5μm）（ThermoScientific公司）；電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；BioGenPRO200型精密勻漿器（PROScientific公司）；EppendorfAG22331Hamburg離心機(jī)（GermanyEppendorf公司）。

多巴胺（DA）、腎上腺素（E）、去甲腎上腺素（NE）、5羥色胺（5HT）、5羥吲哚乙酸（5HIAA）、褪黑激素（Melatonin）、γ氨基丁酸（GABA）、酪氨酸（Tyr）、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）、天冬氨酸（Asp）、牛磺酸（Tau）、絲氨酸（Ser）、色氨酸（Try）、乙酰膽堿（ACh）、組胺（Histamine）對(duì)照品均購于Sigma公司；甲醇和甲酸（色譜純，F(xiàn)isher公司）；實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ超純水。

Wistar大鼠20只（雄性，體重180～200g），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1色譜條件流動(dòng)相A：0.1%甲酸；流動(dòng)相B：甲醇；流速：0.2mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：2μL；梯度洗脫：0～3min，0%B；3～10min，0%～100%B；10～12min，100%～0%B。10～12min流出物切換至廢液，不進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。

2.2.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），采用正離子模式，多反應(yīng)檢測(cè)（MRM），毛細(xì)管電壓為3.0kV，離子傳輸管溫度為300℃；霧化器溫度為300℃；鞘氣流速35arb；輔助氣流速5arb。質(zhì)譜采集參數(shù)如表1所示。

2.2.3對(duì)照品溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取DA，E，NE，5HT，5HIAA，Melatonin，GABA，Tyr，Gly，Glu，Gln，Asp，Tau，Ser，Try，ACh、Histamine對(duì)照品各5mg，以0.1%甲酸溶解，分別定容至5mL，配成濃度為1mg/mL溶液。

2.2.4供試樣品的處理腦組織樣品前處理方法A：取大鼠斷頭處死，冰臺(tái)上立即取腦，放于冰冷的生理鹽水中漂洗，濾紙吸干生理鹽水，將腦置于冰臺(tái)上迅速剝離海馬體與大腦皮層，稱重。冰冷的0.1%甲酸加入到腦組織中，按1KG-3∶KG-510（V/W）勻漿。4℃下，12000r/min離心20min，取上清液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，待測(cè)。

腦組織樣品前處理方法B[26＼]：取大鼠斷頭處死，立即取腦，置于80℃水浴2min后取出，用濾紙吸干水，迅速剝離海馬體與大腦皮層，稱重。冰冷的0.3%甲酸乙腈加入到腦組織中，按1KG-3∶KG-510（V/W）勻漿。4℃下，12000r/min離心20min，取上清液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，待測(cè)。

3結(jié)果與討論

3.1色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別取DA，E，NE，5HT，5HIAA，Melatonin，GABA，Tyr，Gly，Glu，Gln，Asp，Tau，Ser，Try，ACh，Histamine對(duì)照品的1mg/mL溶液，以0.1%甲酸溶液稀釋至5μg/mL。采用直接進(jìn)樣方式，電噴霧離子源（ESI），優(yōu)化各神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)三重四極桿質(zhì)譜分析條件，分別嘗試正、負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓為2.0～5.0kV；離子傳輸管溫度為200～400℃；霧化器溫度為200～400℃；鞘氣流速20～50arb；輔助氣流速0～10arb。并自動(dòng)優(yōu)化各神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）時(shí)所產(chǎn)生的碎片離子種類和豐度以及所需碰撞能量。

色譜條件優(yōu)化，考慮到所分析神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的極性較強(qiáng)、水溶性較好和在色譜柱上的保留問題，嘗試了不同類型的色譜柱（C8、C18和Hypercarb），Hypercarb色譜柱以多孔石墨化碳為固定相，對(duì)強(qiáng)極性化合物的保留和分離效果更好，且在不同梯度洗脫時(shí)，在100%水相條件下，保持穩(wěn)定的保留和分離；考慮神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的離子化效率較低的問題，比較了純水和不同濃度甲酸溶液作為流動(dòng)相對(duì)分離、分析效果的影響，結(jié)果表明，0.1%甲酸為流動(dòng)相時(shí)分析效果更佳。最終建立了無需衍生化、對(duì)腦組織樣品中17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)同時(shí)定量分析的UPLCMS/MS方法。

3.2方法學(xué)考察

3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限采用外標(biāo)法定量，各取適量按照上述方法配制的對(duì)照品溶液混合，再根據(jù)需要用0.1%甲酸溶液逐級(jí)稀釋成不同濃度的系列混合對(duì)照溶液。以待測(cè)物濃度作為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)，得到17種待測(cè)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的線性回歸方程。以信噪比（S/N）>10確定方法的定量限（LOQ）。各神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量限結(jié)果列于表2。

3.2.2精密度配制高、中、低3個(gè)濃度水平的混合對(duì)照品溶液，平行測(cè)定6次，計(jì)算各神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)峰面積的RSD，測(cè)得日內(nèi)精密度（Intradayprecision）。連續(xù)測(cè)定3日，計(jì)算各神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)峰面積的RSD，測(cè)得日間精密度（Interdayprecision）。測(cè)定結(jié)果如表2所示。LM

3.2.3加標(biāo)回收率

取同一腦組織樣品勻漿液，分別加入高、中、低3個(gè)濃度水平的混合對(duì)照品溶液，按照2.2.4節(jié)中樣品處理方法A操作，平行測(cè)定6次，計(jì)算各神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的加標(biāo)回收率（Recovery），結(jié)果如表2所示。

3.2.4重復(fù)性取同一腦組織樣品勻漿液6份，按照2.2.4小節(jié)中樣品處理方法A操作，平行測(cè)定6次，計(jì)算各神經(jīng)遞化學(xué)物質(zhì)峰面積的RSD，測(cè)得重復(fù)性（Repeatability），結(jié)果如表2所示。

3.3腦組織樣品前處理方法比較結(jié)果

大鼠大腦皮層中17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)經(jīng)UPLCMS/MS分析所得的提取離子流圖如圖1所示。不同前處理方法下大鼠海馬和大腦皮層中17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的含量水平結(jié)果如表3所示。所測(cè)4組樣品均檢測(cè)到待測(cè)的17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)，經(jīng)方法A處理的海馬和大腦皮層中5HT、Melatonin、GABA、Gln、Glu、Ser、Gly、Asp、Tyr和Try的測(cè)得含量顯著高于經(jīng)方法B處理的海馬和大腦皮層中的測(cè)得含量；DA、E、NE、5HIAA、ACh、Histamine和Tau的測(cè)得含量在經(jīng)方法A處理的海馬和大腦皮層中略高于經(jīng)方法B處理的海馬和大腦皮層。綜上所述，腦組織樣品前處理方法A優(yōu)于方法B。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了UPLCMS/MS法對(duì)大鼠海馬與大腦皮層中生物胺類及氨基酸類17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)同時(shí)快速檢測(cè)的方法。利用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，分別優(yōu)化液相色譜和質(zhì)譜條件，選擇合適的電離模式，對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)檢測(cè)的6種生物胺類和11種氨基酸類神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)分別選擇一對(duì)定性離子對(duì)和定量離子對(duì)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的分離、提取及確證，實(shí)現(xiàn)了它們的定量分析。此方法可在10min內(nèi)完成17種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)同時(shí)分析，檢測(cè)時(shí)間短、線性關(guān)系較好、方法回收率高、穩(wěn)定性良好，滿足分析要求。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠海馬和大腦皮層前處理方式進(jìn)行探究，對(duì)比了兩種樣品前處理方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，冷環(huán)境處理方式下測(cè)得大鼠海馬與大腦皮層中神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)含量較高，此方法無需衍生化、操作簡單、可直接測(cè)定。

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AbstractAnultraperformanceliquidchromatographytandemmass（UPLCMS/MS）spectrometrymethodwasestablishedfordeterminationofthecontentsofbioamineandaminoacidneurochemicalsinhippocampusandcerebralcortexofrat.Hypercarbcolumn（100mm×2.1mm，5μm）wasusedforthesampleseparationwith0.1%formicacidmethanolasthemobilephaseundergradientelution.TheneurochemicalsweredetectedbyMS/MSusingESIionsourceunderpositiveionizationmodewithMRMscan.Bothquantificationandconfirmationionswerechosenforeach6bioamineand11aminoacidneurochemicals.Theinfluenceoftwodifferentprocessingmethodsonthecontentsofneurochemicalsinbraintissueswascompared.Total17neurochemicalsweresimultaneouslydetectedin10min.Thecalibrationcurvewaswithagoodlinearrelationship.Theintradayandinterdayprecision，averagerecoveryandrepeatabilitycouldmeettheanalysisrequirement.ThisUPLCMS/MSmethodshowsexcellentselectivity，accuracy，highsensitivity，specificityandgoodrepeatability，andissuitablefortheseparationandquantizationofbioamineandaminoacidneurochemicalsinbraintissue.

KeywordsUltraperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry；Bioamineneurochemicals；Aminoacidsneurochemicals；Braintissue

HQWT6JY（Received27April2016；accepted8June2016）