王杰鵬，羅 瑤，郗大興

(吉林省?，斏锟萍加邢薰?，吉林遼源136200 )

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攪拌和通氣對(duì)裂殖壺菌LX0809產(chǎn)DHA的影響

王杰鵬，羅 瑤，郗大興

(吉林省?，斏锟萍加邢薰荆诌|源136200 )

利用一株生產(chǎn)DHA專(zhuān)利菌株裂殖壺菌LX0809，在10 L全自動(dòng)發(fā)酵罐中考察了16個(gè)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量組合對(duì)裂殖壺菌LX0809發(fā)酵產(chǎn)DHA的影響。生物量和總油脂的產(chǎn)量隨攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量的增加而增加，DHA占總油脂比例隨攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量的增加而降低，最終確定通氣量為全程0.3 m3/h(通氣比0.83)，攪拌轉(zhuǎn)速為前40 h 400 r/min，后56 h 300 r/min。發(fā)酵96 h放罐，細(xì)胞生物量92 g/L，油脂質(zhì)量濃度52.3 g/L，DHA占總油脂含量為40.2%，DHA發(fā)酵產(chǎn)量高達(dá)21 g/L。

裂殖壺菌；DHA；發(fā)酵；攪拌；通氣

二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，簡(jiǎn)稱(chēng)DHA)，屬于n-3系列長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，是大腦神經(jīng)視覺(jué)細(xì)胞中重要脂肪酸成分，占大腦脂肪酸的25%～33%。DHA在胎兒和嬰幼兒大腦及視覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中占有重要地位[1-3]。同時(shí)DHA有提高機(jī)體免疫力、阻止腫瘤細(xì)胞的異常增生[4-6]、降低心血管疾病發(fā)生概率等作用[7-8]。

DHA主要來(lái)源有南極磷蝦油、深海魚(yú)油和DHA藻油[9]。DHA藻油是唯一得到美國(guó)FDA認(rèn)可的兒童DHA補(bǔ)充劑來(lái)源，有DHA含量大于35%和大于40%兩種產(chǎn)品規(guī)格。DHA藻油的發(fā)酵菌株主要有裂殖壺菌、吾肯氏壺藻[10]和寇氏隱甲藻等。裂殖壺菌由于其生長(zhǎng)繁殖快、發(fā)酵周期短、抗剪切力強(qiáng)、油脂產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，是發(fā)酵法生產(chǎn)DHA藻油的理想菌株。

生物量、總油脂產(chǎn)量和DHA占總油脂含量是評(píng)價(jià)裂殖壺菌發(fā)酵法生產(chǎn)DHA藻油的主要指標(biāo)。本文中，筆者擬通過(guò)2因素4水平研究攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，并通過(guò)攪拌轉(zhuǎn)速分段控制實(shí)驗(yàn)來(lái)獲得最優(yōu)的發(fā)酵條件。

1 材料和方法

1.1 菌株

裂殖壺菌LX0809，由本企業(yè)篩選保藏。保藏號(hào)：CGMCC No.3535，已獲菌種專(zhuān)利[11]授權(quán)。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，蛋白胨5，Na2SO412，MgSO42，KH2PO41，CaCl20.3。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉15，谷氨酸鈉20，MgSO45，KH2PO45，Na2SO412，CaCl20.6；微量元素(mol/L)為泛酸鈣5×10-6、硼酸5×10-6、VB121×10-6、MnCl2·4H2O 5×10-6、ZnSO4·7H2O 5×10-6、CoCl2·6H2O 1×10-6、Na2MoO4·2H2O 1×10-6、CuSO4·5H2O 3×10-6、 NiSO4·6H2O 3×10-6、FeSO4·7H2O 3×10-6。

1.3 分析方法

1.3.1 葡萄糖濃度的檢測(cè)方法

取1 mL發(fā)酵液用去離子水定容到一定體積，取1 mL稀釋液10 000 r/min離心5 min，使用生物傳感分析儀SBA-40D(山東省科學(xué)院)檢測(cè)上清液葡萄糖濃度。

1.3.2 生物量的檢測(cè)方法

取10 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min后棄上清液，再用10 mL去離子水懸浮菌體，然后10 000 r/min離心5 min棄上清液，收集菌體，105 ℃烘干至恒質(zhì)量稱(chēng)量。

1.3.3 總油脂產(chǎn)量的檢測(cè)方法

取1 g干燥菌粉加入20%HCl溶液7 mL，75 ℃水浴振蕩40 min后，用20 mL正己烷抽提脂質(zhì)，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去盡溶劑，得到脂質(zhì)稱(chēng)量[12]。

1.3.4 DHA占總油脂含量的檢測(cè)方法

油樣的脂肪酸甲酯化方法、安捷倫7890B氣相檢測(cè)方法和DHA甘油三酯質(zhì)量百分含量計(jì)算方法，參照GB26400—2011食品添加劑 二十二碳六烯酸油脂(發(fā)酵法)。

1.4 10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件

10 L全自動(dòng)不銹鋼發(fā)酵罐(上海保興)中裝液量為6 L，121 ℃原位在線(xiàn)滅菌20 min。發(fā)酵接種量為5%，罐壓為0.05 MPa，溫度為28 ℃，發(fā)酵pH為6.0,使用5 mol/L NaOH和2 mol/L H2SO4水溶液自動(dòng)調(diào)節(jié)pH，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度低于10 g/L開(kāi)始流加600 g/L葡萄糖，并保持殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為10 g/L左右，攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)置。

2 結(jié)果與討論

2.1 攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

DHA藻油的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要有35%和40%兩種。如果發(fā)酵液中DHA含量低于40%，則必須經(jīng)過(guò)冬化工藝以提高藻油中DHA含量到40%以上。為了探索在發(fā)酵液中提高DHA含量到40%的最優(yōu)發(fā)酵條件，考察攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量對(duì)DHA生產(chǎn)的影響。在10 L發(fā)酵罐中考察攪拌轉(zhuǎn)速(r/min)：200、300、400、500和通氣量(m3/h)：0.2、0.3、0.4、0.5(對(duì)應(yīng)通氣比：0.56、0.83、1.11、1.39)，借助正交分析的方法研究2個(gè)因素各4個(gè)水平的16個(gè)組合對(duì)裂殖壺菌LX0809發(fā)酵產(chǎn)DHA藻油的生物量(dry cell weight)、總油脂產(chǎn)量(total fatty acids)、DHA占總油脂含量3個(gè)指標(biāo)的影響。除攪拌和通氣外，所有實(shí)驗(yàn)條件都相同，發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1所示，正交結(jié)果分析如表2所示。

表1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

借助正交分析方法研究攪拌和通氣對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，優(yōu)選當(dāng)DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%，同時(shí)獲得盡可能多的總油脂產(chǎn)量的發(fā)酵工藝條件。

(a) 以生物量為指標(biāo)，隨著攪拌速度和通氣量的提高，生物量越大；并且攪拌速度極差為72.75，大于通氣量所得極差27.50，說(shuō)明攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)生物量的影響效果更明顯。

(b) 以總油脂產(chǎn)量為指標(biāo)，隨著攪拌速度和通氣量的提高，總油脂的產(chǎn)量越大；并且攪拌速度極差為54.175，大于通氣量所得極差20.050，說(shuō)明攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)總油脂產(chǎn)量的影響效果更明顯。

(c) 以DHA占總油脂含量為指標(biāo)，隨著攪拌速度和通氣量的提高，DHA占總油脂含量越低；攪拌速度極差大小為11.325，大于通氣量所得極差3.925，說(shuō)明攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)DHA占總油脂含量的影響效果更明顯。

綜上所述，通過(guò)攪拌和通氣調(diào)節(jié)DHA發(fā)酵過(guò)程的攝氧率，生物量及總油脂產(chǎn)量隨著攪拌和通氣的增大而增加，而DHA占總油脂的含量隨著攪拌和通氣的增大而降低。其中攪拌的影響效果明顯大于通氣，當(dāng)攪拌速度為200和300 r/min時(shí)，DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以達(dá)到40%，但是生物量和總油脂產(chǎn)量偏少。

2.2 攪拌速度分段控制實(shí)驗(yàn)

裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA油脂主要分為兩個(gè)階段：生長(zhǎng)繁殖階段和油脂積累階段[13]。生物合成DHA的代謝路徑主要有依賴(lài)O2的脂肪酸合成(FAS)途徑和不依賴(lài)O2的多聚乙酰合成酶(PKS)途徑[13-14]。研究表明裂殖壺菌合成DHA的路徑是類(lèi)似于細(xì)菌的PKS途徑[15]，且裂殖壺菌細(xì)胞內(nèi)兩個(gè)脂肪酸合成酶系同時(shí)存在[12]。攝氧率(OUR)是單位時(shí)間內(nèi)單位體積發(fā)酵液中微生物攝取氧的量，記作r(O2)(mmol/(L·h))，即每小時(shí)每升發(fā)酵液的氧氣實(shí)際消耗量。發(fā)酵前期主要進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量積累，油脂含量少，攝氧率高有利于細(xì)胞繁殖；在發(fā)酵的中后期油脂積累階段，氮源基本耗盡，細(xì)胞繁殖減弱，用于維持細(xì)胞增殖的O2需求下降。而PKS途徑不依賴(lài)O2，因此發(fā)酵中后期攝氧率相對(duì)大小能夠反映細(xì)胞用于中短鏈飽和脂肪酸合成的FAS酶系的活力相對(duì)強(qiáng)弱。所以通過(guò)改變通氣和攪拌調(diào)節(jié)發(fā)酵體系攝氧率，可以調(diào)節(jié)FAS路徑的合成效率。攝氧率低有利于抑制中短鏈飽和脂肪酸合成，進(jìn)而改變油脂中脂肪酸的組成比例。

本實(shí)驗(yàn)考察發(fā)酵前期400 r/min、后期300 r/min，分段轉(zhuǎn)速控制對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)DHA藻油的影響。發(fā)酵40 h左右，氮磷源基本耗盡(數(shù)據(jù)未顯示)，因此攪拌轉(zhuǎn)速切換時(shí)間選擇為40 h。由于通氣對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響相對(duì)偏小，通風(fēng)量全程為0.3 m3/h(通氣比0.83)。分段轉(zhuǎn)速控制發(fā)酵結(jié)果如表3所示，分段轉(zhuǎn)速控制發(fā)酵代謝曲線(xiàn)如圖1所示。

表3 攪拌分段控制發(fā)酵結(jié)果

圖1 攪拌分段控制發(fā)酵代謝曲線(xiàn)Fig.1 Metabolic curve of the stepwise agitation fermentation

由圖1可知：通過(guò)攪拌轉(zhuǎn)速的分段控制，在前40 h生長(zhǎng)繁殖階段，攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min，40 h左右細(xì)胞進(jìn)入油脂積累階段，攪拌轉(zhuǎn)速降為300 r/min。發(fā)酵96 h放罐，DHA占總油脂含量由48 h的37.3%提高到40.2%，生物量由48 h的58 g/L提高到92 g/L，總油脂產(chǎn)量從48 h的25.2 g/L提高到52.3 g/L，發(fā)酵后期48 h生物量的增長(zhǎng)量基本都是油脂的積累。在過(guò)低的攪拌轉(zhuǎn)速下，盡管DHA含量較高，達(dá)到44.3%，卻導(dǎo)致細(xì)胞繁殖數(shù)量偏少，在96 h放罐時(shí)生物量和總油脂產(chǎn)量較低。

Ren等[15-16]報(bào)道在1.5 t發(fā)酵罐中發(fā)酵132 h，生物量71 g/L，總油脂產(chǎn)量35.17 g/L，DHA占總油脂含量44.82%，DHA產(chǎn)量15.76 g/L。本研究通過(guò)優(yōu)化攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，發(fā)酵96 h生物量92 g/L，總油脂產(chǎn)量52.3 g/L，DHA占總油脂含量40.2%，DHA產(chǎn)量21 g/L。該發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵周期短，且可以不經(jīng)冬化工藝直接生產(chǎn)含量40%以上的DHA藻油，具有明顯的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

本研究采用前40 h攪拌速度400 r/min，后56 h攪拌速度300 r/min的分段轉(zhuǎn)速控制工藝，通氣0.3 m3/h(通氣比0.83)，裂殖壺菌LX0809發(fā)酵96 h，生物量和總油脂僅略低于轉(zhuǎn)速400 r/min、通氣0.3 m3/h(通氣比0.83)的實(shí)驗(yàn)，但是DHA的含量達(dá)到40.2%；DHA的含量略低于轉(zhuǎn)速全程300 r/min、通氣0.3 m3/h(通氣比0.83)的實(shí)驗(yàn)，但是生物量達(dá)到92 g/L，總油脂產(chǎn)量達(dá)到52.3 g/L。既保證發(fā)酵96 h生物量和總油脂產(chǎn)量較高，也使DHA占總油脂含量達(dá)到40%。除攪拌和通氣外，發(fā)酵罐中攝氧率還可能受到培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度、罐壓、發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)等因素影響，后續(xù)將圍繞攝氧率對(duì)裂殖壺菌LX0809發(fā)酵產(chǎn)DHA藻油的影響進(jìn)行更加深入的研究。

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(責(zé)任編輯 管珺)

Effects of agitation and aeration on DHA production bySchizochytriumLX0809

WANG Jiepeng， LUO Yao， XI Daxing

(JiLin Xima Biotechnology Co.,Ltd.,Liaoyuan 136200,China)

StrainSchizochytriumLX0809 that could accumulate DHA was used in this study.The effects of agitation and aeration on DHA production were investigated in a 10-L fermenter with 16 fermentation experiments.Dry cell weight and total fatty acids increased with the increase of agitation and aeration,whereas DHA content decreased with the increase of agitation and aeration.Total fatty acids and DHA content increased under the optimal condition when the aeration was 0.3 m3/h,and agitation was kept at 400 r/min for the first 40 h and 300 r/min for latter 56 h.Dry cell weight,DHA in total fatty acids, DHA content and the DHA yield reached 92 g/L,52.3 g/L,40.2% and 21 g/L,respectively.

Schizochytrium; DHA; fermentation; agitation; aeration

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.01.003

2016-03-10

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃) (2014AA021701)

王杰鵬(1984—)，男，四川綿陽(yáng)人，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：wangjiepeng1999@163.com

R282.71

A

1672-3678(2017)01-0016-04