HPLC-DAD法檢測(cè)喹乙醇預(yù)混劑中違規(guī)添加喹烯酮的研究

陸春波,高三玉,羅成江,包愛(ài)情

(1浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 311101；2浙江省臺(tái)州市路橋區(qū)城區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，浙江臺(tái)州 318050)

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HPLC-DAD法檢測(cè)喹乙醇預(yù)混劑中違規(guī)添加喹烯酮的研究

陸春波1,高三玉2,羅成江1,包愛(ài)情1

(1浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 311101；2浙江省臺(tái)州市路橋區(qū)城區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，浙江臺(tái)州 318050)

確證1批次喹乙醇預(yù)混劑中的非法添加物。采用HPLC-DAD的譜庫(kù)匹配，推斷出疑似添加物為喹烯酮，從而建立了檢測(cè)喹乙醇預(yù)混劑中違規(guī)添加喹烯酮的反相高效液相色譜法(HPLC-DAD)。采用Agilent Eclipse XDB- C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(60∶40)，流速1.0 mL/min，波長(zhǎng)掃描范圍為210～400 nm。喹烯酮在1～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=1.0000；平均回收率為99.4%～99.8%，n=5，RSD在0.8%～1.0%之間。

喹乙醇;預(yù)混劑;喹烯酮;反相高效液相色譜法

近年來(lái)，農(nóng)業(yè)部對(duì)獸藥處方外非法添加的監(jiān)管與打擊力度不斷加大，規(guī)定鑒別抽檢的檢驗(yàn)應(yīng)當(dāng)執(zhí)行《獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)充檢查方法》。對(duì)于沒(méi)有補(bǔ)充的檢查方法標(biāo)準(zhǔn)，可按《獸藥中非法添加物質(zhì)檢查方法標(biāo)準(zhǔn)》[1]自行建立補(bǔ)充檢查方法。在鑒別抽檢時(shí)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有1批次喹乙醇預(yù)混劑樣品添加喹烯酮，添加手段極為隱蔽。為了打擊非法添加行為，建立喹乙醇預(yù)混劑中違規(guī)添加喹烯酮藥物的檢查方法迫在眉睫。喹烯酮預(yù)混劑的檢測(cè)方法主要是液相色譜法[2]，本研究在此基礎(chǔ)上建立了喹乙醇預(yù)混劑中違規(guī)添加喹烯酮的檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司； XS-205電子天平(感量0.01 mg)，瑞士METTLER TOLEDO公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 甲醇為色譜純，Merck 公司；實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q超純水。喹乙醇預(yù)混劑樣品(批號(hào)為16030101)，標(biāo)示規(guī)格為5%，為2016年度監(jiān)督抽檢樣品；喹乙醇對(duì)照品，批號(hào)H0061103，含量99.5%，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；喹烯酮對(duì)照品，批號(hào)H0561305，含量99.6%，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB- C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-水(60:40)為流動(dòng)相；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，采集波長(zhǎng)范圍210～400 nm，分辨率為1.2 nm，記錄314 nm波長(zhǎng)處的色譜圖。

2.2 溶液制備

2.2.1 喹乙醇預(yù)混劑空白溶液 取已測(cè)得不含喹烯酮的喹乙醇預(yù)混劑(規(guī)格為5%)1.0 g，置100 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲10 min，冷卻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；取5.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為空白溶液。

2.2.2 喹烯酮對(duì)照品儲(chǔ)備液 取喹烯酮對(duì)照品10 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲10 min，冷卻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成0.1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性溶液 分別取喹乙醇和喹烯酮對(duì)照品各10 mg，分別置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度；精密量取上述溶液各5 mL，置同一50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性 量取系統(tǒng)適用性溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察喹乙醇和喹烯酮的分離度，結(jié)果見(jiàn)圖1。在上述色譜條件下，喹乙醇和喹烯酮的分離度為17.99。

圖1 系統(tǒng)適用性色譜圖

2.3.2 樣品本底及干擾 精密量取空白溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示喹乙醇預(yù)混劑中成分對(duì)喹烯酮測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾(圖2)。

圖2 空白溶液色譜圖

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密量取喹烯酮對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇制成1、2、4、8、20、40、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，測(cè)定。按喹烯酮峰面積與對(duì)應(yīng)的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。喹烯酮回歸方程為y=51.00941x+0.988822，r=1.0000。表明喹烯酮在1～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 檢測(cè)限和定量限 取已測(cè)得不含喹烯酮的喹乙醇預(yù)混劑(含喹乙醇5%)1.0 g，置100 mL量瓶中，精密加入喹烯酮對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，制成濃度0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/g的添加樣品。以光譜圖(圖3)失真的最大濃度作為檢出限，以3倍檢出限作為定量限。該色譜條件下喹烯酮在喹乙醇預(yù)混劑樣品中的檢出限為0.5 mg/g，定量限為1.5 mg/g。

圖3 喹烯酮檢出限色譜圖(1 μg/mL)(A)、光譜圖(B)

2.3.5 回收率試驗(yàn) 取已測(cè)得不含喹烯酮的喹乙醇預(yù)混劑(含喹乙醇5%)1.0 g，置100 mL量瓶中，加喹烯酮對(duì)照品適量，分別按0.5、1.0、2.5 mg/g進(jìn)行添加，制成3個(gè)不同添加濃度，每個(gè)濃度制備5個(gè)平行樣品，加甲醇適量，超聲10 min，冷卻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；取5.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)2針，測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 喹烯酮回收率結(jié)果(n=5)

2.3.6 樣品的測(cè)定 取喹乙醇預(yù)混劑樣品(批號(hào)為16030101)1.0 g，置100 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲10 min，冷卻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；取5.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別精密量取供試品溶液和喹烯酮對(duì)照品溶液(20 μg/mL)10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖和光譜圖及峰純度檢查(圖4～圖5)。結(jié)果顯示：供試品溶液喹烯酮色譜峰與喹烯酮對(duì)照品溶液色譜峰保留時(shí)間一致，光譜相似；純度因子大于純度閾值，顯示為單一物質(zhì)峰。

圖4 喹乙醇預(yù)混劑樣品(批號(hào)16030101)色譜圖(A)、光譜圖(B)、純度檢查圖(C)(純度因子998.939，純度閾值990.000)

圖5 喹烯酮對(duì)照品溶液(20 μg/mL)色譜圖(A)、光譜圖(B)、純度檢查圖(C)(純度因子999.944，純度閾值990.000)

3 討論與小結(jié)

3.1 非法添加物的發(fā)現(xiàn)和分析 喹乙醇預(yù)混劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)獸藥典》二○一○版一部[3]，采用可見(jiàn)-紫外分光光度法鑒別并測(cè)定其含量。在監(jiān)督抽檢時(shí)，發(fā)現(xiàn)有1批次喹乙醇預(yù)混劑樣品按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，鑒別項(xiàng)和含量項(xiàng)均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，但該批次樣品的紫外光譜圖與喹乙醇的紫外光譜圖比較，除了266 nm和382 nm波長(zhǎng)處有最大吸收外，在310 nm波長(zhǎng)處多了一個(gè)最大吸收峰，懷疑添加有其他喹噁啉類(lèi)藥物。采用HPLC-DAD譜庫(kù)作了匹配，疑似添加物鎖定為喹烯酮。

3.2 色譜條件、提取溶劑和提取波長(zhǎng)的選擇 本試驗(yàn)中采用的色譜條件，參照《獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(化學(xué)藥品、中藥卷第一冊(cè))》[3]喹烯酮預(yù)混劑的液相色譜條件，采用二極管陣列檢測(cè)器。對(duì)喹烯酮在甲醇

中的溶解性進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在本方法濃度范圍內(nèi)，喹烯酮在甲醇中的溶解性良好?？紤]到在非法添加高通量篩查中以甲醇作為溶劑具有普適性，選取甲醇作為提取溶劑。喹烯酮對(duì)照品在210～400 nm波長(zhǎng)范圍最大吸收波長(zhǎng)為232、260、314 nm，為避免測(cè)定溶劑及流動(dòng)相對(duì)紫外吸收的干擾，選擇314 nm作為提取波長(zhǎng)。

喹乙醇和喹烯酮均屬于喹噁啉衍生物，被廣泛用作抗菌促生長(zhǎng)飼料添加劑[4]。該批次樣品如果按照《中國(guó)獸藥典二○一○年版一部》檢測(cè)，含量測(cè)定和鑒別項(xiàng)均符合規(guī)定，含量測(cè)定結(jié)果顯示含5%的喹乙醇。如果按本文的液相色譜方法檢測(cè)，結(jié)果顯示該批次樣品含喹乙醇外，還添加2.5%的喹烯酮。用喹烯酮部分代替喹乙醇生產(chǎn)喹乙醇預(yù)混劑，不僅違反《獸藥管理?xiàng)l例》，超量使用喹烯酮也給食品安全帶來(lái)很大隱患。

[1] 農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2016〕2號(hào)附錄3[S].

[2] 中國(guó)獸藥典委員會(huì). 獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(化學(xué)藥品、中藥卷第一冊(cè))[S].

[3] 中國(guó)獸藥典委員會(huì). 中國(guó)獸藥典二○一○年版一部[S].

[4] 程古月, 洪璇, 郝海紅, 等. 獸用喹噁啉類(lèi)藥物毒理學(xué)機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2016, 36 (6): 1071-1075.

(編輯：侯向輝)

Determination of Quinocetone into Olaquindox Premix by HPLC-DAD

LU Chun-bo1, GAO San-yu2, LUO Cheng-jiang1, BAO Ai-qing1

(1.ZhejiangProvinceInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuff,Hangzhou311101,China；2.ZhejiangTaizhouLuqiaoDistrictAnimalHealthInspectionInstitute,Taizhou,Zhejiang318050,China)

To identify the unknown adulterated compound in one batch of olaquindox premix in the common course, an unknown compound was observed with characteristic UV spectra. The compound was deduced with the information provided by HPLC-DAD. Results showed that the unknown adulterated compound in this sample was identified as quinocetone. To establish a HPLC-DAD method for the determination of quinocetone in olaquindox premix, the chromatographic column was Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm ×4.6 mm, 5 μm), the mobile phase consisted of a mixture of a solution of methanol and water(60∶40). The flow rate was 1.0 mL/min. The scanning wavelength was from 210 to 400 nm. Quinocetone in 1～100 μg/mL concentration range of linear is good(r=1.0000). The average recoveries was 99.4%～99.8% (n=5)withRSDbetween 0.8% and 1.0%.

olaquindox; premix; quinocetone; HPLC-DAD

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201203023-4)

陸春波，高級(jí)獸醫(yī)師，從事獸藥檢驗(yàn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。 E-mail：2586064747@qq.com

2016-10-13

A

1002-1280 (2017) 03-0061-04

S859.83