何晉浙，毛燚杰，馮婷婷，孫培龍

(浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 杭州，310014)

香菇生物堿類物質(zhì)的毛細管電泳指紋圖譜

何晉浙，毛燚杰，馮婷婷，孫培龍*

(浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 杭州，310014)

采用快速溶劑法醇提香菇中生物堿類物質(zhì)，進行毛細管電泳色譜分析。毛細管電泳優(yōu)化條件：背景電解質(zhì)溶液：25 mmol/L硼砂-10 mmol/L β-環(huán)糊精，pH：9.5，運行電壓：20 kV，進樣條件：20 psi，5 s，溫度：25 ℃，檢測波長：214 nm。毛細管電泳色譜方法學(xué)考察，其精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均符合指紋圖譜要求，分別建立了福建、湖北、吉林、云南等地的香菇生物堿類成分的毛細管電泳指紋圖譜，確定14個共有峰，通過相似度評價系統(tǒng)對10批香菇進行評價，多數(shù)香菇樣品的相似度在0.8以上，可用于香菇的質(zhì)量控制。

香菇；生物堿類物質(zhì)；毛細管電泳；指紋圖譜

香菇具有抗病毒、抗腫瘤、增強免疫力、降血脂、抗血栓、保肝等功效[1-3]。其中，生物堿類物質(zhì)是香菇中重要的藥效成分。生物堿結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多，而指紋圖譜具有整體性特點，能有效鑒別中藥、食品的類別、真假和產(chǎn)地，并對不同產(chǎn)地、時期的藥材質(zhì)量穩(wěn)定性和均一性做出準確評價。高效毛細管電泳因其低消耗、無污染、柱效高、樣品處理簡單而日益受到重視[4]。本研究運用高效毛細管電泳法對食用菌進行指紋圖譜的研究，并運用國家藥典委推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(2004A)》軟件，對香菇中的生物堿類物質(zhì)進行了指紋圖譜測定和相似度計算。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 儀器與設(shè)備

DJ-04型中藥粉碎機，上海淀久儀器公司；APLE-3000加速溶劑萃取儀，北京吉天儀器有限公司；AL-104電子天平，METTLER TOLEDO有限公司；SHB-Ⅲ-A 型循環(huán)水真空泵，杭州大衛(wèi)科教儀器公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Milli Q超純水系統(tǒng)，美國密理博公司；未涂層石英毛細管柱(55 cm × 50 μm(i.d.))，河北永年光纖廠；QT-2旋渦振蕩混合器，上海琪特儀器公司；K3200LH超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器公司；CR21G Ⅱ型高速冷凍離心機，日本日立儀器公司；PHS-3C型數(shù)顯酸度計，杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司；UV-7504紫外可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司；P/ACETMMDQ型高效毛細管電泳儀，美國Beckman公司。

1.1.2 樣品與試劑

S1為益生菌發(fā)酵生料栽培香菇，批號為241#，由浙江省慶元縣食用菌研究所提供，其他9批香菇購自各產(chǎn)地，分別產(chǎn)于福建古田大花菇(S2)、福建古田香菇(S3)、福建古田小花菇(S4)、湖北花菇(S5)、湖北金錢菇(S6)、湖北香菇(S7)、吉林大花菇(S8)、吉林香菇(S9)、云南麗江野生香菇(S10)。

體積分數(shù)為95%酒精，食品級；無水乙醇、甲醇、NaH2PO4、Na2HPO4、氨基丁三醇、檸檬酸、H3BO3、硼砂、β-環(huán)糊精均為分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 電泳條件

運行緩沖液：25 mmol/L硼砂-10 mmol/L β-環(huán)糊精(pH 9.50)；檢測波長：214 nm；分離電壓：20 kV；進樣條件：20 psi，5 s；毛細管溫度：25 ℃[5]。毛細管使用前依次用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液、超純水和運行緩沖液分別沖洗3、7、8 min，上述試劑使用前均經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，并超聲脫氣。每日實驗結(jié)束后依次用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液、超純水沖洗毛細管各10 min[6]。

1.2.2 供試樣品制備

香菇樣品經(jīng)烘干、粉碎、過篩后，采用快速溶劑萃取法制備供試樣品[7]。準確稱取4 g香菇粉末，置于萃取池中，萃取池底部提前加入過濾膜，樣品與硅藻土粉末混合均勻，填滿萃取池，將萃取池放在萃取池固定裝置上。以體積分數(shù)為80%的乙醇為提取溶劑，設(shè)定提取參數(shù)：靜態(tài)萃取時間15 min、提取溫度140 ℃、循環(huán)2次、吹洗體積80%，啟動加速溶劑萃取儀，提取完成后自動停止，將提取液離心過濾，定容，用0.45 μm濾膜過濾，得供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳條件優(yōu)化

2.1.1 背景電解質(zhì)的選擇

分別試驗了50 mmol/L NaH2PO4、25 mmol/L Tris-cit、25 mmol/L Tris-10 mmol/L H3BO3、30 mmol/L硼砂、25 mmol/L PBS、25 mmol/L BBS、50 mmol/L NaH2PO4-25 mmol/L硼砂、25 mmol/L硼砂-10 mmol/L β-環(huán)糊精等多種緩沖溶液體系。將指紋圖譜積分信號導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng)”軟件[8]，計算在各背景電解質(zhì)條件下的分離結(jié)果，用分離量指數(shù)(RF)表示，如表1所示。RF反映了指紋信號強度、峰間等距性、分布均化性和分離效率等指標，RF值越大分離效果越好[9]。結(jié)合相應(yīng)的指紋圖譜，可知前7種緩沖溶液體系基線漂移較大，離子強度大，電導(dǎo)高，基電壓較高，噪聲較大，而最后一種即硼砂-β-環(huán)糊精緩沖液離子強度小、背景電導(dǎo)低、分析靈敏度高、分離效果最好、電泳電流小，因此選擇了此緩沖液。緩沖液用量過大會產(chǎn)生焦耳熱，導(dǎo)致峰形變差，配制的25 mmol/L硼砂-10 mmol/L β-環(huán)糊精緩沖液效果較其他濃度的好[10]。

表1 不同背景電解質(zhì)下的毛細管電泳指紋圖譜分離量指數(shù)

2.1.2 緩沖溶液pH 的選擇

緩沖液的pH影響毛細管表面的電勢，從而影響電滲流的方向和速度[5]?？疾炀彌_液的pH為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0和10.5時對電泳分離效果的影響，結(jié)果如表2所示，發(fā)現(xiàn)pH過低，峰的分離度不高，但隨著pH的增大，各組分的分離度增加，遷移時間延長。綜合分離效率考慮，確定緩沖液pH為9.5。

2.1.3 運行電壓的選擇

運行電壓主要影響毛細管電泳的分離效率和分離度，升高電壓雖然能夠縮短整個分析時間，但超過某一特定程度時，緩沖溶液的焦耳熱難以散發(fā)，導(dǎo)致其黏度有所降低，增加了遷移率，從而分離度下降[5]。實驗結(jié)果如表2所示，結(jié)合毛細管電泳指紋圖譜可知，低電壓時分離度增大且基線穩(wěn)定，但用時過長；而當(dāng)電壓增加后，分析時間有一定的縮短，但是其分離效果十分不理想且基線漂移嚴重。本文將分離電壓進行梯度調(diào)試(12、15、18、20、22、25、30 kV)，最終確定其運行電壓為20 kV。

表2 緩沖溶液的不同pH、不同運行電壓下的毛細管電泳指紋圖譜分離量指數(shù)

2.1.4 檢測波長的選擇

在190～400 nm波長范圍內(nèi)對供試樣品溶液進行紫外掃描，掃描結(jié)果在214、230、270 nm處有出峰，比較這3個波長下的出峰情況，如表3所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在214 nm下峰的分離效果最好，當(dāng)檢測波長大于214 nm時，出峰變少且峰形變鈍，故選擇214 nm為檢測波長。

2.1.5 進樣條件的選擇

隨著樣品進樣量的增加，儀器濃度響應(yīng)值也會相應(yīng)提高，但是過大的進樣量，超過了毛細管的負荷，出現(xiàn)了峰展寬和分離度降低等現(xiàn)象[11]。本文以壓力20 psi進樣，以進樣持續(xù)時間(5、10、15、20 s)考察進樣量對分離效果的影響，結(jié)果如表3所示，最終確定進樣時間為5 s。

表3 不同檢測波長、進樣時間下香菇生物堿類成分的的RF值

2.2 高效毛細管電泳的方法學(xué)考察

2.2.1 穩(wěn)定性試驗

取S1的供試品溶液，按“1.2.1”電泳條件，樣品在室溫下分別放置0、1、2、4、6 h后進行測定并記錄所有電泳圖，如圖1所示。以8號峰的峰面積和遷移時間為參照，計算出共有峰的相對遷移時間的RSD<1.5%，相對峰面積的RSD<2.8%，表明供試品溶液在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

圖1 穩(wěn)定性試驗Fig.1 Stability tests

2.2.2 精密度試驗

取S10的供試品溶液，按“1.2.1”電泳條件，重復(fù)進樣5次，記錄電泳圖，如圖2所示。以8號峰的峰面積和遷移時間作為參照，計算得到共有峰相對遷移時間的RSD<3.7%，相對峰面積的RSD<4.7%，表明檢測系統(tǒng)的進樣精密度合格。

圖2 精密度試驗Fig.2 Precision tests

2.2.3 重復(fù)性試驗

取S10號供試品溶液，按“1.2.1”電泳條件，制備5份供試品溶液作為平行，進樣檢測，記錄電泳圖，如圖3所示。以8號峰的峰面積和遷移時間作為參照，計算得出共有峰相對遷移時間的RSD<3.3%，相對峰面積的RSD<4.6%，表明方法重復(fù)性良好。

圖3 重復(fù)性試驗Fig.3 Repeatability tests

2.3 樣品測定及毛細管電泳指紋圖譜建立

取10批香菇供試品，按“1.2.1”電泳條件進行測定，記錄色譜圖，通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004A版)》軟件分析，得到香菇指紋圖譜中14個色譜峰為共有峰，香菇指紋圖譜共有模式及10批香菇的毛細管電泳指紋圖譜，如圖4、圖5所示。

圖4 香菇生物堿類成分的毛細管電泳圖譜Fig.4 Fingerprint of the alkaloids from lentinus edodes

圖5 10批香菇的毛細管電泳指紋圖譜Fig.5 Fingerprint of 10 batches of lentinus edodes

2.4 共有指紋峰的相對保留時間及相對峰面積

在供試品色譜中，以8號峰為參照峰，將其他特征峰的保留時間及峰面積與之相比，得到各峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果如表4、表5所示。比較各個樣品共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積比值變化范圍不大，穩(wěn)定性強，可作為其指紋信息特征[12]。

表4 十批香菇總生物堿指紋圖譜的相對保留時間

表5 十批香菇總生物堿指紋圖譜的相對峰面積

2.5 相似度評價

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004A版)》對10批香菇進行相似度評價，以香菇241#作為對照圖譜，計算各色譜圖的整體相似度，結(jié)果如表6所示。10批香菇中有8批香菇毛細管電泳指紋圖譜的相似度大于0.8，相似度較高，但由于香菇成分含量及其比例的變化受種植環(huán)境、種植時間等諸多因素的影響，各香菇品種間存在差異，如S4的相似度只有0.702，S9的相似度只有0.720。每個不同品種和產(chǎn)地的香菇除了14個共有峰之外還具有自己的特征峰，如圖2和圖3中云南野生香菇S10毛細管電泳圖譜上的20號峰。由共有特征峰來看，可以判斷食用菌香菇類質(zhì)量是穩(wěn)定的，具有良好的相似度，可以建立香菇指紋圖譜，對香菇的質(zhì)量控制具有指導(dǎo)意義，通過指紋圖譜的數(shù)據(jù)庫建立可對不同產(chǎn)地的香菇品種、來源進行質(zhì)控評價，為香菇的開發(fā)利用提供了技術(shù)支撐，并以此作為食用菌指紋特征峰的獲取方法，為下一步的中藥譜效學(xué)的研究提供食用菌量化的指紋特征數(shù)據(jù)[13]。

表6 十批香菇生物堿類成分相似度計算結(jié)果

3 結(jié)論

采用快速溶劑法醇提香菇中生物堿類物質(zhì)，進行毛細管電泳色譜分析。毛細管電泳優(yōu)化條件：背景電解質(zhì)溶液：25 mmol/L硼砂-10 mmol/L β-環(huán)糊精，pH：9.5，運行電壓：20 kV，進樣條件：20 psi，5 s，溫度：25 ℃，檢測波長：214 nm。毛細管電泳色譜方法學(xué)考察，其精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均符合指紋圖譜要求，分別建立了福建、湖北、吉林、云南等地的香菇生物堿類成分的毛細管電泳指紋圖譜，確定14個共有峰，通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004A版)》對10批香菇進行評價，多數(shù)香菇樣品的相似度在0.8以上，表明各產(chǎn)地和品種之間具有較好的相關(guān)性。但同時存在差異，如14個共有峰的高低、大小都有所不同，也就是生物堿含量有差別，除共有峰之外，不同產(chǎn)地的香菇還具有各自的特征峰或雜峰。因為相似度差異越大，其成分差別越大，所以指紋圖譜就為香菇生物堿的質(zhì)量控制提供了研究依據(jù)。

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Study on capillary electrophoresis fingerprints of alkaloids from lentinus edodes

HE Jin-zhe,MAO Yi-jie,FENG Ting-ting,SUN Pei-long*

(College of Ocean, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Accelerated solvent extraction was used in extracting alkaloids from lentinus edodes and its analysis was performed by capillary electrophoresis. The optimized conditions of capillary electrophoresis were: background electrolyte 25 mmol/L borax-10 mmol/L β-cyclodextrin; pH 9.5; the running voltage 20 kV; the sample size 20 psi×5 s; the column temperature 25 ℃ and the detection wavelength 214 nm. Capillary electrophoresis methodology analysis showed that the method is precision, stable and reproductive. They were meet with the requirements of fingerprints. The capillary electrophoresis fingerprints of the alkaloids of letinous edodes in different regions were established. We found out 14 common peaks from the fingerprints, and evaluated the similarity of 10 batches of lentinus edodes through professional similarity evaluation system. The results showed that similarity of majority of those lentinus edodes were above 0.8 which indicate that the method can be served as a novel reference to identify and control the quality of lentinus edodes.

lentinus edodes; alkaloids; capillary electrophoresis; fingerprint

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703037

學(xué)士，副教授(孫培龍教授為通訊作者,E-mail：sun_pl@zjut.edu.cn)。

浙江省科技創(chuàng)新團隊建設(shè)項目(2009R50029)

2016-07-11，改回日期：2016-08-25