唐娟娟 王啟盛 高 瞾 孫夢(mèng)秋 張 垚 朱 婷 陳 剛

·實(shí)驗(yàn)研究·

越鞠丸對(duì)帕金森病抑郁模型小鼠的抗抑郁作用研究

唐娟娟 王啟盛 高 瞾 孫夢(mèng)秋 張 垚 朱 婷 陳 剛

目的研究越鞠丸對(duì)帕金森病抑郁(PDD)模型小鼠的抗抑郁治療效果及其作用機(jī)制。

帕金森病抑郁；越鞠丸；突觸可塑性

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是中老年常見(jiàn)的慢性神經(jīng)退行性疾病, 臨床主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)異常等運(yùn)動(dòng)癥狀, 此外還伴有嗅覺(jué)障礙、便秘、抑郁和焦慮等非運(yùn)動(dòng)癥狀。其中, 抑郁是PD最常見(jiàn)的非運(yùn)動(dòng)癥狀, 影響PD患者的生活質(zhì)量, 損害患者認(rèn)知功能及增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān), 是影響PD患者治療的重要因素［1］, 大量臨床研究表明帕金森病伴發(fā)抑郁(Parkinson’s disease depression, PDD)的發(fā)病率超過(guò)50%［2］。目前臨床實(shí)驗(yàn)認(rèn)為選擇性5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑和行為干預(yù)對(duì)PDD有一定療效［3］,但其療效并未得到可靠的評(píng)價(jià)。越鞠丸始載于元代朱丹溪的《丹溪心法》, 方由蒼術(shù)、香附、川芎、神曲、梔子五味藥組成。中醫(yī)理論認(rèn)為越鞠丸專(zhuān)為郁病而設(shè), 重在理氣解郁, 兼顧六郁(汪昂《醫(yī)方集解》)。大量研究證實(shí)以越鞠丸為基礎(chǔ)方進(jìn)行的抗抑郁治療效果理想, 例如, 越鞠丸治療中風(fēng)后抑郁有效率為85.19%［4］；越鞠升降湯治療老年抑郁癥的長(zhǎng)期效果與西酞普蘭相當(dāng)［5］。越鞠丸與度洛西汀聯(lián)用, 療效明顯高于單用度洛西汀, 副作用少［6］。本研究制備MPTP亞急性小鼠模型, 從中篩選出PDD小鼠, 考察越鞠丸對(duì)帕金森病抑郁的治療作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料來(lái)源

1.1 藥物制備 越鞠丸的制備：香附、川芎、梔子、蒼術(shù)、神曲(由南京國(guó)醫(yī)堂門(mén)診部藥房購(gòu)入), 每味藥200 g打粉,過(guò)100目篩混勻, 室溫浸于10倍量 95%乙醇中24 h, 收集浸出液, 重復(fù)2次。浸出液過(guò)濾后, 以55℃條件下減壓濃縮,收集濃縮后浸膏48.4 g。MPTP購(gòu)于Sigma公司。

1.2 動(dòng)物來(lái)源 清潔級(jí)健康成年雄性Balb/c小鼠32只,體質(zhì)量18～24 g, 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供, 動(dòng)物合格證號(hào)：2007000581303。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物房室溫25℃, 濕度45%, 明暗交替時(shí)間為12 h, 動(dòng)物可自由飲食進(jìn)水。

1.3 儀器 強(qiáng)迫游泳視頻分析系統(tǒng)(上海吉量軟件公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(河南鞏義予華儀器設(shè)備有限公司)。

2 方法及結(jié)果

2.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 帕金森病抑郁小鼠模型的建立 MPTP模型是經(jīng)典的小鼠PD模型。MPTP模型誘導(dǎo)小鼠DA神經(jīng)元丟失, 運(yùn)動(dòng)障礙的同時(shí), 可誘導(dǎo)66.7% C57/b6小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為, 表現(xiàn)為懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng), 糖水偏好減少［7］。本實(shí)驗(yàn)中, 腹腔注射MPTP (30 mg/kg×5 d) 制備帕金森病亞急性模型, 等量生理鹽水腹腔注射作為對(duì)照, 每組10只, 末次給藥后7 d觀察小鼠神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo), 從中篩選出PDD小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 越鞠丸對(duì)帕金森病抑郁模型小鼠自主活動(dòng)的影響 開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OPT)是用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法。將動(dòng)物放入箱內(nèi)(40 cm×40 cm ×35 cm)底面中心, 同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)。記錄在5 min內(nèi)的總活動(dòng)路程和在中央?yún)^(qū)域的活動(dòng)時(shí)間, 行為分析采用ANY-maze軟件。爬桿實(shí)驗(yàn)(The pole test)是評(píng)價(jià)帕金森病模型小鼠運(yùn)動(dòng)功能常用方法之一, 在長(zhǎng)50 cm、直徑1 cm的垂直木桿頂端放一木塞, 將小鼠放在木塞上, 記錄小鼠開(kāi)始自動(dòng)向下爬行的時(shí)間以及爬桿總時(shí)間。結(jié)果顯示：開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中, MPTP造模以及越鞠丸11 g/kg單次給藥后, 小鼠活動(dòng)總路程以及在中央?yún)^(qū)停留的時(shí)間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而爬桿實(shí)驗(yàn)中, MPTP造模后, 小鼠開(kāi)始向下爬行時(shí)間以及爬桿總時(shí)間均延長(zhǎng)(P＜0.05或0.01), 越鞠丸單次給藥對(duì)其無(wú)顯著影響(P＞0.05)。見(jiàn)圖1。結(jié)果表明：越鞠丸對(duì)帕金森病抑郁模型小鼠自主活動(dòng)及運(yùn)動(dòng)功能無(wú)顯著影響。

圖1 越鞠丸對(duì)帕金森病抑郁模型小鼠開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和爬桿實(shí)驗(yàn)中活動(dòng)的影響

2.4 越鞠丸改善帕金森病抑郁模型小鼠抑郁樣行為 懸尾實(shí)驗(yàn)(TST)用于反映動(dòng)物的行為絕望。在距尾尖1 cm的部位用膠帶將小鼠倒掛于橫置的鐵桿(直徑約1 cm)上, 小鼠頭部距離地面高度約30 cm。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST)用于反映動(dòng)物的行為絕望。實(shí)驗(yàn)前小鼠訓(xùn)練游泳15 min, 24 h后測(cè)試。

將小鼠放入水深15 cm的玻璃缸內(nèi), 水溫25℃。兩者均應(yīng)用DepressionScan記錄6 min內(nèi)小鼠的運(yùn)動(dòng)狀態(tài), 測(cè)量后4 min內(nèi)小鼠軀體及四肢不動(dòng)的時(shí)間。糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)(SPT)用于反映抑郁癥動(dòng)物快感缺失癥狀。將分別裝有蒸餾水和1%蔗糖水溶液的水瓶放于鼠籠上。記錄10 h內(nèi)小鼠攝入蒸餾水及糖水的量, 計(jì)算糖水偏愛(ài)率(糖水?dāng)z入量與總攝水量的比值)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比, MPTP模型組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間無(wú)明顯變化(P＞0.05), 懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P＜0.05), 糖水偏愛(ài)降低(P＜0.05)；越鞠丸單次給藥后, 對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間無(wú)影響(P＞0.05), 顯著降低懸尾不動(dòng)時(shí)間(P＜0.05), 并且增加小鼠糖水?dāng)z入量(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

結(jié)果表明：越鞠丸能夠改善帕金森病抑郁模型小鼠的抑郁樣行為。

圖2 越鞠丸對(duì)帕金森病抑郁模型小鼠強(qiáng)迫游泳、懸尾不動(dòng)時(shí)間和糖水偏愛(ài)的影響

2.5 越鞠丸增加帕金森病抑郁模型小鼠前額皮層突觸可塑性蛋白的表達(dá) PSD-95是谷氨酸能神經(jīng)元突觸后致密蛋白家族中的一種膜相關(guān)蛋白, 在突觸可塑性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。Synapsin-1是調(diào)節(jié)突觸結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵前膜囊泡蛋白。GluR-1是AMPA受體的一種亞型, 而突觸后膜上AMPA受體數(shù)量的變化可能是突觸可塑性的機(jī)制之一。在抑郁癥等諸多神經(jīng)精神疾病中, 突觸相關(guān)PSD-95, Synapsin-1和GluR-1等均會(huì)出現(xiàn)表達(dá)異常。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比, MPTP模型組小鼠前額皮層PSD-95, Synapsin-1和GluR-1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.01或0.05), 越鞠丸單次給藥后, 這些突觸可塑性相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05), 而越鞠丸對(duì)小鼠前額皮層PSD-95, Synapsin-1和GluR-1蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平無(wú)顯著影響(P＞0.05)。見(jiàn)圖3。結(jié)果表明：越鞠丸能夠增強(qiáng)帕金森病抑郁模型小鼠前額皮層的突觸可塑性。

圖3 越鞠丸對(duì)帕金森病抑郁模型小鼠前額皮層突觸蛋白表達(dá)的影響

3 討論

臨床研究表明PDD患者部分繼發(fā)于運(yùn)動(dòng)障礙或者藥物治療, 也有部分患者抑郁癥狀先于運(yùn)動(dòng)癥狀出現(xiàn), 并且PDD的病理過(guò)程與運(yùn)動(dòng)癥狀的病理進(jìn)程并不平行, 患者抑郁的嚴(yán)重程度與黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性, 皮層紋狀體環(huán)路功能障礙相關(guān)。說(shuō)明 PDD 的發(fā)生有其神經(jīng)生化及病理基礎(chǔ)［8］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明, 處于抑郁狀態(tài)時(shí), mPFC區(qū)萎縮, 神經(jīng)元樹(shù)突棘減少, 突觸可塑性降低［9］。抗抑郁藥能夠通過(guò)增加mPFC腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)釋放, 激活蛋白激酶B和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路, 進(jìn)而激活下游mTOR信號(hào)通路, 促進(jìn)突觸發(fā)生, 增強(qiáng)突觸可塑性功能, 發(fā)揮抗抑郁作用［10］。

本研究中, 首次發(fā)現(xiàn)：①越鞠丸對(duì)帕金森病抑郁模型(經(jīng)典MPTP亞急性模型)小鼠自主活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)功能無(wú)明顯改善作用；②越鞠丸顯著改善帕金森病抑郁模型小鼠的抑郁樣行為；③越鞠丸顯著上調(diào)帕金森病抑郁模型小鼠前額皮層突觸可塑性相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。因此推測(cè)越鞠丸治療帕金森病抑郁的作用機(jī)制可能是通過(guò)增加前額皮層突觸可塑性蛋白的含量。并且, 作者前期研究發(fā)現(xiàn)越鞠丸通過(guò)下調(diào)NMDA受體NR1以及增強(qiáng)Akt/mTOR信號(hào)通路改善CUMS(慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型)小鼠的抑郁樣行為, 發(fā)揮抗抑郁的作用。

帕金森病抑郁近年來(lái)愈發(fā)引起臨床關(guān)注, 越鞠丸功用行氣解郁, 臨床常用于郁證的治療。本研究在前期研究基礎(chǔ)上,深化了對(duì)PDD病理機(jī)制的認(rèn)識(shí), 可能與前額皮層突觸可塑性降低相關(guān), 并進(jìn)一步拓寬了越鞠丸的應(yīng)用范圍, 為臨床應(yīng)用越鞠丸治療帕金森病抑郁提供了有力證據(jù)。

［1］ Shen CC, Tsai SJ, Perng CL, et al.Risk of Parkinson disease after depression: a nationwide population-based study.Neurology, 2013, 81(17):1538-1544.

［2］ Pachana NA, Egan SJ, Laidlaw K, et al.Clinical issues in the treatment of anxiety and depression in older adults with Parkinson's disease.Movement Disorders Official Journal of the Movement Disorder Society, 2013, 28(14):1930-1934.

［3］ Bomasanglayno E, Fadlon I, Murray AN, et al.Antidepressive treatments for Parkinson's disease: A systematic review and metaanalysis.Parkinsonism & Related Disorders, 2015, 21(8):833.

［4］ 孫占衛(wèi).越鞠丸治療中風(fēng)后抑郁隨機(jī)平行對(duì)照研究.實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志, 2014(2):42-44.

［5］ 王瑩, 李仲平, 王陶冶, 等.越鞠升降湯治療老年抑郁癥36例臨床觀察.新中醫(yī), 2012, 44(6):50-51.

［6］ 陳明鑒, 姚冉.越鞠丸聯(lián)合度洛西汀治療伴有軀體焦慮抑郁癥的臨床觀察.神經(jīng)損傷與功能重建, 2015, 10(2):175-176.

［7］ Zhang X, Song D, Gu L, et al.Decrease of gene expression of astrocytic 5-HT2 Breceptors parallels development of depressive phenotype in a mouse model of Parkinson’s disease.Frontiers in Cellular Neuroscience, 2015, (9):388.

［8］ Leentjens AF.Parkinson disease: Depression-risk factor or early symptom in Parkinson disease? Nature Reviews Neurology, 2015, 11(8):432-433.

［9］ Ferenczi EA, Zalocusky KA, Liston C, et al.Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior.Science, 2016, 351(6268):aac9698.

［10］ Tang J, Xue W, Xia B, et al.Involvement of normalized NMDA receptor and mTOR-related signaling in rapid antidepressant effects of Yueju and ketamine on chronically stressed mice.Scientific Reports, 2015, 5(5):13573.

Research of anti-depression effect by Yueju pills for mice in Parkinson’s disease depression model

TANG Juan-juan, WANG Qi-sheng, GAO Zhao, et al.Department of Physiology, School of Medicine and Life Sciences of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

ObjectiveTo research anti-depression effect by Yueju pills for mice in Parkinson’s disease depression (PDD) model, and its mechanism of action.MethodsA total of 32 clean and healthy male adult Balb/ c mice were randomly divided into control group and MPTP (1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine) subacute model group.Mice with depression manifestation in the model group were given single lavage by 11 g/ kg of Yueju pills.Anti-depression effect by Yueju pills for PDD mice was observed by forced swimming test, tail suspension test and sugar water preference test.Influence by Yueju pills on prefrontal cortex synaptic protein PSD-95, Synapsin-1 and GluR-1 levels in PDD mice was researched.ResultsAfter MPTP modeling and single administration by 11 g/kg of Yueju pills in open field test, there was no statistically significant difference of total distance in activity and duration of stay at central area (P＞0.05).After MPTP modeling in pole-climbing test, climbing down time and total pole-climbing time were all prolonged (P＜0.05 or 0.01), while single administration of Yueju pills showed no influence (P＞0.05).Comparing with the control group, MPTP model group had no obvious change in immobility time during forced swimming test (P＞0.05), obviously prolonged immobility time during tail suspension test (P＜0.05) and lowered sugar water preference (P＜0.05).Single administration of Yueju pills showed no influence on immobility time during forced swimming test (P＞0.05), but it remarkably prolonged immobility time during tail suspension test (P＜0.05), and increased sugar water intake volume (P＜0.05).Comparing with the control group, MPTP model group had obviously lowered prefrontal cortex PSD-95, Synapsin-1 and GluR-1 protein expression (P＜0.01 or 0.05).Single administration of Yueju pills led to obviously increased synaptic plasticity-related protein (P＜0.05), while it had no remarkable influence on prefrontal cortex PSD-95, Synapsin-1 and GluR-1 protein expression (P＞0.05).ConclusionYueju pills shows excellent anti-depression effect for micein Parkinson’s disease depression model.Its mechanism may have correlation with increased synaptic plasticityrelated protein as prefrontal cortex PSD-95, Synapsin-1 and GluR-1 protein expression in PDD mice.

Parkinson’s disease depression; Yueju pills; Synaptic plasticity

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.07.099

2017-02-24］

江蘇省自然科學(xué)青年基金(項(xiàng)目編號(hào)：BK20161044)；國(guó)家自然科學(xué)青年基金(項(xiàng)目編號(hào)：81603089)

210023 南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)院生理學(xué)系

唐娟娟

方法清潔級(jí)健康成年雄性Balb/c小鼠32只, 隨機(jī)分為對(duì)照組和MPTP(1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶)亞急性模型組, 模型組中篩選出抑郁樣表型小鼠, 單次灌胃給予越鞠丸11 g/kg, 通過(guò)強(qiáng)迫游泳, 懸尾以及糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)觀察越鞠丸對(duì)PDD小鼠的抗抑郁治療作用, 并考察越鞠丸對(duì)PDD小鼠前額皮層突觸蛋白PSD-95, Synapsin-1和GluR-1水平的影響。結(jié)果開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中, MPTP造模以及越鞠丸11 g/kg單次給藥后, 小鼠活動(dòng)總路程以及在中央?yún)^(qū)停留的時(shí)間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而爬桿實(shí)驗(yàn)中, MPTP造模后, 小鼠開(kāi)始向下爬行時(shí)間以及爬桿總時(shí)間均延長(zhǎng)(P＜0.05或0.01), 越鞠丸單次給藥對(duì)其無(wú)顯著影響(P＞0.05)。與對(duì)照組相比, MPTP模型組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間無(wú)明顯變化(P＞0.05),懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P＜0.05), 糖水偏愛(ài)降低(P＜0.05)；越鞠丸單次給藥后, 對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間無(wú)影響(P＞0.05), 顯著降低懸尾不動(dòng)時(shí)間(P＜0.05), 并且增加小鼠糖水?dāng)z入量(P＜0.05)。與對(duì)照組相比, MPTP模型組小鼠前額皮層PSD-95, Synapsin-1和GluR-1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.01或0.05), 越鞠丸單次給藥后, 這些突觸可塑性相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05), 而越鞠丸對(duì)小鼠前額皮層PSD-95, Synapsin-1和GluR-1蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平無(wú)顯著影響(P＞0.05)。結(jié)論越鞠丸對(duì)帕金森病抑郁模型小鼠具有顯著抗抑郁樣作用, 其機(jī)制可能與越鞠丸增加PDD小鼠前額皮層突觸可塑性相關(guān)蛋白PSD-95, Synapsin-1和GluR-1的表達(dá)有關(guān)。