李明，姚文平，席娟

（1.南京中醫(yī)藥大學連云港附屬醫(yī)院，連云港市中醫(yī)院，江蘇連云港222000；2.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濟寧272029）

去甲腎上腺素誘導人巨噬細胞白細胞介素6表達及其機制

李明1，姚文平1，席娟2

（1.南京中醫(yī)藥大學連云港附屬醫(yī)院，連云港市中醫(yī)院，江蘇連云港222000；2.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濟寧272029）

目的觀察去甲腎上腺素（NE）預處理人單核/巨噬細胞U937細胞白細胞介素6（IL-6）的表達，探討其致動脈粥樣硬化可能的作用機制。方法NE 0.01～10 μmol·L-1與U937細胞共培養(yǎng)24 h后，RT-PCR法檢測細胞IL-6 mRNA水平；共培養(yǎng)6，9，12，24和48 h后，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液上清中IL-6蛋白水平；共培養(yǎng)24 h后，熒光探針法檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）的生成。預先加入ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）、NADPH氧化酶抑制劑二亞苯基碘（DPI）或線粒體復合物Ⅱ抑制劑噻吩甲酰三氟丙酮（TIFA）孵育1 h后，再加入NE 0.01～10 μmol·L-1繼續(xù)培養(yǎng)24 h，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液上清中IL-6蛋白水平。結(jié)果巨噬細胞IL-6 mRNA表達和蛋白水平隨NE 0.01～10 μmol·L-1濃度增加和孵育時間延長而升高，NE 1.0 μmol·L-1刺激24 h，IL-6 mRNA表達和蛋白水平分別為細胞對照組的2.62和4.47倍（P＜0.01）；NE 0.01,0.1,1.0和10.0 μmol·L-1組ROS的生成分別為對照組的1.87，2.56，2.91和5.36倍（P＜0.01）。NAC 10 mmol·L-1和DPI 10 μmol·L-1均一定程度地抑制IL-6蛋白的表達（P＜0.01），而TIFA無影響。結(jié)論NE可誘導人巨噬細胞IL-6的表達，并可能通過NADPH氧化酶介導的ROS通路而促進炎癥反應，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。

去甲腎上腺素；巨噬細胞；白細胞介素6；活性氧

全身炎癥或血管壁的局部炎癥與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）有密切聯(lián)系。各種炎癥特征因子在單核/巨噬細胞中被激活，如腫瘤壞死因子α、白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶9和C反應蛋白等［1-3］。然而，在這些炎癥因子中，IL-6是心血管疾病發(fā)病的高危因子，它不僅是一個炎癥標志物，而且直接參與了AS的形成和發(fā)展。據(jù)報道，內(nèi)源性IL-6參與了生長因子誘導的成纖維細胞、血管平滑肌細胞和腎小球膜細胞增殖［4-5］。最近體外研究也顯示，IL-6通過增加黏附分子、細胞因子、炎癥趨化因子和增強因子直接參與致炎和致AS的作用［6］。去甲腎上腺素（norepineph?rine，NE）通過激活腎上腺素受體，作用于血管平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞等效應細胞。NE與血管細胞增殖和組織重塑所致的AS、高血壓和心衰有關(guān)。NE作為一個潛在的致炎因子，能夠誘導腫瘤壞死因子α、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和Toll樣受體4的表達［7-9］。體外研究結(jié)果表明，NE通過刺激絲裂原活化蛋白激酶磷酸化和NADPH介導的ROS合成介導細胞的增殖［9］。

盡管大量研究表明，NE和IL-6參與了心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展；并且筆者亦研究發(fā)現(xiàn)，NE能夠通過ROS的介導誘導基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達［10］，但未從分子水平上探討NE對IL-6表達的誘導作用。因此，本研究探討NE對人單核/巨噬細胞U937表達IL-6的影響，以及此過程與ROS等信號通路的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

人單核/巨噬細胞U937由美國Cascade Bio?logics公司提供；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國HyClone公司；NE、NADPH氧化酶抑制劑二亞苯基碘（diphenyleneiodonium，DPI）、ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）和線粒體復合物Ⅱ抑制劑噻吩甲酰三氟丙酮（thenoyltrifluoroacetone，TIFA）均購自美國Sigma公司；PCR引物由中國北京奧科生物技術(shù)有限責任公司合成；PerfectshotTMTaq酶購自大連寶生物工程有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒購自美國In?vitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA標準和蛋白標準均購自德國的Fermentas公司；蛋白酶抑制劑（cocktail）購自瑞士Roche公司；RIPA裂解液由北京百泰克生物技術(shù)有限公司提供；ELISA和ROS檢測試劑盒來自于江蘇碧云天生物技術(shù)公司。熒光顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品；垂直電泳-轉(zhuǎn)膜裝置及凝膠掃描成像系統(tǒng)（Gel DOC2000）和梯度PCR儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)

用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)U937細胞，在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24～48 h后，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后開始實驗。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測細胞IL-6 mRNA水平

以NE 0.01～10 μmol·L-1分別與U937細胞培養(yǎng)24 h后收集細胞，按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，濃度及純度測定使用紫外分光光度計進行，取總RNA 2 μg逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL進行PCR循環(huán)。IL-6引物序列：上游5’-AT?GAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3’，下游5’-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3’，擴增產(chǎn)物長度為629 bp。內(nèi)參GAPDH引物序列：上游5’-GGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游5’-GGAA?GATGGTGATGGGATT-3’，擴增產(chǎn)物長度為205 bp。取PCR產(chǎn)物80 V電泳30 min，凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描攝圖，并分析IL-6和GAPDH條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA）值，以IAIL-6/IAGAPDH比值表示IL-6 mRNA相對表達水平。

1.4 ELISA測定細胞上清液IL-6蛋白含量

以NE 0.01～10 μmol·L-1分別與U937細胞培養(yǎng)0，6，9，12，24和48 h；或預先加入抗氧化劑NAC（10 mmol·L-1）、NADPH氧化酶抑制劑DPI（10 μmol·L-1）、線粒體復合物Ⅱ抑制劑TIFA（10 μmol·L-1）孵育細胞1 h，然后再與不同濃度的NE共孵育24 h。收集U937細胞離心后吸取上清液。依照ELISA試劑盒說明書測定IL-6蛋白水平，在450 nm波長下用酶標儀讀取各孔吸光度（A450nm）值，根據(jù)標準曲線計算IL-6蛋白濃度（ng·L-1）。

1.5 熒光探針法檢測細胞ROS的生成

以NE 0.01～10 μmol·L-1分別與U937細胞培養(yǎng)24 h，離心收集細胞，以H2DCF-DA 10 μmol·L-1吹散細胞，在6孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)20 min，于無血清培養(yǎng)基中112×g離心洗滌3次，每次5 min，以洗去未進入細胞內(nèi)的H2DCF-DA，然后在488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長條件下，熒光顯微鏡觀察并拍照。每組選擇5個不同視野，每個視野包含20～35個細胞。用Image-Pro Plus軟件分析細胞熒光強度。ROS的生成用細胞熒光強度總和表示。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 NE對U937細胞IL-6 mRNA表達的影響

NE 0.1～10.0 μmol·L-1與U937細胞共孵育24 h，IL-6 mRNA水平與細胞對照組比較明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；其中NE 1.0 μmol·L-1時升高最明顯，IL-6 mRNA水平為細胞對照組的2.62倍（圖1）。

Fig.1 Effect of norepinephrine（NE）on interleukine-6（IL-6）mRNA level in U937 macrophages identified by RT-PCR.U937 cells were incubated with NE for 24 h.IA：integrated absorbance.B was the semi-quantitative result of A.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

2.2 NE對U937細胞IL-6蛋白表達的影響

如圖2A所示，NE 0.01～10 μmol·L-1刺激U937巨噬細胞24 h，IL-6蛋白表達增高（P＜0.01），并隨著NE濃度的增高有增加趨勢。如圖2B所示，NE 0.1 μmol·L-1刺激U937巨噬細胞6 h時，IL-6蛋白水平與細胞對照組比較明顯增加（P＜0.05）；與NE 1.0 μmol·L-1共孵育0～48 h，U937巨噬細胞IL-6蛋白表達隨時間增加而升高。

Fig.2 Effect of NE on IL-6 protein level in U937 macrophages assayed by ELISA.A：U937 cells were incubated with NE for 24 h；B：U937 cells were incubated with NE for 0-48 h.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

2.3 NE對U937細胞ROS水平的影響

如圖3所示，熒光顯微鏡觀察顯示，熒光探針H2DCF-DA標記的U937細胞對照組僅有少量ROS生成。與細胞對照組相比，NE 0.01～10 μmol·L-1顯著增加U937細胞ROS水平（P＜0.01），并隨濃度的增加有升高趨勢。

2.4 預先加入NAC、DPI和TIFA對NE誘導U937細胞IL-6蛋白表達的影響

如圖4所示，與細胞對照組相比，NE 0.01～10.0 μmol·L-1誘導U937細胞IL-6蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；預先加入抗氧化劑NAC 10 mmol·L-1，NE 0.01～10.0 μmol·L-1對IL-6蛋白表達的誘導作用明顯降低（P＜0.01）。預先加入NADPH氧化酶抑制劑DPI 0.01～1.0 μmol·L-1，也可抑制NE誘導的IL-6蛋白表達（P＜0.01）。線粒體復合物Ⅱ抑制劑TIFA 10 μmol·L-1對NE誘導的IL-6蛋白表達無明顯影響。上述結(jié)果表明，可能是ROS信號通路介導了NE誘導U937細胞IL-6蛋白的表達。

Fig.3 Effect of NE on reactive oxygen species（ROS）level in U937 macrophages observed under fluores?cence microscope.U937 cells were incubated with NE for 24 h，then incubated with H2DCF-DA 10 μmol·L-1for 30 min.FI：fluorescence intensity.B was the semi-quantitative result of A.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

Fig.4 Effect of different inhibitors on NE-stimulated IL-6 protein expression in U937 macrophages assayed by ELISA.U937 cells were stimulated with NE for 24 h after pretreatment with antioxidant N-acetylcysteine（NAC）10 mmol·L-1，NADPH oxidase inhibitor diphenyleneiodonium（DPI）10 μmol·L-1or complexⅡinhibitor thenoyltrifluoroacetone（TIFA）10 μmol·L-1for 1 h.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group；##P＜0.01，compared with corresponding NE group.

3 討論

IL-6作為重要的炎癥因子在AS中扮演重要角色，平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞均表達該炎癥介質(zhì)。其次，IL-6對淋巴細胞的激活有明顯的放大作用。有數(shù)據(jù)顯示，NE能誘導心肌成纖維細胞產(chǎn)生IL-6［11］。IL-6又是導致平滑肌細胞增殖和單核細胞趨化蛋白1釋放的重要因素［12］。AS斑塊中單核細胞趨化蛋白1高表達是內(nèi)膜單核/巨噬細胞募集和泡沫細胞形成的主因素，因此阻斷NE-IL-6信號途徑，將有利于阻止平滑肌細胞增殖，一定程度上延緩AS的進程。本研究發(fā)現(xiàn)，NE能刺激巨噬細胞產(chǎn)生IL-6，說明NE可能通過刺激IL-6的產(chǎn)生而誘導U937巨噬細胞的炎癥反應。

ROS是生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性含氧化合物的總稱，在微量條件下能調(diào)節(jié)血管功能和結(jié)構(gòu)狀態(tài)，過量則可引起一些細胞大分子的氧化損傷，在血管生物學中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［10］。本研究結(jié)果顯示，NE能誘導巨噬細胞產(chǎn)生ROS，隨NE濃度的增加ROS的產(chǎn)生逐漸增多。而低濃度NE誘導的IL-6蛋白表達幾乎被抗氧化劑NAC完全阻斷，說明NE誘導巨噬細胞IL-6表達可能是通過ROS信號通路介導。此外，NE誘導的IL-6蛋白表達在一定程度上也被NADPH氧化酶抑制劑DPI抑制。表明此過程可能涉及到NADPH氧化酶途徑，此結(jié)果與文獻［13］報道一致。上述結(jié)果與我們已報道的血管緊張素Ⅱ誘導單核/巨噬細胞表達C反應蛋白是通過ROS介導這一機制相一致，不同的是C反應蛋白的表達并未涉及到NADPH氧化酶途徑［2］。這一差異不僅是由于表達的細胞因子不同，也提示了IL-6及ROS表達通路的特異性。

眾所周知，巨噬細胞膜表面分布著較高密度的NE受體（α和β受體），NE可通過激活NE受體發(fā)揮其在AS中的致炎作用［14］。有文獻報道，NE激活單核/巨噬細胞Toll樣受體4的表達也是通過NE受體的介導［15］。

綜上，根據(jù)本研究結(jié)果可推測，NE可能通過NE受體-ROS信號通路誘導巨噬細胞表達IL-6而產(chǎn)生致AS的炎癥效應，為更深入地認識NE在致AS和致炎中的作用機制提供了重要的實驗依據(jù)。IL-6是否還與其他炎癥通路相關(guān)、是否存在通路特異性等仍需進一步探討。

［1］Yen JH，Yang DJ，Chen MC，Hsieh YF，Sun YS， Tsay GJ.Glycine tomentella Hayata inhibits IL-1β and IL-6 production，inhibits MMP-9 activity，and enhances RAW264.7 macrophage clearance of apoptotic cells［J］.J Biomed Sci，2010，17（1）：83.

［2］Li M，Liu J，Han C，Wang B，Pang X，Mao J. AngiotensinⅡinduces the expression of C-reactive protein via MAPK-dependent signal pathway in U937 macrophages［J］.Cell Physiol Biochem，2011，27（1）：63-70.

［3］Ge H，Zhang JF，Guo BS，He B，Wang BY，Wang CQ.Resveratrol inhibits expression of EMMPRIN from macrophages［J］.Acta Pharm Sin（藥學學報），2006，41（7）：625-630.

［4］Roth M，Nauck M，Tamm M，Perruchoud AP，Ziesche R，Block LH.Intracellular interleukin 6 mediates platelet-derived growth factor-induced prolif?eration of nontransformed cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（5）：1312-1316.

［5］Mihara M，Moriya Y，Kishimoto T，Ohsugi Y.Inter?leukin-6（IL-6）induces the proliferation of synovial fibroblastic cells in the presence of soluble IL-6 receptor［J］.Br J Rheumatol，1995，34（4）：321-325.

［6］Peng N，Liu JT，Guo F，Li R.Epigallocatechin-3-gallate inhibits interleukin-6-and angiotensinⅡ-induced production of C-reactive protein in vascular smooth muscle cells［J］.Life Sci，2010，86（11-12）：410-415.

［7］Fu YC，Chi CS，Yin SC，Hwang B，Chiu YT，Hsu SL.Norepinephrine induces apoptosis in neo?natal rat cardiomyocytes through a reactive oxygen species-TNF alpha-caspase signaling pathway［J］. Cardiovasc Res，2004，62（3）：558-567.

［8］Yang EV，Sood AK，Chen M，Li Y，Eubank TD，Marsh CB，et al.Norepinephrine up-regulates the expression of vascular endothelial growth factor，matrix metalloproteinase（MMP）-2，and MMP-9 in nasopharyngeal carcinoma tumor cells［J］.Cancer Res，2006，66（21）：10357-10364.

［9］Fu YC，Yin SC，Chi CS，Hwang B，Hsu SL. Norepinephrine induces apoptosis in neonatal rat endothelial cells via a ROS-dependent JNK activation pathway［J］.Apoptosis，2006，11（11）：2053-2063.

［10］Li M，Sun SB，Zhou Y，Pang XM，Xi J，Jin TY，et al.Norepinephrine induces expression of matrix metalloproteinase-9 in human macrophages and its mechanisms［J］.J Third Mil Med Univ（第三軍醫(yī)大學學報），2012，34（17）：1758-1761.

［11］Leicht M，Briest W，Zimmer HG.Regulation of norepinephrine-induced proliferation in cardiacfibroblasts by interleukin-6 and p42/p44 mitogen activated protein kinase［J］.Mol Cell Biochem，2003，243（1-2）：65-72.

［12］Ji YY，Wang ZD，Liu JT，Liu N.AngiotensinⅡinduces Toll-like receptor 4 expression and myelo?peroxidase activity in RAW264.7 cells［J］.Chin J Cell Mol Immunol（細胞與分子免疫學雜志），2008，24（11）：1037-1039，1043.

［13］Carluccio MA，Scoditti E，Massaro M，et al.The antioxidant hydroxytyrosol suppresses MMP-9 ac?tivity and expression in human monocytes through PKC alpha/beta 1 and NADPH oxidase inhibition-a mechanism for plaque stabilization by an olive oil component of mediterranean diets［J］.Journal of Nutrigenet Nutrigenomics，2010，3（2/3）：85-86.

［14］Li M，Yao W，Li S，Xi J.Norepinephrine induces the expression of interleukin-6 via β-adrenoreceptor-NAD（P）H oxidase system-NF-κB dependent signal pathway in U937 macrophages［J］.Biochem Biophys Res Commun，2015，460（4）：1029-1034.

［15］Chen J，Huang L，Wu Q.Receptor pathways involved in norepinephrine-induced intracellular ROS production in cardiac myocytes［J］.J Third Mil Med Univ（第三軍醫(yī)大學學報），2004，26（8）：694-696.

Norepinephrine induced expression of interleukin-6 in human macrophages and mechanisms

LI Ming1,YAO Wen-ping1,XI Juan2
(1.Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine,Lianyungang Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lianyungang 222000,China;2.Affiliated Hospital of Jining Medical College,Jining 272029,China)

OBJECTIVETo investigate the effect of norepinephrine(NE)on expression of interleu?kin-6(IL-6)in human macrophages and explore its pro-inflammatory and pro-atherosclerotic mecha?nisms.METHODSMurine U937 macrophages were cultured and stimulated with 0.01-10 μmol·L-1of NE for 6,9,12,24 and 48 h.The IL-6 mRNA level of 24 h was analyzed by RT-PCR,and IL-6 protein expression in the supernatant at 0,6,9,12,24 and 48 h was detected by ELISA.After 24 h,intracellular reactive oxygen species(ROS)generation was observed by DCF fluorescence.The cells were pretreated with antioxidant N-acetylcysteine(NAC),complexⅡinhibitor thenoyltrifluoroacetone(TIFA)and NADPH oxidase inhibitor diphenyleneiodonium(DPI)for 1 h,and stimulated with different concentrations of NE for 24 h,before the level of IL-6 protein was detected by ELISA.RESULTSThe expression of IL-6 mRNA and protein increased with the concentration NE 0.01-10 μmol·L-1and incubation time.IL-6 mRNA and protein levels in macrophages were 2.62 and 4.47-fold those in cell control group when treated with NE 1.0 μmol·L-1for 24 h.Meanwhile,as the concentration of NE increased,the generation of ROS was 1.87,2.56,2.91 and 5.36-fold that of cell control group(P＜0.01).NAC 10 mmol·L-1and DPI 10 μmol·L-1significantly antagonized the effect of NE on IL-6 expression,but TIFA had no effect.CONCLUSIONNE upregulates IL-6 expression,which may contribute to the formation and develop?ment of atherosclerosis via ROS mediated by NADPH oxidase in macrophages.

norepinephrine;macrophages;interleukin-6;reactive oxygen species

LI Ming,E-mail:liminglm1985@163.com，Tel:18061393860

R972

：A

：1000-3002-（2017）03-0250-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.03.008

Foundation item:The project supported by Pharmaceuticals Foundation of Osaikang Hospital of Jiangsu Province (201517);Science and Technology Development Plan of Lianyungang City(ZD1508);and Jiangsu Province Youth Medi?cal Talent Fund(QNRC2016507)

2016-03-25接受日期：2017-02-27）

（本文編輯：齊春會）

江蘇省藥學會-奧賽康醫(yī)院藥學基金（201517）；連云港市科技發(fā)展計劃（ZD1508）；江蘇省青年醫(yī)學人才（QN?RC2016507）

李明，碩士，主管藥師，主要從事心腦血管藥理學研究。

李明，E-mail：liminglm1985@163.com，Tel：18061393860