摘要：基于抗萊克多巴胺（SAL）的單克隆抗體，初步建立了檢測SAL的高靈敏度時間分辨直接競爭免疫分析法（CD-TRFIA）。采用辛酸-硫酸銨純化抗SAL雜交瘤細(xì)胞株腹水單克隆抗體，用稀土離子Sm3+偶聯(lián)物進(jìn)行標(biāo)記，制備釤標(biāo)抗體；通過合成SAL-SUC半抗原并與卵清蛋白偶聯(lián)獲得SAL-OVA包被抗原；采用直接競爭的方式，游離SAL和固相SAL-OVA包被原共同競爭有限的釤標(biāo)SAL單抗，初步建立SAL時間分辨免疫分析方法。研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化的TRFIA半抑制量IC50為1.6 ng/mL，檢測范圍為0.39～12.77 ng/mL，最低檢測限為0.136 ng/mL。

關(guān)鍵詞：萊克多巴胺；釤標(biāo)單克隆抗體；時間分辨熒光免疫分析

中圖分類號： TS207文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）03-0036-05

收稿日期：2016-05-14

基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目（編號：NJZC13407）；內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院課題項目（編號：NSZY1113）。

作者簡介：李貞（1980—），男，碩士，講師，主要從事食品加工與營養(yǎng)檢測的教學(xué)與研究。E-mail：563983393@163.com。

時間分辨熒光免疫分析（time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）是20世紀(jì)80年代初由Pettersson等創(chuàng)立的一種非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)，與傳統(tǒng)的熒光素標(biāo)記不同，它以釤（Sm）、鋱（Tb）、釤（Sm）、鈮（Nd）等三價稀土離子鑭系元素為標(biāo)記物，代替熒光物質(zhì)、同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標(biāo)記抗原、抗體、核酸探針等。這些離子可產(chǎn)生熒光，其熒光不僅強(qiáng)度高，且熒光衰變時間長，利用延緩測量時間，當(dāng)待測樣品中短壽命的自然熒光衰變后再用TRFIA技術(shù)檢測，可消除自然熒光的干擾。

TRFIA技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用研究已逐漸開展[1-5]，在黃曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、醋酸甲羥孕酮、氯霉素等分析中相繼建立起來。關(guān)于β-腎上腺素受體興奮劑的TRFIA研究已有報道，其中萊克多巴胺檢測的TRFIA方法研究表明，其檢測限低（0.1 μg/kg），在多種基質(zhì)中的準(zhǔn)確度高、變異系數(shù)低，與傳統(tǒng)的ELISA方法比較其相關(guān)性好、靈敏度高，表明TRFIA方法用于檢測β-興奮劑類藥物具有廣闊前景[2-3]。萊克多巴胺（ractopamine，SAL）是“瘦肉精”克倫特羅的替代品，作為動物生長促長劑在畜牧生長中濫用的現(xiàn)象非常嚴(yán)重，是食品安全檢測的重點監(jiān)控對象。目前，萊克多巴胺檢測以儀器分析方法為主，研究開發(fā)出成本低廉、操作簡便、檢測迅速、靈敏度高的免疫分析檢測技術(shù)顯得尤為重要。ELISA作為一種傳統(tǒng)的免疫分析形式，在萊克多巴胺檢測中已有應(yīng)用報道，但檢測靈敏度有待提高。時間分辨免疫分析作為一種超靈敏的痕量分析手段，在萊克多巴胺檢測中未見報道。本研究以萊克多巴胺單克隆抗體的制備為基礎(chǔ)，建立TRFIA免疫學(xué)檢測方法，以開發(fā)能夠檢測萊克多巴胺的時間分辨熒光免疫試劑盒。

1材料與方法

1.1儀器設(shè)備

U-3010型紫外可見分光光度計（日本Hitachi公司），Wallac VITOR31420型多標(biāo)記分析儀（美國Thermo公司），Wellwash MK2型洗板機(jī)（美國Thermo公司），6K15型冷凍離心機(jī)（Sartorius-Sigma公司），82-5型控溫磁力攪拌器（金壇市恒豐儀器廠），DK-8D型電熱恒溫水槽（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠），BCD-191W/H型可調(diào)數(shù)顯冰箱（Kelon公司），特制層析柱（1.5 cm×20 cm）（上海華美儀器設(shè)備有限公司），自動收集器（Bio-Rad公司），超低溫高速離心機(jī)（Sigma公司），恒溫振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司），微量可調(diào)移液槍（吉爾森公司），BP61S型電子天平（瑞士Sartorius公司），96孔微量反應(yīng)板（雷博公司）。

1.2試劑

萊克多巴胺（含量大于99%）、克倫特羅（含量大于98%）購自美國Dr. Ehrenstorfer公司，羊抗小鼠IgG抗體、牛血清蛋白（98.6%）購自Sigma公司，磷酸二氫鈉（分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（分析純）購自天津市化學(xué)試劑六廠，磷酸氫二鈉（分析純）購自汕頭市光華化學(xué)廠，鄰苯二甲酸氫鉀購自天津市大茂化學(xué)試劑廠，新鮮陰性豬尿樣由廣州市獸藥監(jiān)督所提供。

1.3試劑配制

包被緩沖液/標(biāo)記物緩沖液（pH值9.6、0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液）[4]：Na2CO3 0.375 g、NaHCO3 0.732 5 g，加蒸餾水定容至250 mL。洗滌緩沖液（pH值7.4 PBST）：KH2PO4 0.4 g、Na2HPO4·12H2O 5.8 g、NaCl 16 g、KCl 0.4 g、0.05% Tween-20 1 mL，加蒸餾水定容至2 000 mL。標(biāo)記物洗脫液（pH值7.6、1 mol/L Tris-HCl）：Tris-Base 12.12 g、NaCl 9 g，加去離子水定容至1 L，采用6 mol/L HCl將pH值調(diào)至7.6。標(biāo)記物稀釋液：Tris-Base 6.056 g、NaCl 9 g，加去離子水定容至1 L，采用6 mol/L HCl將pH值調(diào)至7.6，再加入BSA 2 g、Tween-20 0.3 mL，濾膜過濾除菌。[LM]

1.4試驗動物及細(xì)胞株

清潔級Balb/c純種雌性小鼠購自中山醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心?？谷R克多巴胺單克隆雜交瘤細(xì)胞株4E4由筆者所在實驗室保存。

1.5SAL包被抗原的合成

參照黃飚等的方法[6]進(jìn)行SAL包被抗原的合成。

1.6釤標(biāo)抗體的制備與純化

參照Shen等的方法[7]進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞株復(fù)蘇及腹水制備，參照Shen等、王永成等的方法[7-8]進(jìn)行辛酸-硫酸銨沉淀法分離純化抗體，參照王永成等的方法進(jìn)行Sm3+抗SAL單克隆抗體的制備[8]。

1.7Sm3+標(biāo)記抗體稀釋倍數(shù)與包被濃度估測

1.7.1固相抗原的制備

將SAL-OVA用包被緩沖液稀釋為10.00、5.00、2.50、1.25 μg/mL 4個包被濃度，96孔微孔板中每個包被濃度各包3列，每孔加100 μL，于4 ℃下放置過夜。棄去包被液，用洗滌緩沖液洗板2次，拍干。加120 μL封閉液封閉，于37 ℃下封閉3 h，棄去封閉液，置于37 ℃烘箱中烘干，于4 ℃下密封保存。

1.7.2直接SAL-TRFIA棋盤滴定

將Sm3+標(biāo)記抗體倍比稀釋為250、500、1 000、2 000、4 000、8 000倍液共6個濃度，固相抗原包被濃度分別為8、4、2、1 μg/mL。96孔酶標(biāo)板中，每行為1個抗體稀釋濃度，每列為1個包被濃度。加入 50 μL 抗體至預(yù)加50 μL抗體稀釋液的酶標(biāo)孔中，于37 ℃下振蕩反應(yīng)1 h，洗板6次，拍干；加增強(qiáng)液200 μL，振蕩反應(yīng) 10 min，采用Wallac VICTOR3 1420型多標(biāo)記分析儀測量其CPS值。

1.8時間分辨免疫分析方法的建立

1.8.1SAL標(biāo)準(zhǔn)液的配制

采用PBST稀釋液將純度為99%的SAL硫酸鹽配制成濃度為100 μg/mL的母液，稀釋至 1 μg/mL 作為貯備液，使用前配制成濃度梯度為0.000、0.256、0.640、1.600、4.000、20.000、100.000 ng/mL的SAL標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

1.8.2直接競爭SAL-TRFIA步驟

添加標(biāo)品與釤標(biāo)抗體各50 μL，每孔做1個重復(fù)，于37 ℃下振蕩反應(yīng)1 h，洗板6次，拍干，添加增強(qiáng)液200 μL，振蕩反應(yīng)10 min，采用Wallac VICTOR3 1420型多標(biāo)記分析儀測量其CPS值。

1.8.3最佳Sm3+標(biāo)記抗體稀釋度的確定

按“1.8.2”節(jié)估測的包被濃度進(jìn)行包板，將釤標(biāo)抗體進(jìn)行系列稀釋，稀釋倍數(shù)分別為350、400、450、500倍，測定各稀釋度熒光計數(shù)。以標(biāo)準(zhǔn)點（SAL濃度）為橫坐標(biāo)，以各稀釋度熒光計數(shù)（CPS）與最高濃度熒光計數(shù)（CPSmax）的比值為縱坐標(biāo)，測定熒光值并繪制曲線，確定最佳Sm3+標(biāo)記抗體稀釋度。

1.8.4最佳包被濃度的確定

取3條96孔微孔板反應(yīng)條，用包被液對SAL-OVA進(jìn)行一系列稀釋，濃度為1.50、1.25、1.00 μg/mL，進(jìn)行包被，按照棋盤滴定初步篩選出的濃度稀釋抗體，按照“1.7.2”節(jié)的步驟測定各稀釋度熒光計數(shù)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線靈敏度較高、曲線斜率較大的抗原濃度即為最適包被工作濃度。

1.8.5最佳競爭時間的確定

將工作濃度稀釋的釤標(biāo)抗體和SAL標(biāo)準(zhǔn)液加入確定包被濃度的SAL-OVA包被板中，于37 ℃下分別溫育30、60、90、120 min，其他步驟同“1.8.3”節(jié)，測定不同競爭時間下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8.6最佳反應(yīng)體系的確定

在包被好的板條中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL和釤標(biāo)抗體50 μL（體系1）、標(biāo)準(zhǔn)品100 μL和釤標(biāo)抗體50 μL（體系2）、標(biāo)準(zhǔn)品50 μL和釤標(biāo)抗體100 μL（體系3）、標(biāo)準(zhǔn)品100 μL和釤標(biāo)抗體100 μL（體系4），根據(jù)各反應(yīng)體系的最終反應(yīng)體積分別加入增強(qiáng)液100、150、200 μL，振蕩10 min，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定最佳反應(yīng)體系。

1.9SAL-TRFIA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

采用最佳模式的最佳條件操作，用Wallac VIVTOR3 1420型多標(biāo)記分析儀測定熒光值得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定其IC50與檢測的線性范圍。

1.10SAL-TRFIA方法的靈敏度、精密度和特異性

做SAL為零濃度的孔8個，以零劑量點計數(shù)率（CPS）均值減3倍標(biāo)準(zhǔn)差后的計數(shù)率在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的相應(yīng)濃度值為檢測的靈敏度。以標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的板內(nèi)誤差和板間誤差來表示方法的精密度。以系列濃度的SAL及萊克多巴胺、克倫特羅2種近似抗原分別做競爭抑制曲線，計算各自的結(jié)合率，求出各自在IC50時的濃度交叉反應(yīng)率。

2結(jié)果與分析

2.1SAL-OVA包被抗原的制備

通過混合酸酐法合成SAL-SUC-OVA包被原，由紫外掃描后的結(jié)果（圖1）可知，SAL-SUC-OVA在280 nm處的吸收值明顯高于OVA和SAL-SUC，從而可確定SAL-SUC已與OVA偶聯(lián)成功。

[TPLZ1.tif][FK）]

2.2釤標(biāo)抗體的制備與純化

經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法純化后，腹水抗體濃度為 3.96 mg/mL。經(jīng)ic-ELISA檢測，純化腹水抗體對SAL具有較強(qiáng)的識別能力，且效價較高。將經(jīng)過釤標(biāo)后的抗體利用Sephardex G25（1 cm×40 cm）層析柱純化，進(jìn)行紫外檢測（圖2）和熒光檢測（圖3）。檢測結(jié)果表明，Sm3+標(biāo)抗體與游離釤的分離度較高，紫外檢測和熒光值檢測的出峰管數(shù)與游離釤出峰管數(shù)基本相同，第1個峰值是釤標(biāo)成功的抗體，第2個峰值是游離釤。由圖3可知，21～25管是沒有被游離釤污染的純化釤標(biāo)抗體，且其熒光計數(shù)值均大于40萬。

2.3Sm3+標(biāo)記抗體反應(yīng)稀釋倍數(shù)與包被濃度

CPSmax值呈現(xiàn)隨包被濃度逐漸增大的趨勢，其中 8 μg/mL 時熒光讀數(shù)達(dá)到最高值，4、2、1 μg/mL的熒光讀數(shù)均較為接近；隨著稀釋倍數(shù)的增大，其熒光值下降較快（表1）。[CM（23*2/3]為降低試驗成本和提升檢測效果，應(yīng)選取CPSmax值在10 000～12 000時，包被濃度和抗體濃度均達(dá)最低值的組合，即包被濃度為1 μg/mL，抗體稀釋倍數(shù)為500倍。

2.4時間分辨免疫分析方法的建立

2.4.1釤標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)的確定

由于釤標(biāo)抗體制備成本高，先對釤標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)進(jìn)行優(yōu)化（圖4、圖5）。當(dāng)包被抗原濃度為1.25 μg/mL時，反應(yīng)的CPSmax值隨著Sm3+標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)的增加而顯著下降，與抗體稀釋倍數(shù)相對應(yīng)，其IC50值分別為3.26、3.84、5.83、5.83 ng/mL。當(dāng)抗體稀釋倍數(shù)為350倍與400倍時，其IC50值相近，靈敏度與其他2個稀釋倍數(shù)相比較高。綜合考慮抗體成本和曲線靈敏度，選擇CPS值高的400倍作為最佳抗體稀釋倍數(shù)。

2.4.2包被濃度檢測

由棋盤滴定得到的結(jié)果可初步得知，包被濃度為1 μg/mL時反應(yīng)較為理想，進(jìn)一步設(shè)置3個包被濃度（1.00、1.25、1.50 μg/mL）的SAL-OVA進(jìn)行固相包被，將釤標(biāo)抗體進(jìn)行400倍稀釋參與反應(yīng)。結(jié)果表明，3種包被濃度對應(yīng)的藥物抑制曲線擬合度較好（圖6），差異不大。比較不同包被濃度擬合曲線的CPSmax和IC50發(fā)現(xiàn)，CPSmax隨著包被濃度的增加呈上升趨勢，不同包被濃度擬合的曲線IC50有所區(qū)別，3個包被濃度對應(yīng)的IC50分別為3.67、2.43、3.66 ng/mL（圖7）。綜合考慮靈敏度與熒光值， 當(dāng)包被濃度為1.25 μg/mL時，TRFIA熒光值適中，且其靈敏度較高，因此選取1.25 μg/mL為最佳包被濃度。

2.4.3競爭時間的確定

采用抗原包被濃度1.25 μg/mL、釤標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)400倍，探討不同競爭時間（30、60、90、120 min）對靈敏度的影響（圖8、圖9）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的CPSmax值隨著競爭時間的延長呈上升趨勢，但其靈敏度并不隨之提高，反應(yīng)30～120 min的IC50值分別為1.90、1.88、2.83、2.66 ng/mL，由此可知競爭時間過長會導(dǎo)致非特異吸附產(chǎn)生，從而降低分析靈敏度。溫育30 min時其CPSmax值較低，表明在短時間段內(nèi)抗原抗體反應(yīng)并不完全；溫育60 min時所對應(yīng)的CPSmax值適中，且IC50較低，表明競爭反應(yīng)已經(jīng)進(jìn)行充分，基本平衡，因此最佳的競爭時間為60 min。

2.4.4競爭模式的確定

考察4種反應(yīng)模式對靈敏度的影響。體系1：50 μL SAL+50 μL Sm3+-McAb，共100 μL。體系2：100 μL SAL+50 μL Sm3+-McAb，共150 μL。體系3：50 μL SAL+100 μL Sm3+-McAb，共150 μL。體系4：100 μL SAL+100 μL Sm3+-McAb，共200 μL。

由圖10、圖11可知，體系2、體系3中SAL與釤標(biāo)抗體的比例分別為2 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]2，IC50值分別為2.11、3.11 ng/mL。體

系2中，由于釤標(biāo)抗體添加比例低，從低濃度開始藥物便對抗體有較明顯的抑制作用，導(dǎo)致熒光值過低，抑制曲線擬合程度低。體系3中，釤標(biāo)抗體添加比例高，CPSmax適中，但藥物比例低，藥物對抗體抑制不充分，因此靈敏度較低。而體系1、體系4的SAL與釤標(biāo)抗體是等量的，競爭反應(yīng)完全，體系總體積相異，靈敏度有明顯差異，反應(yīng)體系增大導(dǎo)致靈敏度下降。選取釤標(biāo)抗體與藥物等量且釤標(biāo)抗體添加量少、反應(yīng)靈敏度高的體系1為最佳反應(yīng)體系。

2.5SAL-TRFIA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

按照優(yōu)化方案的結(jié)果，包被抗原直接競爭TRFIA法的最優(yōu)化條件為：釤標(biāo)稀釋400倍、包被濃度1.25 μg/mL、反應(yīng)時間1.0 h、反應(yīng)體系為體系1。按照最優(yōu)條件，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 ng/mL時，建立SAL時間分辨免疫分析方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖12）。曲線線性好，其中半抑制量（IC50）為1.6 ng/mL，最低檢測限（IC10）為 0.136 ng/mL，檢測范圍（IC20～I(xiàn)C80）在0.39～12.77 ng/mL。

2.6SAL-TRFIA方法的精密度和特異性

取6個不同濃度的SAL標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行時間分辨分析，每個濃度設(shè)8個重復(fù)孔，進(jìn)行精密度測試（表2）。由表2可知，板內(nèi)、板間的平均差異均在15%以內(nèi)，表明建立的TRFIA方法精密度良好、穩(wěn)定性高。

利用藥物萊克多巴胺、克倫特羅，采用所建立的萊克多巴胺釤標(biāo)記時間分辨熒光免疫法進(jìn)行交叉反應(yīng)。結(jié)果顯示，與克倫特羅的交叉較小，僅有 2.29%，而與萊克多巴胺基本沒有交叉，表明基于抗SAL-單克隆抗體的TRFIA特異性良好。[JP]

2.7SAL-TRFIA方法的準(zhǔn)確性

各取豬肉、豬肝、豬尿、飼料樣品3份，分別加入高、中、低濃度的藥物進(jìn)行準(zhǔn)確性試驗（表3）。由表3可知，TRFIA方法測定SAL在豬肉、豬肝、豬尿、飼料4種基質(zhì)中的平均加標(biāo)回收率分別為98.02%、96.03%、108.73%、106.09%，基本在80%～120%之間。

3結(jié)論與討論

萊克多巴胺（SALbutamol，SAL）是“瘦肉精”克倫特羅的替代品，作為動物生長促長劑在畜牧生產(chǎn)中濫用的現(xiàn)象非常嚴(yán)重，是食品安全檢測的重點監(jiān)控對象。[JP+1]目前，萊克多巴胺檢測以儀器分析方法為主，研究開發(fā)成本低廉、操作簡便、檢測迅速、靈敏度高的免疫分析檢測技術(shù)顯得尤為重要。ELISA作為一種傳統(tǒng)的免疫分析形式，在萊克多巴胺檢測中的應(yīng)用已有報道，但檢測靈敏度有待提高。時間分辨免疫分析作為一種超靈敏的痕量分析手段，在萊克多巴胺檢測中未見報道。[JP]

本研究基于抗SAL的單克隆抗體，初步建立了檢測SAL的高靈敏度時間分辨直接競爭免疫分析法（CD-TRFIA）。采用辛酸-硫酸銨純化抗SAL雜交瘤細(xì)胞株腹水單克隆抗體，用稀土離子Sm3+偶聯(lián)物進(jìn)行標(biāo)記，制備釤標(biāo)抗體；通過合成SAL-SUC半抗原并與卵清蛋白偶聯(lián)獲得SAL-OVA包被抗原；采用直接競爭的方式，游離SAL和固相SAL-OVA包被抗原共同競爭有限的釤標(biāo)SAL單抗，初步建立SAL時間分辨免疫分析方法。研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化的TRFIA半抑制量IC50為1.6 ng/mL，檢測范圍為0.39～12.77 ng/mL，最低檢測限為0.136 ng/mL。對其他常用β-興奮劑進(jìn)行交叉反應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，建立的TRFIA方法特異選擇性高，與克倫特羅的交叉率較小（2.29%），而與萊克多巴胺沒有交叉。將建立的 TRFIA 方法與基于同源單克隆抗體而建立的酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）、熒光偏振免疫分析（FPIA）進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，TRFIA方法的靈敏度、檢測性能與ELISA和FPIA方法相比有不同程度的提高。

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