錢瑋++朱艷霞++邱業(yè)先

摘要：以太湖不同深度底泥為研究對象，采用末端限制性片段長度多態(tài)性方法，分析底泥中聚磷菌的多樣性。結(jié)果表明：32～35 cm底泥中聚磷菌多樣性最高，物種豐度、Shannon-Weiner多樣性指數(shù)分別為10、1.94。下層底泥（12～15、22～25、32～35 cm）中聚磷菌的群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，表層底泥（0～3、6～8 cm）受泥水界面影響，聚磷菌群落結(jié)構(gòu)與下層底泥有明顯差異。研究結(jié)果為了解湖泊底泥微生物的分布和聚磷菌多樣性積累了有價(jià)值的資料。

關(guān)鍵詞：太湖底泥；聚磷菌；末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）；垂直分布；微生物

中圖分類號：X172文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）03-0221-03

收稿日期：2015-12-21

基金項(xiàng)目：蘇州科技學(xué)院科研基金（編號：XKQ201313）。

作者簡介：錢瑋（1983—），男，江蘇泰州人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué)。Tel：（0512）68183945；E-mail：qianwei@mail.usts.edu.cn。

聚磷菌（polyphosphate accumulating organisms，簡稱PAOs）別稱攝磷菌，是一類對磷超量吸收的細(xì)菌菌種，磷以聚磷酸鹽顆粒（異染粒）的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，聚磷菌不是單一的微生物而是由不同的微生物群落組成[1]。研究表明，多聚磷酸鹽在聚磷菌聚磷過程中起著關(guān)鍵作用。多聚磷酸鹽（polyphosphate，簡稱Poly-P）是由無機(jī)正磷酸鹽殘基通過高能磷酸鍵連接而成的線性多聚物。近十年來，國外已有不少研究者對聚磷菌中與Poly-P的合成和分解有關(guān)的關(guān)鍵基因多聚磷酸鹽激酶（polyphosphate kinase，簡稱PPK）和外切聚磷酸酶（ex-opolyphosphatase，簡稱PPX）基因進(jìn)行克隆表達(dá)，在國內(nèi)相關(guān)研究剛剛起步，理解聚磷菌磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的生化機(jī)制和遺傳學(xué)知識，試圖從基因角度發(fā)現(xiàn)它們在遺傳學(xué)和酶學(xué)上是如何調(diào)控的，對于改進(jìn)聚磷菌的廢水除磷能力是十分必要的[2]。

研究聚磷菌最傳統(tǒng)的方法是分離培養(yǎng)法，但這種方法只能研究單一菌種特性，無法對生境中聚磷菌群落組成和動態(tài)變化進(jìn)行綜合分析，而分子生物學(xué)技術(shù)打破了傳統(tǒng)的生物學(xué)方法存在的缺陷，使從宏觀角度分析聚磷菌群落特征成為可能。本研究選用太湖竺山湖段生活污水入水口底泥為材料，采用基于PCR的分子指紋圖譜技術(shù)——限制性末端片段長度多態(tài)性（terminal-restriction fragment length polymorphism，簡稱T-RFLP）分析太湖生活入水口不同深度底泥聚磷菌群落多樣性，旨在探究該地區(qū)底泥中聚磷微生物的群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)也為以微生物為基礎(chǔ)的環(huán)境監(jiān)測預(yù)警和評價(jià)提供理論依據(jù)[3]。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1樣品采集

底泥樣品于2012年5月29日采集，采樣點(diǎn)位于太湖竺山湖（地理位置31°28′55″N，120°04′94″E）。以采樣點(diǎn)為中心作邊長10 m等邊三角形，利用沉積物柱狀采樣器，從3個(gè)頂點(diǎn)采集0～50 cm深度底泥樣品，把3份底泥樣品分別按照0～3、6～8、12～15、22～25、32～35 cm深度分成5段，將每段同一深度的底泥混勻，存放于-20 ℃冰箱待用[4]。

1.1.2試劑

PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶TaqⅠ、PCR引物等均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3儀器

GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、5417R小型臺式高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、Universal Hood Ⅱ凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad）、5332PCR擴(kuò)增儀（德國Eppendorf公司）、HHoS21-4-S恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、YXQ-LS-50SII高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1底泥DNA提取

底泥總DNA提取參照朱艷霞等的方法[5]，略有改動。稱取3 g底泥樣品于10 mL離心管中，加入6 mL DNA提取液，渦旋混勻5 min。加入溶菌酶至終濃度為2 mg/mL，搖床37 ℃、225 r/min振蕩1 h。加入10%體積20%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，簡稱SDS），混勻后于65 ℃水浴2 h，其間每15 min輕輕顛倒混勻。室溫 8 000 r/min 離心10 min收集上清，上清中加50%體積的40%聚乙二醇-8 000（polyethylene glycol，簡稱PEG）混勻，4 ℃ 沉淀過夜。4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集沉淀。沉淀用600 μL TE緩沖液溶解，加入等體積的酚-三氯甲烷-異戊醇（25 ∶[KG-*3]24 ∶[KG-*3]1），4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集上清。加入等體積的三氯甲烷-異戊醇（24 ∶[KG-*3]1），4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，收集上清。加入10%體積的 5 mol/L 乙酸鈉和60%體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇室溫沉淀 4 h，4 ℃、12 000 r/min離心15 min棄上清。沉淀用 -20 ℃ 預(yù)冷的70%乙醇洗滌2次，沉淀晾干后加200 μL TE緩沖液溶解，收集于1.5 mL離心管中。[JP2]

1.2.2聚磷菌的PCR擴(kuò)增

PCR上游引物PPK1（5′-FAM-[JP]AAYYTNGAYGARTTYTTYATGGT-3′），PCR下游引物PPK2（5′-GTCGAGCAGTTTTTGCATGA-3′）。PCR反應(yīng)為20 μL體系：10 μL 2×Premix，各1 μL上下游引物，1 μL模板DNA，7 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，48.5 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min[6-7]。

1.2.3PCR產(chǎn)物的純化與限制性酶切

按照說明書，使用DNA膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。采用TaqⅠ限制性內(nèi)切酶同時(shí)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。限制性酶切體系包含PCR純化產(chǎn)物10 μL，10×buffer （TaqⅠ） 1 μL，TaqⅠ酶1 μL。65 ℃ 酶切4 h后將產(chǎn)物送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行基因掃描。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

T-RFLP圖譜分析采用Treeflap軟件[8]，峰值圖上峰的橫坐標(biāo)代表T-RF的片段長度；峰的面積則代表具有相同片段長度所有T-RF的熒光強(qiáng)度的總和，即它所代表的這種菌種的相對豐度，然后分別計(jì)算樣本的物種豐度（species richness）、多樣性指數(shù)（Shannon-Weiner index）、優(yōu)勢度指數(shù)（Simpson index）和均勻度指數(shù)（Pielou evenness）。樣品聚類分析使用SPSS 15.0軟件。

2結(jié)果與分析

2.1聚磷菌的PCR擴(kuò)增

以不同深度底泥提取的基因組DNA為模板，采用針對聚磷菌的PPK特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，獲得了長度約為600 bp的目的條帶（圖1）。

2.2聚磷菌T-RFLP圖譜分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后進(jìn)行基因掃描，得到0～3、6～8、12～15、22～25、32～35 cm深度底泥聚磷菌群落多樣性T-RFLP圖譜（圖2）。T-RFLP圖譜用Treeflap軟件進(jìn)行分析，選擇的內(nèi)標(biāo)為GS500liz和sizing defalt-pp，舍去小于35 bp和大于500 bp的片段，取熒光強(qiáng)度大于1 000 RFU的峰，得到不同深度底泥優(yōu)勢菌群的種類及數(shù)量（圖3）。[FL）]

從圖2、圖3中可以看出，不同深度底泥中聚磷菌種類不同，檢測到的T-RFs片段長度主要集中在35～43 bp和 177～186 bp段。179 bp所代表的聚磷菌在所有樣品中普遍存在，且在各樣品中含量基本相當(dāng)。35～43 bp段所代表的微生物存在于0～3、22～25、32～35 cm等3個(gè)深度底泥樣品中，在6～8、12～15 cm深度的底泥中未能檢測到。180 bp所代表的聚磷菌存在于除去0～3 cm段的其他4個(gè)深度的樣品中，且在各樣品中比例較大，可能是因?yàn)樵摼哿拙軌蚍€(wěn)定地存在于底泥中，但其生長受水體影響較明顯，無法存在于最表層底泥中。

2.3不同深度底泥聚磷菌多樣性比較分析

根據(jù)不同深度底泥聚磷菌群落豐度（圖4-A）可以看出，不同深度的底泥中聚磷菌數(shù)量差異不大，底層和表層泥中聚磷菌種類相對較豐富。從Shannon-Weiner指數(shù)（圖4-B）可以看出，最底層聚磷菌群落多樣性最大，群落最復(fù)雜；0～15 cm段隨著深度的增加，聚磷菌多樣性減少，而15～35 cm 多樣性逐漸增多。均勻度（Pielou）指數(shù)表明，不同深度底泥聚磷菌群落均一性差異明顯，0～8 cm段聚磷菌均一性隨著深度的增加而增強(qiáng)，8～35 cm段聚磷菌均一性隨著深度增加而減弱（圖4-C）。Simpson指數(shù)表明，不同深度聚磷菌群落優(yōu)勢度存在明顯的差異，其中12～15 cm深度處聚磷菌的Simpson指數(shù)最高，說明該點(diǎn)的不同聚磷菌豐度相差不大，而深層底泥中聚磷菌分布極不均勻（圖4-D）。[FL）]

[FK（W18][TPQW4.tif][FK）]

2.4聚磷菌群落結(jié)構(gòu)的聚類分析

對5個(gè)不同深度底泥的T-RFLP圖譜進(jìn)行聚類分析，由圖5可以看出，12～15、22～25、32～35 cm聚類為1組，它們所含聚磷菌群落結(jié)構(gòu)相近，與0～3、6～8 cm段樣本的相似度較差。這一結(jié)果也從側(cè)面反映了不同深度的底泥樣品中聚磷菌群落結(jié)構(gòu)與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化具有一致性[9]。

3結(jié)論與討論

太湖底泥中最底層聚磷菌種類、多樣性最多，分別為10、1.94，群落較復(fù)雜。不同深度聚磷菌群落優(yōu)勢度和均勻度存在明顯的差異，其中15 cm深度處聚磷菌種類分布比較均一，而深層底泥中聚磷菌豐度差異性逐漸增大。各樣品中 T-RFs 片段長度主要集中在35～43、177～186 bp段，難以進(jìn)行區(qū)分?？赡茉蚴荘PK引物擴(kuò)增得到DNA片段中有較長的保守序列，使得酶切片段比較集中，后續(xù)可以嘗試更換引物以及通過雙酶切以增加T-RFs多樣性[10]。

通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，下層底泥（12～15、22～25、32～35 cm）中聚磷菌的群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，與0～3、6～8 cm段樣品所含聚磷菌種類相似度較差，可能原因是表層底泥位于泥水界面，其中磷的含量和形態(tài)變化受泥水界面擾動較大，由此造成其中聚磷菌群落結(jié)構(gòu)與底層差異較大[11]。

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