黎晶晶， 黎珊珊， 于艷麗

（1.浙江醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校 生物與制藥學(xué)院，浙江 寧波 315000；2.天津市河北區(qū)疾病防疫控制中心，天津300100；3.浙江大學(xué)明州醫(yī)院，浙江 寧波315000）

副溶血弧菌TDH的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備

黎晶晶1， 黎珊珊2， 于艷麗3

（1.浙江醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校 生物與制藥學(xué)院，浙江 寧波 315000；2.天津市河北區(qū)疾病防疫控制中心，天津300100；3.浙江大學(xué)明州醫(yī)院，浙江 寧波315000）

為實(shí)現(xiàn)副溶血性弧菌tdh基因的原核表達(dá)，采用TCBS選擇培養(yǎng)基從貝類(lèi)中篩選副溶血性弧菌疑似菌株；根據(jù)GenBank上已有的tdh基因序列，設(shè)計(jì)并人工合成引物，通過(guò)PCR技術(shù)鑒定副溶血性弧菌并擴(kuò)增tdh基因；酶切后定向插入到pET-28a表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-tdh，轉(zhuǎn)入E.coli Rosetta中，在IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行TDH蛋白表達(dá)。為制備耐熱直接溶血毒素TDH單克隆抗體，用純化的蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠，成功用原核載體表達(dá)的TDH蛋白為免疫原，制得一株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為T(mén)9N10。獲取腹水并經(jīng)Ni-NTA Resin親和柱純化，其穩(wěn)定分泌的單克隆抗體經(jīng)鑒定為IgG1，相對(duì)分子質(zhì)量約為146 000，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性。本研究為開(kāi)發(fā)副溶血弧菌免疫學(xué)快速檢測(cè)和深入的研究奠定良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

副溶血性弧菌；耐熱直接溶血毒素；原核表達(dá)；單克隆抗體；制備

近年來(lái)，由感染引起的食物中毒已經(jīng)成為了嚴(yán)重的食源性公共衛(wèi)生問(wèn)題。副溶血性弧菌（Vibrio Parahaemolyticus，VP）是一種嗜鹽性細(xì)菌，主要存在于近海岸的魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)等海產(chǎn)品中，人食用污染有該致病菌的海產(chǎn)品后可引起胃腸炎，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)引起敗血癥[1]。沿海地區(qū)檢測(cè)出多起由VP引起的食物中毒事件[2-5]。浙江沿海地區(qū)海水養(yǎng)殖的大量魚(yú)、蝦、貝類(lèi)，副溶血性弧菌也是主要病原，每年由此菌引起的弧菌病給養(yǎng)殖業(yè)也造成嚴(yán)重的損失[6-7]。

溶血毒素是副溶血性弧菌致病的主要原因。研究表明，副溶血弧菌的溶血毒素主要有耐熱直接溶血毒素（TDH）、相對(duì)耐熱直接溶血毒素（TRH）和不耐熱溶血毒素（TLH）。研究者發(fā)現(xiàn)，TDH幾乎全部由臨床分泌株分泌，只有5%的環(huán)境分離株能產(chǎn)生TDH[8]。已發(fā)現(xiàn)寧波地區(qū)引起感染性腹瀉的副溶血性弧菌，tdh基因攜帶率達(dá)到98.59%[9]，TDH可以作為副溶血性弧菌毒性的標(biāo)志。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)TDH檢測(cè)副溶血性弧菌的研究，大多采用PCR技術(shù)[10-11]，利用免疫學(xué)法的研究較少。因此，建立一種副溶血性弧菌TDH快速、靈敏的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，對(duì)環(huán)境監(jiān)測(cè)與食品安全檢測(cè)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和細(xì)胞株 副溶血性弧菌VP1-3：分離自寧波地區(qū)菜市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)海產(chǎn)品；大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；副溶血性弧菌ATCC 33846、非致病性副溶血性弧菌：浙江大學(xué)明州醫(yī)院饋贈(zèng)；E.Coli DH5α、E. Coli Rosetta、pET-28a質(zhì)粒和小鼠骨髓瘤SP/20細(xì)胞：中國(guó)藥科大學(xué)微生物與生化藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑 DNA提取試劑盒（140711）：北京博凌科為生物科技有限公司；TCBS瓊脂：北京陸橋生物有限公司；HRP標(biāo)記二抗、OPD、HAT、HT選擇培養(yǎng)基、抗體類(lèi)型試劑盒、IPTG、無(wú)血清DMEM等：南京建成生物工程研究所。BamHI和EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶、DNA Marker DL2000、DL15000、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量Marker、T4 DNA連接酶、SDS、PAGE、Ni-NTA Resin親和柱等：寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 8周BALB/c清潔級(jí)雌性小鼠：上海萊克斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 副溶血性弧菌的分離和培養(yǎng) 參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GM/T4789.7-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血弧菌檢驗(yàn)》方法處理貝類(lèi)[12]。從平板上挑取有特征的單克隆菌落再接種于TCBS瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h。挑取19株疑似菌落接種于5 mL牛肉浸膏培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)12 h后，做下一步鑒定。

1.2.2 PCR檢測(cè)

1）細(xì)菌總DNA提取：按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2）PCR檢測(cè)：從GenBank上獲得副溶血弧菌tdh基因的 DNA序列 （GenBank accession no. M10069），應(yīng)用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)引物如下：

R1：5’-GCGGATCCATGAAACACCAATATTTT GC-3’（含BamHI酶切位點(diǎn)）

R2：5’-CGGAATTCTTATTTTTATTGTTGATGT-3’（含EcoRI酶切位點(diǎn)）

以21株疑似細(xì)菌基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增tdh基因片段。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，72℃保持10 min。產(chǎn)物用1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，DNA回收試劑盒回收目的片段。

1.2.3 TDH蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

1）tdh基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定：將載體pET-28a分用限制性?xún)?nèi)切酶（BamHI和EcoRI）進(jìn)行酶切，用T4-DNA連接酶與目的片段在16℃連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-tdh，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用LB瓊脂平板（含kanamycin 100 μg/mL）篩選。篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒DNA，用BamHI和EcoRI雙酶切后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序鑒定。

2）pET-28a-tdh在大腸桿菌Rosetta中的誘導(dǎo)表達(dá)：將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-tdh轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta中，挑取陽(yáng)性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基（含kanamycin 100 μg/mL）中，37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至OD600nm為0.4～0.6后，加入IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，3～6 h后收集菌體，按文獻(xiàn)[13]表達(dá)蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳操作進(jìn)行分析。

1.2.4 重組TDH的純化 按1.2.3方法，加入IPTG誘導(dǎo)，至OD600nm值最大時(shí)收集菌體沉淀，沉淀加入含尿素的緩沖液，超聲20 min，于4℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液按照ProteinPure-Ni-NTA Resin親和柱的操作手冊(cè)，蛋白質(zhì)純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 免疫動(dòng)物 免疫8周齡BALB/c小鼠，取純化的TDH 10 μg與弗氏完全佐劑充分混合后，通過(guò)腹腔注射進(jìn)行首次免疫，隔周用5 μg TDH加強(qiáng)免疫，3次后取小鼠尾靜脈血用間接ELISA法作抗體效價(jià)測(cè)試，呈明顯陽(yáng)性的小鼠5 μg TDH加強(qiáng)免疫，3 d后取脾細(xì)胞作細(xì)胞融合。

1.2.6 細(xì)胞融合 融合前1周復(fù)蘇凍存的小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞。取小鼠脾細(xì)胞，置于無(wú)菌篩網(wǎng)上，充分研磨脾臟，收集脾細(xì)胞。取SP/20細(xì)胞與脾細(xì)胞（1∶5），用無(wú)血清的DMED培養(yǎng)液清洗，1 000 r/min離心5 min后，棄上清液。沉淀中加入1 mL PEG1500溶液，充分混勻；靜置10 min后加入25 mL無(wú)血清DMED培養(yǎng)液以終止PEG作用；1 000 r/min離心5 min，棄上清液；沉淀用含15%胎牛血清的HAT選擇培養(yǎng)液混勻，轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔加樣100 μL，置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.7 雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆 按文獻(xiàn)[14]方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。保存對(duì)目標(biāo)抗原具有特異性的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。

1.2.8 腹水的制備與純化 選取8周大小的BALB/c小鼠，每只腹腔注射300 μL液體石蠟，5 d后腹腔注射陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠注射1×106個(gè)細(xì)胞，8～10 d后收集腹水。抗體的純化采用辛酸硫酸銨沉淀法[15-16]，用SDS-PAGE分析獲得抗體的純度。

1.2.9 間接ELISA檢測(cè)單克隆抗體特異性 將大腸桿菌、金黃葡萄球菌、沙門(mén)桿菌和非致病性副溶血性弧菌進(jìn)行液體增菌培養(yǎng)，37℃、24 h后分別吸取菌液上清液100 μL包被96孔板，用PBS作空白對(duì)照；以待檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清液為一抗進(jìn)行單克隆抗體特異性鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血性弧菌的分離與培養(yǎng)

副溶血性弧菌疑似株在TCBS選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落呈藍(lán)綠色、邊緣整齊、濕潤(rùn)有黏性、半透明的菌落，直徑約2～4 mm，共分離出19株疑似菌株。

2.2 副溶血弧菌的PCR鑒定

分別以19株疑似菌株DNA為模板，以R1、R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。共有3個(gè)樣品在570 bp附近有條帶，與tdh基因大小相符，命名為VP1-3，檢出率為15.79%。

圖1 19株疑似菌株tdh基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification products of tdh gene from 19 suspected strains

2.3 TDH蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將膠回收的PCR產(chǎn)物及表達(dá)載體pET-28a經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化至大腸桿菌5Hα感受態(tài)細(xì)胞。提取質(zhì)粒，質(zhì)粒再經(jīng)雙酶切后經(jīng)鑒定出現(xiàn)兩條帶，一條約5 300 bp，另一條約為570 bp，結(jié)果見(jiàn)圖2。測(cè)序結(jié)果表明，該質(zhì)粒中含有目的基因片段，且讀碼框正確，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-tdh。

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a-tdh的酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Restriction enzyme analysis of pET-28a-tdh

獲得的pET-28a-tdh重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)SDSPAGE電泳發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)菌體在約23 000處出現(xiàn)了一條蛋白質(zhì)帶，分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示目的蛋白質(zhì)主要在沉淀中，說(shuō)明目的蛋白質(zhì)呈包涵體表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)ProteinPure-Ni-NTAResin親和柱純化后得到純化蛋白質(zhì)，見(jiàn)圖3。

2.4 TDH單克隆抗體的制備與鑒定

經(jīng)過(guò)3次免疫后的小鼠血清進(jìn)行間接ELISA測(cè)定，1號(hào)和4號(hào)小鼠的血清抗體效價(jià)均在1∶105以上，均可選擇其脾細(xì)胞進(jìn)行下一步細(xì)胞融合。選擇1號(hào)和4號(hào)小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合后，經(jīng)選擇培養(yǎng)和間接ELISA篩選，獲得3株具有抗體分泌能力的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)3次有限稀釋亞克隆及擴(kuò)大培養(yǎng)后，獲得能穩(wěn)定分泌的雜交瘤細(xì)胞1株，經(jīng)小鼠單克隆抗體亞型快速鑒定試劑盒檢測(cè)為IgG1，輕鏈屬Kappa型，命名為T(mén)9N10。

利用腹水制備抗體，收集到的腹水通過(guò)ELISA法進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，效價(jià)大于1∶105。采用辛酸硫酸銨沉淀法純化抗體，SDS-PAGE電泳結(jié)果見(jiàn)圖4。純化效果良好，抗體重鏈大約為50 000，輕鏈約為25 000。

圖3 pET-28a-tdh表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of pET-28a-tdh products by SDS-PAGE

圖4 小鼠腹水純化電泳圖Fig.4 SDS-PAGE figure for purification of ascites from BALB/c mice

2.5 單抗的特異性分析

用大腸桿菌、金黃葡萄球菌、枯草桿菌、非致病性副溶血性弧菌（無(wú)TDH）和ATCC33846的菌液包被96孔板，同時(shí)用TDH做陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表1。間接ELISA結(jié)果表明，T9N10只與TDH反應(yīng)呈陽(yáng)性，與其他菌液都呈現(xiàn)陰性，不發(fā)生交叉反應(yīng)，故判斷T9N10具有良好的抗體特異性。

3 結(jié)語(yǔ)

國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)顯示，副溶血性弧菌引起的食物中毒，居衛(wèi)生性食物中毒首位。浙江沿海地區(qū)尤為突出，目前研究認(rèn)為副溶血性弧菌產(chǎn)生的耐熱性溶血毒（TDH）是主要的致病因子[18]，因此制備出特異性針對(duì)副溶血性弧菌TDH的單克隆抗體有助于開(kāi)發(fā)免疫學(xué)快速檢測(cè)方法。

表1 單抗的特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Specific test results of monoclonal antibodies

作者利用PCR技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室篩得的疑似副溶血性弧菌的基因組DNA中成功克隆了tdh基因序列，并成功構(gòu)建了pET-28a-tdh原核表達(dá)的載體；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，外源基因可在原核生物中表達(dá)，SDSPAGE分析證實(shí)重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為23 000，與推測(cè)的理論產(chǎn)物大小一致。外源基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中以融合蛋白的形式表達(dá)，避免了細(xì)菌蛋白酶降解；同時(shí)運(yùn)用pET-28a表達(dá)載體，表達(dá)產(chǎn)物中含有6×His標(biāo)簽，利用Ni-NTA Resin親和柱與His結(jié)合的特異性可直接純化目的蛋白。

用本實(shí)驗(yàn)室制備的TDH蛋白制備的單克隆抗體即可以特異性識(shí)別純化的TDH蛋白，也可識(shí)別副溶血性弧菌分泌的TDH蛋白，具有良好的免疫特異性，為后續(xù)建立免疫學(xué)檢測(cè)方法和深入的研究奠定良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Expression of TDH from Vibrio parahaemolyticus and Preparation of Monoclonal Antibody against TDH

LI Jingjing1， LI Shanshan2， YU Yanli3
（1.Biology and Pharmaceutical Department，Zhejiang Pharmaceutical School，Ningbo 315000，China；2.Tianjin Hebei Center for Disease Control and Prevention，Tianjin 300100，China；3.Zhejiang University Mingzhou Hospital，Ningbo 315000，China）

To express of tdh gene in E.coli，TCBS medium was used to select the suspected strains of Vibrio parahaemolyticus（VP）.Primers were designed and synthesized to identify VP and amplify tdh gene based on the gene sequence from GenBank.The PCR gene product was ligated into prokaryotic expression vector pET-28a，and then the recombinant plasmids pET-28a-tdh was transformed into E.coli Rosetta.TDH protein was expressed by IPTG induction.To prepare monoclonal antibody against TDH （thermostable direct hemolysin）produced by VP，the purified TDH was used to immune BALB/c mice.The hybrid tumor cells named as T9N10 were prepared to secrete monoclonal antibodies by conventional prepared techniques.The secreted monoclonalantibodies are IgG1，which was 146 000 weight，and showed strong specificity.Results provide new insights to immunological rapid detection and research.

Vibrio parahaemolyticus，VP，TDH （thermostabledirecthemolysin），prokaryotic expression，monoclonal antibody，preparation

R 392.12

A

1673—1689（2017）03—0331—05

2015-03-22

浙江醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校教學(xué)科研項(xiàng)目（2012024）。

黎晶晶（1981—），女，內(nèi)蒙古呼倫貝爾人，微生物與生化藥學(xué)專(zhuān)業(yè)博士研究生。E-mail：pingljj@126.com

黎晶晶，黎珊珊，于艷麗.副溶血弧菌TDH的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（03）：331-335.