李亞巍,梁承武,金瑛,昌盛(吉林醫(yī)藥學(xué)院,吉林吉林132013)
·基礎(chǔ)研究·
越橘花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及機制
李亞巍,梁承武,金瑛,昌盛
(吉林醫(yī)藥學(xué)院,吉林吉林132013)
目的 探討越橘花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用,并初步探討其作用機制。方法 雄性KM種小鼠60只,隨機分為6組,分別為空白對照組、模型對照組、陽性對照組[吡拉西坦片200 mg/(kg·d)]、越橘花色苷高劑量[400 mg/(kg·d)]組、越橘花色苷中劑量[200 mg/(kg·d)]組、越橘花色苷低劑量[100 mg/(kg·d)]組??瞻讓φ战M和模型對照組每天灌胃給予等體積生理鹽水,1次/d;陽性對照組和越橘花色苷各劑量組分別按上述說明給予相應(yīng)劑量藥液,每天定時灌胃給藥1次。給藥的同時,除空白對照組外,其余各組每天皮下注射D-半乳糖(1.25 g/kg)。連續(xù)給藥6周,建立衰老(學(xué)習(xí)記憶障礙)小鼠模型。末次給藥2 h后,進行跳臺試驗訓(xùn)練檢測各組學(xué)習(xí)記憶能力。測試完畢,斷頭處死小鼠,采用化學(xué)比色法檢測小鼠腦組織乙酰膽堿酯酶(AChE)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,免疫印跡法檢測小鼠海馬組織Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果 與空白對照組比較,模型對照組小鼠跳臺錯誤次數(shù)增多,潛伏期縮短,且小鼠海馬組織AChE活性升高,SOD活性降低、MDA含量升高(P均<0.01);與模型對照組比較,越橘花色苷各劑量組能夠延長小鼠跳臺潛伏期、減少5 min內(nèi)出現(xiàn)的錯誤次數(shù)(P均<0.01),且可以降低小鼠海馬組織AChE活性(P均<0.05),升高SOD活性,降低MDA含量(P<0.01);越橘花色苷高劑量組與陽性對照組比較,P均﹥0.05。免疫印跡結(jié)果顯示,與空白對照組比較,模型對照組小鼠cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量升高,Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降低(P均<0.01)。與模型對照組比較,越橘花色苷中劑量組和高劑量組小鼠cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量下降(P均<0.01),Bcl-2蛋白相對表達(dá)量升高(P均<0.01)。陽性對照組、越橘花色苷高劑量和越橘花色苷中劑量組比較,P均﹥0.05。結(jié)論 越橘花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力具有一定的改善作用,其作用機制可能與改善小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平,增強Bcl-2的表達(dá)及抑制cleaved Caspase-3的表達(dá)相關(guān)。
學(xué)習(xí)記憶障礙;衰老;越橘花色苷;D-半乳糖;小鼠
越橘,又稱藍(lán)漿果、藍(lán)莓,為杜鵑花科越橘常綠灌木,全世界廣泛分布[1,2]。越橘果實味道酸甜可口,營養(yǎng)豐富,除了含有糖、氨基酸、維生素、膳食纖維等常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)外,還含有豐富的對人體具有良好保健作用的多酚類物質(zhì)——花色苷。據(jù)報道,越橘是目前花色苷含量最高的水果[3]。越橘花色苷是一種天然的營養(yǎng)物質(zhì),具有抗氧化、抗炎、提高免疫力、促進視紅素再合成、延緩衰老等多重功效,且對人體沒有任何不良作用[4~6]。當(dāng)前國內(nèi)外對越橘花色苷在諸如抗氧化、清除自由基、抗癌等方面已有詳細(xì)報道[7,8],但是,針對越橘花色苷對學(xué)習(xí)記憶能力影響的研究還非常少。因此,為探討越橘花色苷的益智健腦作用,2015年12月~2016年10月,本研究以D-半乳糖建立衰老(學(xué)習(xí)記憶障礙)小鼠模型,觀察越橘花色苷對模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響,并探討其作用機制,為越橘花色苷的進一步研究開發(fā)提供理論依據(jù)。
1.1 材料 健康成年KM種小鼠80只,雄性,體質(zhì)量18~20 g,購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心,動物合格證號:SCXK-吉2013-0001。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始試驗,室溫18~28 ℃,相對濕度62%~80%。長白山野生越橘為8月份采收,于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?,按參考文獻(xiàn)[9]方法,提取越橘花色苷;腦復(fù)康(吡拉西坦)購自吉林雙藥藥業(yè)集團有限公司;D-半乳糖購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;乙酰膽堿酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;Bcl-2、Caspase-3抗體購自美國Santa Cruza公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。550型酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司;UV-4802型紫外可見分光光度計購自上海UNICO儀器有限公司;TGL-16G臺式高速離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠;MTN-658自動生化分析儀購自長春市曼特諾醫(yī)療器械有限公司;DT-200型小鼠跳臺測試儀購自成都泰盟科技有限公司。
1.2 小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型的建立及分組 首先,將小鼠于實驗室飼養(yǎng)7 d以適應(yīng)環(huán)境,然后經(jīng)跳臺法篩選,即將小鼠置于跳臺裝置,施以24 V電壓,將過度敏感小鼠和極不敏感小鼠淘汰,篩選出活躍、對電擊反應(yīng)敏感、逃避反應(yīng)迅速的合格小鼠60只,隨機分為6組:空白對照組、模型對照組、陽性對照組[吡拉西坦片200 mg/(kg·d)]、越橘花色苷高劑量組[400 mg/(kg·d)]、越橘花色苷中劑量組[200 mg/(kg·d)]、越橘花色苷低劑量組[100 mg/(kg·d)],每組10只??瞻讓φ战M和模型對照組每天灌胃給予等體積的生理鹽水,1次/d;陽性對照組和越橘花色苷各劑量組分別按上述說明每天灌胃給予相應(yīng)劑量的藥液,1次/d。給藥的同時,除了空白對照組外,其余各組小鼠每天頸背部皮下注射D-半乳糖1.25 g/kg,連續(xù)6周,建立D-半乳糖致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠模型[10,11]。
1.3 小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的檢測 采用跳臺試驗。末次給藥2 h后,對小鼠進行跳臺試驗訓(xùn)練。首先將各組動物放入跳臺箱適應(yīng)3 min,隨后將小鼠放于安全平臺上,同時通以24 V交流電,記錄各組小鼠5 min內(nèi)跳下平臺受電擊的次數(shù)(即錯誤次數(shù))和第1次跳下平臺的潛伏期。24 h后重復(fù)測試,直接將小鼠放于安全臺上并通電,記錄小鼠5 min內(nèi)出現(xiàn)的錯誤次數(shù)和首次跳下平臺的潛伏期。
1.4 海馬組織中AChE活性、SOD活性和MDA含量的測定 跳臺試驗結(jié)束后,立即對小鼠進行麻醉,斷頭處死小鼠,置于冰上迅速分離海馬與皮層,于冰冷生理鹽水中進行勻漿,制成10%腦組織勻漿液,并用冷凍離心機在-4 ℃條件下3 000 r/min低溫離心15 min,吸取上清液,-80 ℃保存?zhèn)溆?,根?jù)試劑盒說明書進行操作,采用化學(xué)比色法分別檢測各組小鼠海馬組織中AChE活性、SOD活性和MDA含量。
1.5 海馬組織中Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)的檢測 采用免疫印跡試驗。跳臺試驗結(jié)束后,斷頭處死小鼠,置于冰上迅速分離海馬,0.25%胰酶消化,收集細(xì)胞后以1 000 r/min離心10 min,以PBS洗2次,用PIPA細(xì)胞裂解液置冰浴裂解,4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min,收集上清。經(jīng)BCA法進行蛋白定量后,取等量樣品以12% SDS-PAGE進行電泳。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h后,Bcl-2和Caspase-3抗體(濃度1∶100)孵育過夜,再以過氧化酶標(biāo)記的二抗封閉液孵育1 h,用ECL顯影,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)標(biāo)的積分吸光度比值表示蛋白的相對表達(dá)量。
2.1 各組小鼠跳臺潛伏期及跳臺錯誤次數(shù)比較 見表1。模型對照組與空白對照組跳臺潛伏期和跳臺錯誤次數(shù)比較,P均<0.01,提示模型制作成功。
表1 各組小鼠跳臺潛伏期及跳臺錯誤次數(shù)比較
注:與模型對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。
2.2 各組海馬組織AChE、SOD活性和MDA含量比較 見表2。模型對照組與空白對照組各指標(biāo)比較,P均<0.01。
表2 各組AChE、SOD活性和MDA含量比較
注:與模型對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。
2.3 各組海馬組織Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較 空白對照組、模型對照組、陽性對照組、越橘花色苷低劑量組、越橘花色苷中劑量組、越橘花色苷高劑量海馬組織Bcl-2蛋白相對表達(dá)量分別為1.42±0.08、0.76±0.08、1.24±0.05、1.08±0.10、1.29±0.03,cleaved Caspase-3分別為0.51±0.03、0.97±0.05、0.65±0.07、0.86±0.08,0.62±0.01。與空白對照組相比,模型對照組海馬組織cleaved Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量升高,Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降低(P均<0.01);與模型對照組比較,越橘花色苷中劑量組和高劑量組海馬組織cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量降低,Bcl-2 蛋白相對表達(dá)量升高(P均<0.01)。越橘花色苷高劑量和中劑量組與陽性對照組比較,P均﹥0.05。
衰老是生命發(fā)生發(fā)展過程中的一個必經(jīng)階段,主要表現(xiàn)為機體對環(huán)境的適應(yīng)能力逐漸減弱甚至喪失,出現(xiàn)多器官、組織功能的衰退[12]。阿爾茨海默病(AD),常被稱為老年性癡呆,是嚴(yán)重影響老年人身心健康的主要疾病,近年發(fā)病率逐年增高。AD為一種進行性神經(jīng)退行性疾病,以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為主要臨床癥狀,以大腦組織神經(jīng)元纖維纏結(jié)、中老年斑沉積為主要病理改變,發(fā)病機制尚不明確,目前臨床仍無良好的防治藥物[13,14]。研究衰老和癡呆的動物模型很多,給小鼠注射D-半乳糖致衰老模型是根據(jù)衰老的代謝學(xué)說建立的一種常見的亞急性衰老模型,具備造模時間短、操作簡單、重現(xiàn)性良好等優(yōu)勢,已成為國內(nèi)外公認(rèn)的模擬衰老動物模型的方法[15]。
跳臺試驗是一種常見的測試小型動物學(xué)習(xí)記憶能力的行為學(xué)檢測方法[16],本研究結(jié)果表明,D-半乳糖能夠明顯抑制小鼠在新環(huán)境下的自發(fā)活動和探究能力,使小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能明顯減退,而越橘花色苷能夠顯著改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙情況,表現(xiàn)為小鼠的跳臺錯誤次數(shù)顯著減少,潛伏期明顯延長。提示越橘花色苷能夠改善D-半乳糖致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
AD的發(fā)病機制目前尚未完全闡明,“膽堿能學(xué)說”和“Aβ級聯(lián)學(xué)說”是目前國內(nèi)外普遍公認(rèn)的發(fā)病學(xué)說?!澳憠A能學(xué)說”認(rèn)為,AD患者體內(nèi)的AChE活性較正常人顯著升高,可以大量水解ACh,導(dǎo)致中樞ACh含量明顯下降,從而影響神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞,出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙。本研究結(jié)果顯示,與空白對照組比較,模型對照組小鼠海馬組織AChE活性明顯升高,給予越橘花色苷后,能夠顯著降低D-半乳糖致衰老小鼠海馬組織AChE活性。提示越橘花色苷可能通過調(diào)節(jié)AchE活性發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶的作用。
“Aβ級聯(lián)學(xué)說”認(rèn)為,AD發(fā)生發(fā)展過程中,AD患者腦組織中異常沉積的Aβ蛋白會引起一系列的細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng),其中包括氧化應(yīng)激損傷,這將直接或間接損傷膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞,造成學(xué)習(xí)記憶能力受損。而SOD和MDA是反映機體氧化還原狀態(tài)的主要標(biāo)志物。SOD是機體的一種內(nèi)源性抗氧化酶,其活性降低能夠?qū)е履X部氧化應(yīng)激損傷;MDA作為一種重要的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物,其異常增加能夠間接反映體內(nèi)自由基的受損情況。本研究結(jié)果表明,與空白對照組比較,模型對照組小鼠海馬組織SOD活性明顯下降,MDA含量明顯升高,給予越橘花色苷后,能夠明顯升高D-半乳糖致衰老小鼠海馬組織SOD活性、降低MDA含量。提示越橘花色苷可以通過抗氧化功能改善學(xué)習(xí)記憶功能,延緩機體衰老。
Bcl-2基因家族及其相關(guān)蛋白是最早發(fā)現(xiàn)與凋亡有關(guān)的基因,也是當(dāng)前最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族。Bcl-2的過度表達(dá)可以有效抑制細(xì)胞凋亡。 Caspases家族則是近年發(fā)現(xiàn)的在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的執(zhí)行蛋白酶,它通常以無活性前體的形式存在于細(xì)胞中,當(dāng)細(xì)胞進入凋亡時才被激活,是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點,它的激活標(biāo)志著凋亡進入不可逆階段。因此,檢測cleaved Caspase-3的變化能夠準(zhǔn)確地反映腦內(nèi)神經(jīng)元的凋亡情況。本研究結(jié)果顯示,與空白對照組相比,模型對照組cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)升高,Bcl-2表達(dá)降低。給予越橘花色苷后,各組cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)均較模型對照組降低,Bcl-2蛋白表達(dá)隨著越橘花色苷濃度的升高呈現(xiàn)升高趨勢。提示越橘花色苷改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用機制可能與增強Bcl-2的表達(dá)及抑制cleaved Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。
綜上所述,越橘花色苷具有改善D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的能力,其作用機制可能與改善小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平,增強Bcl-2的表達(dá)及抑制cleaved Casepase-3的表達(dá)相關(guān)。
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國家自然科學(xué)基金資助項目(21102055);吉林市科技局杰出青年人才培養(yǎng)計劃(20156429)。
昌盛(E-mail:lyw135@163.com)
10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.010
R338
A
1002-266X(2017)13-0036-04
2017-01-12)