徐瑤瑤, 李思琪, 田雪梅

(華南師范大學生命科學學院, 廣州510631)

三種不同固定液對小鼠組織過碘酸雪夫染色效果比較

徐瑤瑤, 李思琪, 田雪梅

(華南師范大學生命科學學院, 廣州510631)

目的 比較小鼠肝臟、腎臟、小腸三種組織在質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛液、Carnoy’s液、Bouin’s液三種固定液不同固定時間下的制片質(zhì)量和過碘酸雪夫染色(PAS)效果，篩選出一種最為適用的固定方法。方法 取成年雄性C57BL/6小鼠肝臟、腎臟、小腸，分別固定于三種固定液，固定時間分別是質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛液: 24 h、48 h、72 h; Carnoy’s液: 4 h、8 h、12 h; Bouin’s液：12 h、24 h、48 h，充分固定后，常規(guī)制作石蠟切片，然后進行PAS染色，對比觀察染色效果。結果 三種固定液對不同組織、不同固定時間下PAS染色結果存在差異。肝臟、腎臟、小腸經(jīng)Carnoy’s液處理12 h后PAS效果最佳，質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛液固定24 h基本滿足觀察檢測效果，而經(jīng)Bouin’s液固定組織染色效果相對較差。結論 PAS反應對固定液和固定時間具有選擇性, Carnoy’s 液是組織進行PAS染色的理想固定液，但從固定效果、重復性、安全性、成本等多因素綜合考慮，在PAS反應中，質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛液可以替代Carnoy’s液。

Carnoy’s液; Bouin’s液; 多聚甲醛; 過碘酸雪夫(PAS)染色

過碘酸雪夫(PAS)染色(periodic acid-Schiff stain),是一種常見的組織化學染色方法，主要用于檢測多糖和糖蛋白, 現(xiàn)已廣泛應用于病理學診斷和鑒別。研究表明[1,2], PAS反應對固定液具有選擇性，從而影響制片質(zhì)量和染色效果。目前固定液的種類很多, Carnoy’s液作為PAS反應的經(jīng)典固定液, 卻存在配制麻煩、重復率低、成本高、不適用免疫組化研究等問題。多聚甲醛(Paraformaldehyde)是目前實驗室最常用的固定劑之一, 該固定劑較為溫和, 能很好地保存組織的抗原性和細微結構, 適于組織標本和細胞片的較長期保存, 也非常適合組織和細胞的光學顯微鏡免疫化學研究[3]。如果在PAS反應中，經(jīng)Carnoy’s液固定的組織染色結果，多聚甲醛處理后也能達到相應要求, 將為今后的病理學研究提供較大幫助。因此, 作者選用了質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛液、Carnoy’s液、Bouin’s液三種不同的固定液,對小鼠肝臟、腎臟、小腸這三種組織進行不同固定時間處理，對比觀察PAS染色結果，以期為今后的研究應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

8～9 周齡SPF級雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量20～25 g ，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK (粵)2011-0015]。偏重亞硫酸鈉購自天津市永大化學試劑有限公司，蘇木精購自廣州市斯佳生物科技有限公司，多聚甲醛、高碘酸鈉、堿性品紅、苦味酸、冰醋酸、無水乙醇、氯仿、鹽酸、二甲苯等常用試劑均購自廣州化學試劑廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制 ①質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛液: 4 g 多聚甲醛加50 mL蒸餾水, 在通風櫥里加熱至60 ℃，邊攪拌邊滴入1 mol/L的NaOH，直到多聚甲醛完全溶解，冷卻后加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液定容至100 mL; ②Carnoy’s液: V95%乙醇∶V冰醋酸∶V氯仿=6∶1∶3; ③Bouin’s液: V苦味酸飽和液∶V甲醛:V冰醋酸=15∶5∶1; ④Schiff試劑(熱配法): 200 mL蒸餾水煮沸后離火，慢慢加入1.0 g 堿性品紅, 攪拌至完全溶解, 冷卻至50 ℃時過濾, 加入1 mol/L鹽酸5 mL 搖蕩，冷卻至25 ℃時,加入0.25 g 偏重亞硫酸鈉, 密封瓶口, 至暗處或4 ℃冰箱內(nèi)24 h后溶液呈草黃色，加入0.5 g 活性炭，搖蕩1 h后過濾。此時溶液呈無色或淡黃色, 避光, 4 ℃保存?zhèn)溆肹4]。

1.2.2 取材、固定和包埋 小鼠引頸法處死。分別取肝臟、腎臟、小腸組織, 沖洗干凈后, 立即置于三種固定液中進行固定，固定時間分別為質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛液: 24 h、48 h、72 h; Carnoy’s液: 4 h、8 h、12 h; Bouin’s液: 12 h、24 h、48 h。待組織固定完全后, 再按照常規(guī)石蠟包埋、切片(5 μm)。

1.2.3 PAS染色 切片常規(guī)脫蠟至水, 先用1%高碘酸鈉溶液氧化10 min，充分水洗后入蒸餾水洗，用Schiff試劑室溫暗染5～15 min，流水沖洗10 min，過蒸餾水，蘇木精復染10～30 min，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗至反藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡鏡檢并采集圖像。

2 結果

2.1 三種固定液對小鼠肝臟PAS染色效果

PAS染色肝組織結果(圖1、表1)顯示, 三種固定液不同固定時間的固定效果存在差異。Carnoy’s液固定肝臟12 h效果最好，肝糖原呈鮮艷的洋紅色，細胞核呈藍紫色，肝小葉結構完整，肝細胞界限清晰, 核質(zhì)對比明顯, 但出現(xiàn)極化現(xiàn)象(圖1B)。4%多聚甲醛液固定組織48 h效果較好，肝細胞著色鮮艷，能較好的保存肝糖原(圖1A)。Bouin’s液固定肝組織12 h，結構尚清晰，但肝細胞出現(xiàn)空泡樣，且隨著固定時間的延長增多(圖1C)。

2.2 三種固定液對小鼠腎臟PAS染色效果

PAS染色腎組織結果(圖2、表2)顯示，三種固定液均具有良好的固定效果。腎單位細胞核呈藍紫色，腎小球毛細血管基底膜、系膜基質(zhì)，腎小囊壁層基膜，腎小管基底膜均呈鮮艷的紫紅色。對比PAS染色陽性部位的著色鮮艷程度和清晰程度，Carnoy’s液優(yōu)于質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛液、Bouin’s液(圖2B)。Bouin’s液液固定的腎單位細胞界限明顯，血管襻的具體結構清晰，近曲小管和遠曲小管管腔邊緣強陽性(圖2C)。而質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛液固定的腎臟整體著色較深, 腎小球基底膜突出明顯,但結構清晰度較Carnoy’s液、Bouin’s液模糊(圖2A)。

2.3 三種固定液對小鼠小腸PAS染色效果

PAS染色小腸組織結果(圖3、表3)顯示，三種固定液固定效果存在差異。Carnoy’s液和質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛液固定的小腸組織，組織結構清晰，色彩鮮艷，中央糜管、腸腺清楚完整，黏原顆粒清晰可見，細胞核呈藍紫色, PAS陽性物質(zhì)集中分布在腸腺上皮杯狀細胞, 呈洋紅色, 且核質(zhì)對比明顯，固定效果好(圖3A、3B)。而Bouin’s液固定的小腸核質(zhì)比對比不明顯，染色效果相對不佳(圖3C)。

圖 1 三種固定液固定后的小鼠腎組織PAS染色 (400×)Figure 1 PAS staining of liver tissue of mice fixed by three fixatives (400×)

表 1 不同固定液對小鼠肝臟PAS染色效果的比較

圖 2 三種固定液固定后的小鼠腎組織PAS染色(400×)Figure 2 PAS staining of kidney tissue of mice fixed by three fixatives (400×)

表 2 不同固定液對小鼠腎臟PAS染色效果的比較

圖 3 三種固定液固定后的小鼠小腸組織PAS染色 (200×)Figure 3 PAS staining of small intestine tissue of mice fixed by three fixatives (200×)

表 3 不同固定液對小鼠小腸PAS染色效果的比較

3 討論

3.1 PAS染色的作用機理

PAS染色是一種常用的組織化學染色方法，主要用于檢測糖類化合物。糖被強氧化劑高碘酸氧化后形成多醛，后者在與無色品紅硫酸復合物(即希夫試劑)結合，形成紫紅色產(chǎn)物[5]。肝組織的肝糖原、小腸黏膜上皮的杯狀細胞，腎臟腎小球和腎小管基底膜，因主要成分是糖原或糖蛋白而表現(xiàn)為PAS陽性[6]。

3.2 三種固定液的優(yōu)缺點分析

固定的目的在于使蛋白變性、凝固、沉淀，保存細胞和組織的原有形態(tài)結構。固定過程中組織結構的保存效果受多種因素影響，如固定液種類、溫度、固定時間以及固定后處理方法等。因此選擇最合適的固定條件有助于最大程度的保證組織的完整性[7]。

質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛液能使細胞內(nèi)的自由氨基基團發(fā)生化學交聯(lián)而使組織固定，該固定液固定均勻，對組織收縮小，用一種簡單而有效的抗原修復技術就可以恢復被它減少或變性的抗原適用于形態(tài)學和免疫組織化學的固定液，且成本低，是目前病理學家選擇的最通用的固定液。Carnoy’s液對核固定優(yōu)良，可保存Nissl氏物質(zhì)和糖原; 但它會使組織收縮和變硬并溶掉血細胞，可能會破壞抗酸染色中的抗酸桿菌的染色; 同時對人體有一定的損害，需小心操作。Bouin’s液中的苦味酸可與蛋白基團形成鹽而使蛋白凝固，是一種用于結締組織染色的極好固定劑?？辔端崾且环N有劇毒性的黃色結晶體，在干燥空氣中有爆炸性，故需保濕保存，給日常使用帶來危險[8]。

在本次實驗中，Carnoy’s液固定效果優(yōu)于質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛液和Bouin’s液，但也出現(xiàn)使糖原顆粒移至細胞一側的極化現(xiàn)象，影響切片觀察。可能是由于含有高濃度的乙醇，當在組織內(nèi)滲透時向組織中央沖擊而引起糖原向細胞一側偏移造成[9]。同時，Carnoy’s液易引起組織過度硬化導致切片失敗。Bouin’s液固定腎臟組織，整體效果較好，但固定的肝臟肝糖原出現(xiàn)部分溶解，小腸組織存在結構界限不清晰，整體著色不鮮艷等問題，說明Bouin’s液不適用于肝臟固定。黃宏森等[10]研究也證實了這一點。由于糖原是水溶性的，所以許多早期研究認為，應避免使用水溶性固定劑，如甲醛。祁珊珊[11]使用質(zhì)量分數(shù)3.7%多聚甲醛固定十二指腸、腎臟組織，結果顯示該固定液也可有效保留糖原。本實驗經(jīng)質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛液固定的三種組織，其PAS陽性物質(zhì)染色結果基本達到檢測觀察效果。切片整體著色較深，色澤鮮艷，尤其小腸組織杯狀細胞糖原顆粒(中性黏蛋白)清晰，陽性反應強，而Carnoy’s、Bouin’s液組杯狀細胞胞質(zhì)內(nèi)黏液未出現(xiàn)PAS反應強陽性，可能是因為這兩種固定液含有醋酸，細胞易被破壞，較難保存細胞顆粒。

綜上所述, 質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛固定組織48 h可有效保留糖原和糖蛋白, 且染色清晰, 對比度強，固定的組織可用于PAS染色; 從固定效果、重復性、安全性、成本等多因素綜合考慮, 在病理學PAS反應中, 質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛液可以替代Carnoy’s液。

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Comparison on Periodic Acid Schiff Staining Effect on Mice Tissues with Three Different Fixatives

XU Yao-yao, LI Si-qi
(School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

ObjectiveThrough comparing the slides qualities and periodic acid Schiff (PAS) staining effects with three different fixatives and fixed time on the normal liver, kidney, small intestine from mice, so as to select the optimum fixed methods.MethodsThe liver, kidney and small intestine tissue from adult male C57BL/6 mice were harvested, then fixed in three fixatives with different times respectively, the 4% paraformaldehyde fluid with 24 h, 48 h, 72 h, the Carnoy’s fluid with 4 h, 8 h, 12 h, and the Bouin’s fluid with 12 h, 24 h, 48 h. After fixed sufficiently, produced paraffin section and then stained routinely with PAS, to observe the staining effect under microscope. Result Different PAS staining results existed among three fixatives with different fixed time on three kind of tissues. The best staining result was observed in Carnoy’s fluid fixed for 12 h, the 4% paraformaldehyde fixed 48 h can basically met the criteria for observation. the staining result was relatively poor fixed in Bouin’s fluid.Conclusion PAS reaction was selective for fixative and fixed time. Carnoy’s fluid is an ideal fixative, but based on the fixed effect, repeatability, safety, and cost, 4% paraformaldehyde fluid can replace Carnoy’s liquid and widely used in PAS reaction.

Carnoy fluid; Bouin’s fluid; Paraformaldehyde fluid; Periodic acid Schiff (PAS) staining

R-331 Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0155-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.014

2016-12-28

廣東省重點基金資助項目(2014A020212504)

徐瑤瑤(1991-), 女, 碩士研究生, 從事基因敲除小鼠免疫方面的研究, E-mail: xyyscnu@163.com

田雪梅(1969-), 女, 教授, 博士, E-mail: xmtian69@163.com