王文廣, 匡德宣, 尹博文, 陸彩霞, 罕園園, 李 娜, 仝品芬, 孫曉梅, 蔡路奎, 代解杰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心,云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化與應(yīng)用研究省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì), 昆明650118)

腸道病毒71型體外感染樹鼩腎細(xì)胞特性觀察

王文廣, 匡德宣, 尹博文, 陸彩霞, 罕園園, 李 娜, 仝品芬, 孫曉梅, 蔡路奎, 代解杰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心,云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化與應(yīng)用研究省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì), 昆明650118)

目的 探討腸道病毒71型(EV71)對(duì)樹鼩腎細(xì)胞的感染特性。方法 通過組織塊貼壁法分離培養(yǎng)樹鼩原代腎細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，利用細(xì)胞角蛋白18 對(duì)樹鼩腎細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光鑒定。用EV71感染樹鼩腎細(xì)胞，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，結(jié)合間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞中病毒蛋白的表達(dá)情況，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病毒載量，以Vero細(xì)胞為對(duì)照，研究EV71對(duì)樹鼩腎細(xì)胞的感染情況。結(jié)果 通過組織塊貼壁法可以快速獲得樹鼩原代腎細(xì)胞，并可進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)，細(xì)胞為梭形，貼壁呈鋪路石狀，免疫熒光鑒定為腎上皮細(xì)胞。EV71可以感染樹鼩腎細(xì)胞，使之出現(xiàn)明顯的細(xì)胞變圓、脫落或解體等病變，免疫熒光實(shí)驗(yàn)可以觀察到病毒蛋白的分布，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒載量最高可達(dá)105拷貝/mL，病變情況和增殖趨勢(shì)與Vero細(xì)胞相似。結(jié)論 EV71可以體外感染樹鼩腎細(xì)胞，該細(xì)胞模型可為EV71藥物篩選和感染機(jī)制研究提供平臺(tái)。

樹鼩; 腎細(xì)胞; 腸道病毒71型(EV71)

腸道病毒71型(EV71)為引起兒童手足口病主要病原體之一, 可使重癥患兒出現(xiàn)肺水腫、腦炎等癥狀，嚴(yán)重危害嬰幼兒生命和健康[1]。樹鼩作為一種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在復(fù)制人類疾病和藥物評(píng)價(jià)應(yīng)用中獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，近年來在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，尤其是病毒學(xué)方面受到越來越多的重視。研究表明[2]，幼齡中緬樹鼩(Tupaia belangeri chinensis)可以感染EV71，表現(xiàn)出一系列與人相似的臨床癥狀，有望成為一種新的手足口病動(dòng)物模型而被應(yīng)用于EV71的基礎(chǔ)或臨床研究，而建立樹鼩細(xì)胞水平的感染模型不僅能對(duì)上述研究進(jìn)一步補(bǔ)充完善, 更能為EV71的感染機(jī)制研究和藥物篩選評(píng)價(jià)提供新的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞), 是目前公認(rèn)的一種良好的病毒培養(yǎng)載體[3,4], 本研究以此細(xì)胞為對(duì)照,通過對(duì)樹鼩腎細(xì)胞的分離培養(yǎng)和EV71感染實(shí)驗(yàn), 初步探討建立EV71感染樹鼩腎細(xì)胞模型的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 經(jīng)人工繁育的F1代成年中緬樹鼩，來自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心[SCXK(滇) K2013-0001], 飼養(yǎng)于本中心普通級(jí)環(huán)境中的樹鼩專用不銹鋼籠具內(nèi)[SYXK(滇) K2013-0001]。

1.1.2 細(xì)胞和病毒 Vero細(xì)胞和EV71標(biāo)準(zhǔn)毒株(FY-23), 均來自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所。1.1.3 主要儀器 日立臺(tái)式離心機(jī)(CT15RE，日本日立公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX 96，美國(guó)BIO-RAD公司), 尼康倒置熒光顯微鏡(ECLIPSE, 日本尼康公司), 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)。

1.1.4 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶溶液、雙抗(美國(guó)HyClone公司)，胎牛血清(美國(guó)BI公司)，細(xì)胞角蛋白18抗體(美國(guó)Abcam公司)，腸道病毒EV71抗體(美國(guó)Millipore公司)，熒光標(biāo)記的兔抗鼠IgG(德國(guó)Merck公司)，RNAiso Plus(D9108A), 實(shí)時(shí)定量RT-PCR試劑(DRR064A)(大連寶生物公司), 引物探針均由大連寶生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樹鼩腎細(xì)胞的原代培養(yǎng) 選F1代成年樹鼩脫頸處死，無(wú)菌取腎，剔除包膜，用含體積分?jǐn)?shù)1%雙抗的PBS反復(fù)沖洗干凈；取腎皮質(zhì)部分，剪成1 mm3組織小塊，用含1%雙抗的PBS反復(fù)沖洗，并吸棄上清; 用眼科鑷結(jié)合加樣槍將組織塊分散布入25 cm2培養(yǎng)瓶中。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入3 mL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于二氧化碳培養(yǎng)箱中(37 ℃, 體積分?jǐn)?shù)5% CO2)倒置培養(yǎng)1～2 h,然后輕輕翻轉(zhuǎn)正置培養(yǎng)。培養(yǎng)期間根據(jù)生長(zhǎng)情況更換培養(yǎng)液，使用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2 樹鼩腎細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 對(duì)從組織塊周圍遷出且鋪滿瓶底80%左右面積的原代腎細(xì)胞進(jìn)行首次傳代培養(yǎng), 加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化并按照1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)，定期觀察并拍照。

1.2.3 樹鼩腎細(xì)胞細(xì)胞免疫熒光鑒定 樹鼩腎細(xì)胞接種至6孔板，待其80%鋪滿孔底后，PBS 清洗2次，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定20 min; PBS 清洗3次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的Triton-X100穿孔15 min; PBS 漂洗3次, 山羊血清封閉液封閉30 min, PBS 漂洗3次，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% BSA 稀釋的小鼠角蛋白18單克隆一抗(1∶200)，4 ℃過夜; PBS漂洗3次，加入1%BSA 稀釋的熒光標(biāo)記的兔抗鼠IgG(1∶200)，37℃避光孵育1; 暗光環(huán)境中，PBS漂洗3次，滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核; PBS 漂洗3次，洗去多余的DAPI; 在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4 EV71感染實(shí)驗(yàn) 選擇貼壁完全的樹鼩腎細(xì)胞，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化后制備密度為5× 104/mL的細(xì)胞懸液, 按每孔2 mL接入12孔板, 待形成細(xì)胞單層(90%鋪滿瓶底)，吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗細(xì)胞單層，分別按10 TCID50、100 TCID50、1 000 TCID50接種EV71病毒0.1 mL，同設(shè)空白對(duì)照, 培養(yǎng)基為不含血清的DMEM培養(yǎng)液, 培養(yǎng)期間定期進(jìn)行觀察拍照, 使用EV71抗體按照1.2.3步驟進(jìn)行免疫熒光觀察, 以質(zhì)量分?jǐn)?shù)Vero細(xì)胞作對(duì)照進(jìn)行同樣處理。

1.2.5 EV71培養(yǎng)物的采集 選擇貼壁完全的樹鼩腎細(xì)胞, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)以0.25%胰酶消化后制備密度為5× 104/mL的細(xì)胞懸液, 按每孔1 mL接入24孔板, 待細(xì)胞貼壁形成90%單層, 以PBS沖洗后按100 TCID50每孔接種EV71病毒0.05 mL，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)，分別在接種后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h收集病毒培養(yǎng)上清，待測(cè)病毒載量，以Vero細(xì)胞作對(duì)照進(jìn)行同樣處理。

1.2.6 病毒增殖曲線 Trizol法提取病毒培養(yǎng)上清中RNA，按寶生物試劑盒DRR064A說明進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR操作, 根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)病毒的載量繪制增殖曲線。定量標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度為107拷貝/μL、106拷貝/μL、105拷貝/μL、104拷貝/μL、103拷貝/μL,引物探針根據(jù)EV71(FY-23)基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì):

上游引物: 5'-CGCTTTGACGCAGAGTTCACT-3';

下游引物: 5'-TTGGAGCAATTGTGGGACGA-3';

探針: 5'-FAM-TTGTTGCGTGCACACCCACCG-BHQ1-3'。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩腎細(xì)胞原代培養(yǎng)

在倒置相差顯微鏡下觀察, 經(jīng)原代培養(yǎng)2～3 d可見樹鼩腎組織塊附近有細(xì)胞遷出，5 d左右可見密集的單層貼壁細(xì)胞(圖1), 細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，排列緊湊，與Vero細(xì)胞相似，貼壁呈鋪路石狀。

2.2 樹鼩腎細(xì)胞傳代培養(yǎng)

樹鼩原代腎細(xì)胞37 ℃培養(yǎng)5 d左右基本可以鋪滿瓶底，可用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化進(jìn)行細(xì)胞的第一次傳代。樹鼩原代腎細(xì)胞細(xì)胞可以連續(xù)進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)(圖2)，細(xì)胞能夠保持旺盛活力，2～3 d即可鋪滿瓶底，細(xì)胞形態(tài)逐漸均一，緊密貼壁呈現(xiàn)出明顯的鋪路石狀。

2.3 樹鼩腎細(xì)胞免疫熒光鑒定

培養(yǎng)的樹鼩腎細(xì)胞用角蛋白18單抗進(jìn)行免疫熒光鑒定，普遍呈陽(yáng)性反應(yīng)(圖3)，陽(yáng)性比例達(dá)到95%以上，鑒定結(jié)果與Vero細(xì)胞一致，可以認(rèn)定為樹鼩腎上皮細(xì)胞。

2.4 EV71對(duì)樹鼩腎細(xì)胞的感染情況

圖 1 樹鼩原代腎細(xì)胞形態(tài)Figure 1 Morphology of primary kidney cells in tree shrews

圖 2 樹鼩腎細(xì)胞傳代培養(yǎng)形態(tài)Figure 2 Subculture morphology of tree shrews kidney cells

圖 3 樹鼩腎細(xì)胞免疫熒光鑒定Figure 3 Immunofluorescence identification of kidney cells in tree shrews

圖 4 EV71感染樹鼩第3代腎細(xì)胞Figure 4 The third generation kidney cells of tree shrew infected with EV71

圖 5 EV71感染Vero細(xì)胞Figure 5 Vero cells infected with EV71

圖 6 EV71感染樹鼩腎細(xì)胞的免疫熒光觀察Figure 6 Immunofluorescence observation on kidney cells of tree shrew infected with EV71

分別采用10 TCID50、100 TCID50、1 000 TCID50三個(gè)劑量的EV71病毒感染第3代樹鼩腎細(xì)胞，定期在倒置顯微鏡下觀察病變情況。結(jié)果顯示，接種EV71病毒12 h后，100 TCID50和1 000 TCID50兩個(gè)劑量組的樹鼩腎細(xì)胞單層開始由緊密變得稀疏,少量細(xì)胞變圓，脫落, 其中病變情況以1 000 TCID50劑量組較為明顯; 接種病毒24 h后，可見明顯細(xì)胞變圓、漂浮和脫落，細(xì)胞單層逐步解體; 接種病毒48 h后，細(xì)胞絕大部分都已病變、解體，基本觀察不到完整的細(xì)胞形態(tài)。10 TCID50劑量組在接種后的48 h才開始出現(xiàn)少量的細(xì)胞變圓脫落，整個(gè)感染進(jìn)程相對(duì)緩慢。以100 TCID50感染劑量組來做比較，樹鼩第3代腎細(xì)胞病變情況與進(jìn)度(圖4)與Vero細(xì)胞(圖5)大致相似。

通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)可以觀察到EV71病毒蛋白在樹鼩腎細(xì)胞上的表達(dá)情況(圖6), 接種病毒6 h開始有少量病毒蛋白出現(xiàn), 12 h后可以觀察到病毒蛋白增多,分布在細(xì)胞質(zhì)中靠近細(xì)胞核的部位, 24 h即可觀察到更為密集的病毒蛋白, 48 h病毒蛋白遍布整個(gè)視野,病毒在樹鼩腎細(xì)胞上的增殖趨勢(shì)與Vero細(xì)胞一致。

2.5 病毒增殖曲線

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法連續(xù)檢測(cè)EV71病毒RNA在樹鼩腎細(xì)胞上的復(fù)制情況，從病毒增殖曲線(圖7)可以看出EV71在剛接種的12 h內(nèi)增殖緩慢，而在隨后的24 h內(nèi)快速?gòu)?fù)制，在接種48 h前后達(dá)到峰值，病毒載量最高可達(dá)105拷貝/mL以上。EV71在樹鼩腎細(xì)胞上的增殖情況稍弱于Vero細(xì)胞，但兩者大致趨勢(shì)相似。

圖 7 EV71感染樹鼩腎細(xì)胞的增殖曲線Figure 7 Proliferation curve of EV71 in kidney cells of tree shrew

3 討論

樹鼩作為一種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物, 由于能夠成功復(fù)制多種人類疾病, 越來越受到科研人員重視。但由于樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化程度不高、個(gè)體間差異較大等因素,其疾病模型的可重復(fù)性和穩(wěn)定性均存在問題, 在一定程度上影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定。相對(duì)而言, 細(xì)胞感染模型能較好地避免或減少個(gè)體差異的干擾，可以對(duì)體內(nèi)感染模型起到補(bǔ)充驗(yàn)證作用, 而且在細(xì)胞水平上可以很方便地開展病毒感染規(guī)律與入侵機(jī)制的研究, 還能為藥物篩選等研究提供體外實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。許多研究證實(shí)[5,6]樹鼩可感染人乙型肝炎病毒(HBV), 而其感染機(jī)制的突破則更多是借助細(xì)胞平臺(tái)實(shí)現(xiàn)的, 比如HBV關(guān)鍵受體牛黃膽酸鈉共轉(zhuǎn)移多肽(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP)就是在樹鼩原代肝細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的[7], 另有體外實(shí)驗(yàn)證明[8], Kupffer細(xì)胞中Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR2) 和TLR4與HBV慢性化感染進(jìn)程相關(guān)。

此前有研究證實(shí)[2]，EV71可感染幼齡中緬樹鼩，使之表現(xiàn)出與人手足口病相似的癥狀。本研究在此基礎(chǔ)上，嘗試建立EV71感染樹鼩腎細(xì)胞的體外模型，進(jìn)行樹鼩腎細(xì)胞的分離培養(yǎng)是其關(guān)鍵的第一步。目前常用的腎細(xì)胞分離方法有組織塊貼壁培養(yǎng)法、膠原酶、胰蛋白酶以及兩者的組合消化法和聯(lián)合EDTA結(jié)合法等[9,10]。本實(shí)驗(yàn)初步證明，采用組織塊貼壁法即可快速制備成年樹鼩的原代腎細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明，該細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)條件的要求并不高，使用常規(guī)的含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基即可。由于采用了比較簡(jiǎn)單的組織塊貼壁法，使得樹鼩原代腎細(xì)胞成分較為復(fù)雜，但可以利用不同細(xì)胞貼壁能力的差異，通過胰酶的分步消化進(jìn)行簡(jiǎn)單純化。初步純化后的樹鼩腎細(xì)胞與Vero細(xì)胞形態(tài)十分相似，主要為梭形，傳代培養(yǎng)2 d左右即可形成緊密的單層, 表現(xiàn)出典型的鋪路石狀。通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)可以看到，本實(shí)驗(yàn)所分離培養(yǎng)的樹鼩腎細(xì)胞普遍表現(xiàn)出角蛋白18陽(yáng)性,可以認(rèn)定為腎上皮細(xì)胞。樹鼩腎細(xì)胞可以進(jìn)行多次傳代，傳代3次后的細(xì)胞仍能保持均一的細(xì)胞形態(tài)和旺盛的細(xì)胞活力，這就為后續(xù)的病毒感染實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

以100 TCID50的EV71病毒感染樹鼩腎細(xì)胞，2 d左右可在顯微鏡下觀察到明顯的細(xì)胞變圓、脫落和解體等病變，間接免疫熒光觀察可見病毒蛋白在樹鼩腎細(xì)胞中的表達(dá)情況，病毒載量最高可達(dá)105拷貝/mL以上，其細(xì)胞病變情況和病毒感染進(jìn)程與Vero細(xì)胞大致相似，這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明EV71可以感染樹鼩腎細(xì)胞，也意味著建立EV71感染樹鼩腎細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪强尚械摹＞C合細(xì)胞病變情況和病毒載量增殖趨勢(shì)，在接種EV71病毒后的12 h內(nèi)，細(xì)胞尚未明顯的病變，病毒載量也保持較低水平，表明病毒接種后有一個(gè)適應(yīng)期，而在這個(gè)階段病毒如何入侵樹鼩腎細(xì)胞、結(jié)合了哪些關(guān)鍵受體，這些科學(xué)問題或?qū)⒖梢砸揽看思?xì)胞感染模型得以深入探討。

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Study on Infectivity of EV71 in Kidney Cells of Tree Shrew

WANG Wen-guang, KUANG De-xuan, YIN Bo-wen, LU Cai-xia, HAN Yuan-yuan, LI Na, TONG Pin-fen, SUN Xiao-mei, CAI Lu-kui, DAI Jie-jie
(Center of Tree Shrew Germplasm Resources, Institute of Medical Biology, the Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infectious Diseases, Yunnan Innovation Team of Standardization and Application Research in Tree Shrew, Kunming 650118 China)

ObjectiveTo investigate enterovirus 71 (EV71) infection characters on the tree shrew kidney cells.MethodsThe primary kidney cells from tree shrew were isolated by tissue culture. The cell was passaged and morphology was observed regularly. The indirect immunofluorescence identification was performed by using keratin 18. Tree shrew kidney cells were infected with EV71, cell lesions were observed by inverted microscope, viral load was detected by real-time PCR. Vero cells were used as control.ResultsTree shrew primary kidney cells can be rapidly prepared by tissue culture and can be passaged easily. The kidney cells are mainly spindle-shaped and show paving - stones structure after adherent. They were identified as kidney epithelial cell by immunofluorescence assay. Tree shrew kidney cells can be infect with EV71 and showed significant cytopathic effect (CPE) such as rounding, falling off and lysis. The viral protein was observed by immunofluorescence. Viral load of was up to 105copies/mL. The CPE and proliferation trends were similar to that of Vero cell.ConclusionEV71 can infect tree shrew kidney cells under in vitro condition, and the cell assay can provide a platform for drug screening and infection mechanism research of EV71.

Tree shrew; Kidney cells; Enterovirus 71

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0123-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.008

2016-12-05

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAI01B01); 云南省聯(lián)合支持國(guó)家計(jì)劃項(xiàng)目(2015GA009)

王文廣(1985-), 男, 助理研究員, 碩士, 研究方向: 人類疾病動(dòng)物模型。E-mail: windgoon@foxmail.com

代解杰(1961-), 男, 研究員, 博士生導(dǎo)師。E-mail: djj@imbcams.com.cn